检测肌钙蛋白I的试剂盒及其制备和使用方法

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检测肌钙蛋白I的试剂盒及其制备和使用方法\n技术领域\n[0001] 本发明涉及一种蛋白检测方法及试剂盒，具体涉及检测检测肌钙蛋白I的试剂盒及其制备方法，还涉及用该试剂盒检测肌钙蛋白I的方法。\n背景技术\n[0002] 心肌损伤标志物是指在循环血液中可测出的生物化学物质并能够敏感、特异地反映心肌损伤(异常)及其严重程度的标志物，因而其可以用于心肌损伤(异常)的筛查、诊断、评定预后和随访治疗效果。在正常情况下，心肌损伤标志物主要或仅存在于心脏(心肌)，在心脏或心血管异常情况下由心脏大量释放。心脏标志物主要包括肌红蛋白、肌钙蛋白(cTn I和cTn T)、肌酸激酶同功酶(CK-MB)等。其中cTn I和cTn T被美国和欧洲心脏病协会一致评为诊断急性心肌梗塞的高特异性和高敏感性的确诊标志物。在心肌细胞损伤早期，游离于胞浆内的cTn I和cTn T快速释放出来，在血清/血浆中，3-6h升高，8-14h达到高峰，1-2周降至正常。因而对于早期cTn I/cTn T的检测有助于为患者的治疗赢得宝贵时间，并且对发病后较晚就诊的病人也有很大意义。近年来，研究表明，当骨骼肌损伤和肾功能衰弱时也会有cTn T的显著升高，而cTn I则不会，因而cTn I更适宜于作为心肌梗塞的诊断标志物，特异性更强。\n[0003] 当前检测cTn I的常用方法主要有酶联免疫吸附测定(ELISA)、化学发光法、胶体金免疫层析(GICA)等。酶联免疫吸附测定的检测灵敏度较高，但操作过程相对比较复杂，检测所需时间较长；需要专门的仪器设备如酶标仪来配合使用，操作人员需要经过专业培训；检测所需费用较高，不能实现单人份检测。化学发光法精密度和灵敏度好，但需要专用设备，且仪器与试剂价格均较为昂贵，不适宜于小型医院及医疗点。胶体金免疫层析操作简单，检测所需时间短，不需要专业技术人员操作，检测费用低，但该法只能实现定性或半定量检测，检测灵敏度较低，不能检测到超低浓度下的肌钙蛋白I。\n发明内容\n[0004] 针对现有技术在推广使用中的局限性，本发明提供一种采用便携式荧光检测仪便可实现定量检测的高灵敏检测试剂盒，其使用简单、检测速度快、成本低，可用于床边诊断。\n[0005] 本发明的检测肌钙蛋白I的试剂盒包括底板，从所述底板上的一端至另一端设置有依次连接的样品垫、交联物垫、连结垫、硝酸纤维素膜、吸水纸，交联物垫包被了荧光二氧化硅纳米颗粒-抗肌钙蛋白I单克隆抗体的交联物，所述硝酸纤维素膜设置有检测条带和质控条带，所述检测条带设置于靠近连结垫的一侧并含有抗肌钙蛋白I单克隆抗体，所述质控条带设置于远离连结垫的一侧并含有羊抗鼠IgG。\n[0006] 优选地，所述样品垫、交联物垫、连结垫、硝酸纤维素膜、吸水纸分别在各自连接处相互重叠。\n[0007] 优选地，所述交联物垫覆盖在所述样品垫与连结垫上。\n[0008] 优选地，所述样品垫与连结垫对接在一起，所述交联物垫覆盖在所述样品垫与连结垫上。\n[0009] 本发明还提供所述试剂盒的制备方法，包括如下步骤：\n[0010] (1)制备二氧化硅纳米颗粒：用含有环己烷、正己醇、Triton X-100的油包水微乳体系制备二氧化硅纳米颗粒；\n[0011] (2)制备荧光二氧化硅纳米颗粒：用3-氨丙基三甲氧基硅烷将所述二氧化硅纳米颗粒表面氨基化，再通过共价交联的方式在其表面交联上稀土荧光螯合物；\n[0012] (3)制备荧光二氧化硅纳米颗粒-抗肌钙蛋白I单克隆抗体交联物：用高碘酸钠将标记用抗肌钙蛋白I单克隆抗体氧化，再将所述抗体与表面氨基化的荧光二氧化硅纳米颗粒混匀，发生共价反应而形成荧光二氧化硅纳米颗粒-抗肌钙蛋白I单克隆抗体交联物；\n[0013] (4)制备交联物垫：将所述荧光二氧化硅纳米颗粒-抗肌钙蛋白I单克隆抗体交联物包被于玻璃纤维上制成交联物垫；\n[0014] (5)制备硝酸纤维素膜：用喷膜仪分别将抗肌钙蛋白I单克隆抗体和羊抗鼠IgG设置且包被于硝酸纤维素膜的检测条带和控制条带上，37℃下充分干燥。\n[0015] (6)依次将样品垫、交联物垫、连结垫、硝酸纤维素膜和吸水纸相互连接地粘贴至聚氯乙烯底板上。\n[0016] 优选地，在所述步骤(1)中，将比例为3∶1∶1的环己烷、Triton X-100、正己醇混匀，在搅拌下依次加入超纯水、氨水和四乙基原硅酸盐，搅拌24h，用丙酮封闭，采用无水乙醇和超纯水洗涤，即制得二氧化硅纳米颗粒；\n[0017] 在所述步骤(2)中，将步骤(1)所得的二氧化硅纳米颗粒采用3-氨丙基三甲氧基硅烷进行氨基化，用无水乙醇洗涤后再加入BHHCT反应2h，用无水乙醇洗涤后悬浮于\n50mmol/L、pH值为7.8的Tris，加入EuCl3使其螯合于颗粒表面的BHHCT上，再经无水乙醇洗涤即获得荧光二氧化硅纳米颗粒；\n[0018] 在所述步骤(3)中，采用高碘酸钠将标记用抗肌钙蛋白I单克隆抗体糖链分子的羟基氧化为醛基，再将该抗体与表面氨基化的所述荧光二氧化硅纳米颗粒混匀，发生共价反应而形成荧光二氧化硅纳米颗粒-抗肌钙蛋白I单克隆抗体交联物。\n[0019] 优选地，在所述步骤(4)和(5)中，将所述荧光二氧化硅纳米颗粒-抗肌钙蛋白I单克隆抗体交联物喷洒于玻璃纤维上后，用冻干机冷冻干燥后作为交联物垫；用Biodot点膜仪将包被用抗肌钙蛋白I单克隆抗体和羊抗鼠IgG喷至硝酸纤维素膜的检测条带和控制条带上，充分干燥。\n[0020] 优选地，进一步将所述聚氯乙烯底板分切成单人份试纸条，将单人份试纸条装入配套的试剂盒条卡内，将试剂盒条卡和干燥剂放入铝箔袋内，封口，最终获得检测肌钙蛋白I的荧光二氧化硅纳米颗粒试剂盒。\n[0021] 本发明还提供一种采用所述的试剂盒测定肌钙蛋白I的方法，包括以下步骤：\n[0022] (1)将样品滴加至所述样品垫上并滴加稀释液；\n[0023] (2)所述样品中的肌钙蛋白I经过所述交联物垫的过程中与荧光二氧化硅纳米颗粒-抗肌钙蛋白I单克隆抗体特异性结合形成复合物；\n[0024] (3)所述复合物在经过所述硝酸纤维素膜的过程中依次与相对于所述复合物不足量的抗肌钙蛋白I单克隆抗体和羊抗鼠IgG异性结合；\n[0025] (4)用荧光检测仪测量荧光值；\n[0026] (5)如果质控条带的荧光值大于预设值，则表明检测结果有效；如果质控条带的荧光值小于预设值，则表明样品失效或者实验操作有误，检测结果无效；\n[0027] (6)如果检测条带和质控条带的荧光值均大于所述预设值，表明样品中存在肌钙蛋白I，为阳性；如果检测条带的荧光值小于所述预设值，质控条带的荧光值大于预设值，表明样品中不存在肌钙蛋白I，为阴性。\n[0028] 本发明还提供另一种采用所述的试剂盒测定肌钙蛋白I的方法，包括以下步骤：\n[0029] (1)将样品滴加至所述样品垫上并滴加稀释液；\n[0030] (2)所述样品中的肌钙蛋白I经过所述交联物垫的过程中与荧光二氧化硅纳米颗粒-抗肌钙蛋白I单克隆抗体特异性结合形成复合物；\n[0031] (3)所述复合物在经过所述硝酸纤维素膜的过程中依次与相对于所述复合物不足量的抗肌钙蛋白I单克隆抗体和羊抗鼠IgG异性结合；\n[0032] (4)用紫外灯采集荧光图像；\n[0033] (5)如果质控条带出现荧光，则表明检测结果有效；如果质控条带未出现荧光，则表明样品失效或者实验操作有误，检测结果无效；\n[0034] (6)如果检测条带和质控条带均质控条带，表明样品中存在肌钙蛋白I，为阳性；\n如果检测条带未出现荧光而质控条带出现荧光，表明样品中不存在肌钙蛋白I，为阴性。\n[0035] 本发明的有益效果如下。\n[0036] 该试剂盒价格低廉，制备过程简单，检测速度快，15分钟即可判断结果。采用便携式荧光检测仪，可实现目标分析物的精确定量。其操作方便，可进行现场检测，且操作人员不需经过培训；灵敏度高，特异性好，结果准确，方便推广使用。\n[0037] 该试剂盒中的连结垫起到缓冲作用。使已包被(尤其是冻干)于交联物垫上的纳米颗粒标记物充分溶解、释放，否则会有部分残留而致检测信号减弱。\n附图说明\n[0038] 图1为本发明的试剂盒的结构示意图。其中，1、底板；2、样品垫；3、交联物垫；4、连结垫；5、硝酸纤维素膜；6、吸水纸；7、检测条带；8、质控条带。\n[0039] 图2为用本发明的试剂盒检测肌钙蛋白I的结果示意图。其中图2A为紫外光下荧光拍摄结果，图2B为荧光检测仪检测后所作定量分析曲线图；其中上方的荧光线为检测条带，下方的荧光线为质控条带。\n具体实施方式\n[0040] 以下结合附图对本发明的具体实施方案进行说明。\n[0041] 在本发明的一个实施方案中，试剂盒包括底板，从所述底板上的一端至另一端设置有依次连接的样品垫、交联物垫、连结垫、硝酸纤维素膜、吸水纸。交联物垫包被了荧光二氧化硅纳米颗粒-抗肌钙蛋白I单克隆抗体的交联物，所述硝酸纤维素膜设置有检测条带和质控条带，所述检测条带设置于靠近连结垫的一侧并含有抗肌钙蛋白I单克隆抗体，所述质控条带设置于远离连结垫的一侧并含有羊抗鼠IgG。\n[0042] 在本发明的一个优选的实施方案中，参照附图1中，所述样品垫与连结垫对接在一起，所述交联物垫覆盖在所述样品垫与连结垫上。\n[0043] 在本发明的一个优选的实施方案中，按以下步骤制备试剂盒。(1)制备二氧化硅：\n将30mL环己烷、10mL Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)、10mL正己醇混匀，在磁力搅拌下依次加入适量的超纯水、氨水和四乙基原硅酸盐(TEOS)，搅拌24h后，丙酮封闭，采用无水乙醇和超纯水洗涤若干次，即可获得二氧化硅纳米颗粒混悬液。(2)制备荧光二氧化硅纳米颗粒：取上述1mL二氧化硅纳米颗粒混悬液采用3-氨丙基三甲氧基硅烷进行氨基化，用无水乙醇洗涤后再加入适量BHHCT(氯磺酰基-邻二苯基苯)反应2h，用无水乙醇洗涤后悬浮于50mmol/L Tris7.8，加入EuCl3(三氯化铕)使其螯合于颗粒表面的BHHCT上，再经无水乙醇洗涤即获得荧光二氧化硅纳米颗粒。(3)荧光二氧化硅纳米颗粒-抗肌钙蛋白I单克隆抗体交联物的制备：采用0.5mol/L高碘酸钠将0.4mg标记用抗肌钙蛋白I单克隆抗体糖链分子的羟基氧化为醛基，再将该抗体与2mg表面氨基化的荧光二氧化硅纳米颗粒混匀，发生共价反应而形成荧光二氧化硅纳米颗粒-抗肌钙蛋白I单克隆抗体交联物。(即，抗体的Fc端被氧化产生醛基，能够和荧光二氧化硅纳米颗粒表面的氨基交联，从而被定向固定到颗粒表面。)(4)将适量的荧光二氧化硅纳米颗粒-抗肌钙蛋白I单克隆抗体交联物喷洒于玻璃纤维上，于冻干机冷冻干燥后作为交联物垫，用Biodot点膜仪将包被用2mg/mL抗肌钙蛋白I单克隆抗体和2mg/mL羊抗鼠IgG喷至硝酸纤维素膜的检测条带和控制条带上，充分干燥。(5)将交联物垫、硝酸纤维素膜与未经处理的样品垫、连结垫、吸水纸粘贴至PVC底板上。(6)将上述粘贴好的PVC底板置于切条机上，分切成单人份试纸条。(7)将单人份试纸条装入配套的试剂盒条卡内。(8)将试剂盒条卡和干燥剂放入铝箔袋内，封口，常温保存。(9)测试待检的试纸条，考察其灵敏度、特异性和稳定性。最终获得检测肌钙蛋白I的荧光二氧化硅纳米颗粒试纸条成品。\n[0044] 在本发明的另一个优选的实施方式中，所述荧光二氧化硅纳米颗粒采用油包水微乳体系合成空白二氧化硅纳米颗粒后，再通过共价交联的方式在其表面上修饰稀土螯合物\n3+\n(如BHHCT-Eu )，在紫外灯下可观测到强烈荧光的稀土荧光纳米颗粒。\n[0045] 所述标记用抗肌钙蛋白I抗体购于美国Fitzgerald公司的单克隆抗体(批号M8010509)，所述捕获用(试纸条的检测线处固定抗肌钙蛋白I抗体，用于层析时捕获样品中的肌钙蛋白分子)抗肌钙蛋白I抗体指购于美国Fitzgerald公司的单克隆抗体(批号M8010521，M0110609，M0110510)，三者按2∶2∶1混匀后喷于硝酸纤维素膜作为检测条带。灵敏度实验中cTn I购于美国Fitzgerald公司的标准抗原(批号A01101802)。\n[0046] 采用本发明的试剂盒进行检测的方法及结果判断如下，参见附图2。从铝箔袋中取出检测试纸卡，平放于操作台上，将70微升待检样品加入加样孔中，再加入50微升缓冲液，15min后插入荧光检测仪测量荧光值。如果样品中有要检测的肌钙蛋白I存在，则检测条带处的荧光值会大于10，同时控制条带的荧光值也会大于10，此时结果为阳性；如果样品中没有要检测的肌钙蛋白I存在，则检测条带处的荧光值小于10，但控制条带处的荧光值大于10，此时结果为阴性；如果控制条带处荧光值小于10，则产品无效。\n[0047] 在本发明的检测方法的另一个实施方式中，采用紫外光下荧光成像的方式判断结果。可将试纸条放置紫外灯下，采用带有滤光片的数码相机采集荧光图像。荧光图像上，若检测条带与控制条带均有荧光条带，则结果为阳性；若仅控制带出现荧光条带，则结果为阴性；若检测条带与控制条带均未出现荧光条带，则产品无效。\n[0048] 所述紫外光下荧光成像是在中心波长为312nm和360nm的紫外灯下，采用镜头带有滤光片(滤光范围584-664nm)的数码相机所进行的荧光拍摄。\n[0049] 所述荧光检测仪的激发波长为365nm，发射波长为625nm的可对试剂盒条卡进行荧光扫描的定量仪器。\n[0050] 在本发明的另一个制备试剂盒的实施方式中，向带有磁石的三角瓶于磁力搅拌下加入30mL环己烷、10mL Triton X-100、10mL正己醇，再依次于搅拌下加入500μL超纯水、\n60μL氨水和100μLTEOS，搅拌24h后加入等体积丙酮封闭反应，再用无水乙醇和超纯水洗涤若干次，最后悬浮至1mL无水乙醇中，得到乳白色浑浊液即为合成的粒径为80nm左右的二氧化硅纳米颗粒混悬液。再将此lmL二氧化硅纳米颗粒混悬液转移至带有磁石的圆底小瓶中，于磁力搅拌下加入3-氨丙基三甲氧基硅烷将二氧化硅纳米颗粒表面修饰上氨基官能团，反应过夜后用无水乙醇洗涤后再加入120μL BHHCT(4mg/mL)反应2h，经无水乙醇洗涤后再悬浮于50mmol/LTris7.8，加入30μL EuCl3(0.04mol/L)使其螯合于颗粒表面的BHHCT上，再用乙醇洗涤即获得荧光二氧化硅纳米颗粒。此后再将该荧光二氧化硅纳米颗粒微球进行氨基化从而进一步与抗体交联，使其具有生物活性。在与抗体交联时首先采用0.5mol/L高碘酸钠将0.4mg抗肌钙蛋白I单克隆抗体糖链分子的羟基氧化为醛基，再将该抗体与2mg上述表面氨基化的荧光二氧化硅纳米颗粒混匀，反应过夜，荧光二氧化硅纳米颗粒与抗体发生共价反应而形成荧光二氧化硅纳米颗粒-抗肌钙蛋白I单克隆抗体交联物。将该交联物均匀得喷洒在玻璃纤维上，每毫升喷洒16平方厘米，冷冻干燥后封入铝箔袋，室温下保存备用。\n[0051] 在硝酸纤维素膜上用机器划两条平行带，两条带间隔8mm，其中靠近玻璃纤维一端的条带喷上抗肌钙蛋白I单克隆抗体(用10mmol/L pH 7.4PBS稀释至2mg/mL)形成检测带；另一条带喷上羊抗鼠二抗形成控制带，37℃下烘干6h，封入铝箔袋于干燥环境下室温保存备用。\n[0052] 在单面塑料板上，先于中央贴好已平行包被抗体的硝酸纤维素膜(长30cm，宽\n2.5cm)，再依次贴上加样垫玻璃纤维(长30cm，宽1.4cm)、喷有荧光二氧化硅纳米颗粒抗体交联物的交联物垫玻璃纤维膜(长30cm，宽0.8cm)、连结垫玻璃纤维(长30cm，宽0.8cm)，最后贴上吸水纸(长30cm，宽3.4cm)，膜与膜之间均重叠0.2cm，以使其相互之间紧密相连，制成免疫层析试纸板。再用切条机将粘贴好的塑料板纵向切成4mm宽的免疫层析试纸条，装入纸条卡槽中，再封装入铝箔袋，室温下保存备用。\n[0053] 在本发明的另一个使用试剂盒检测的实施方式中，取出袋装封装的纸条卡，加入\n70μL血清样本于加样孔中，再加入50μL缓冲液(10mmol/L Tris-HCl 9.1，0.5％BSA，\n0.4％NaCl，0.25％，0.6％Triton-X 100)，仅需层析15min，然后将试纸卡插入荧光纸条检测仪进行荧光信号采集，实现定量分析。如果膜上检测带与控制带处的荧光读值都大于10，则说明为阳性结果，检测带的荧光读值越高则心肌标志物cTn I的含量越高；如果只有控制带处的荧光读值大于10，则说明待测样本中没有cTn I，为阴性结果。如果检测带与控制带处的荧光信号读值都小于10，说明检测无效。该检测方法的灵敏度为2ng/mL，批内与批间重复性较好。