利用植物油脂脱臭馏出物生产脂肪酶的雅致放射毛霉菌株

1.一株利用植物油脂脱臭馏出物生产脂肪酶的雅致放射毛霉菌株，其特征在于，该菌株属于真菌界，接合菌门，毛霉目，毛霉科，放射毛霉属，种名为：雅致放射毛霉gc-1，Actinomucor elegans；该菌株已于2017年7月31日提交广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC）进行保藏，地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏编号为：GDMCC No. 60214。
2.权利要求1所述利用植物油脂脱臭馏出物生产脂肪酶的雅致放射毛霉菌株在脂肪酶生产中的应用，其特征在于，该菌株以植物油脂脱臭馏出物为发酵原料，用于发酵制备脂肪酶。
3.如权利要求2所述利用植物油脂脱臭馏出物生产脂肪酶的雅致放射毛霉菌株在脂肪酶生产中的应用，其特征在于，用于制备脂肪酶时，产酶培养基包括下列各组分：植物油脂脱臭馏出物40 60g/mL，酵母膏1 3g/mL；培养条件为：25 30℃、120 180 rpm摇床培养。
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4.如权利要求3所述利用植物油脂脱臭馏出物生产脂肪酶的雅致放射毛霉菌株在脂肪酶生产中的应用，其特征在于，产酶培养基包括下列各组分：植物油脂脱臭馏出物50g/mL，酵母膏2g/mL；培养条件为：28℃、150rpm条件下摇床培养。

利用植物油脂脱臭馏出物生产脂肪酶的雅致放射毛霉菌株\n技术领域\n[0001] 本发明属于生物发酵工程技术领域，具体涉及一株利用植物油脂脱臭馏出物生产脂肪酶的雅致放射毛霉菌株专利申请事宜。\n背景技术\n[0002] 脱臭馏出物是在植物油脂脱臭过程或物理精炼过程中水蒸气蒸馏时收集到的副产物，这种物质有类似于酸渣的外观及稠度，所以常归于浮渣油，主要是生育酚、甾醇、甾醇酯、脂肪酸甘油酯、碳水化合物和其他杂质的复杂的脂肪酸混合物，其各组分的含量因植物油脂的种类、生产工艺的不同而有较大的差异。目前，国内的植物油脱臭馏出物很多被生产厂家作为废料进行处理，不仅造成了原材料的巨大浪费，也造成了环境污染，因此对植物油脂脱臭馏出物加以综合利用，具有十分重要的经济和环境意义。\n[0003] 从植物油脂脱臭馏出物中提取维生素E和植物甾醇，是对其进行利用的方法之一，也有很多利用植物油脂脱臭馏出物提取维生素E或者植物甾醇的研究和报道。但现有技术也存在一些不足之处，主要原因是：其一，甾醇、维生素E和游离的脂肪酸、甘油酯结合在一起，并且都是脂溶性化合物，他们之间的理化性质差别不大，因此从中分离甾醇和维生素E很困难，这无疑增加了提取的难度和成本；其二，作为副产品，脱臭馏出物中的甾醇和维生素E的含量实际上是很少的，而且不同植物油脂的脱臭馏出物的组成不同，其维生素E和甾醇的含量也不同，比如，米糠油和棉籽油的脱臭馏出物中，甾醇的平均含量仅为1 4%左右，~\n有些植物油脱臭馏出物甚至几乎不含甾醇和维生素E，这让有些脱臭馏出物根本没有提取的价值，从而作为废弃物直接处理掉；其三，甾醇和维生素E 的提取纯化采用真空蒸馏、分子蒸馏、溶剂提取、超临界萃取等方法，这些方法或工艺复杂，投资大，或需要昂贵的设备，生产成本高，或需要消耗有毒易燃的有机试剂，不仅不利于身体健康，且造成环境污染。由于以上技术原因，使得脱臭馏出物的实际利用率是较低的。\n[0004] 对植物油脂脱臭馏出物成分的分析表明，其主要成分是甘油酯和脂肪酸。研究表明，自然界中是存在一些微生物是能够直接代谢利用其中的脂肪酸的，也能利用甘油酯作为营养，通过产生脂肪酶、酯酶，将其降解为甘油和脂肪酸，再通过微生物的新陈代谢被微生物吸收利用。因此理论而言，是可以将植物油脱臭馏出物作为微生物发酵的重要原材料加以利用的。\n[0005] 脂肪酶（Lipase，甘油酯水解酶）是一类具有多种催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应，除此之外还表现出其他一些酶的活性，如磷脂酶、溶血磷脂酶、胆固醇酯酶、酰肽水解酶活性等。脂肪酶在动植物、微生物中均广泛存在，尤其细菌、真菌和酵母中的脂肪酶含量更为丰富。由于微生物生长旺、繁殖快、种类多、适应性强，易变异，他们分泌的脂肪酶具有比动植物更广的作用pH、作用温度范围，高稳定性和活性，且微生物来源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，适合于工业化大生产和获得高纯度样品，因此微生物脂肪酶是工业用脂肪酶的重要来源，广泛应用于油脂加工、食品、医药、日化等工业。\n[0006] 不同来源的脂肪酶具有不同的催化特点和催化活力。其中用于有机相合成的具有转酯化或酯化功能的脂肪酶的规模化生产对于酶催化合成精细化学品和手性化合物有重要意义。目前主要的发酵微生物有黑曲霉，假丝酵母等。\n[0007] 由于脂肪酶在实际生产应用的巨大价值，因而对于与脂肪酶生产相关菌株加强筛选及相关生产过程加强研究，对于相关产业的促进是具有十分重要的生产应用价值的。\n发明内容\n[0008] 本申请主要目的是提供一株能够有效利用植物油脂脱臭馏出物生产脂肪酶的雅致放射毛霉菌株，从而为相关产业的改进奠定基础。\n[0009] 本申请所采取的技术方案详述如下。\n[0010] 一株利用植物油脂脱臭馏出物生产脂肪酶的雅致放射毛霉菌株，该菌株属于真菌界，接合菌门，毛霉目，毛霉科，放射毛霉属，种名为：雅致放射毛霉gc-1（Actinomucor elegans）；菌落表面颜色为白色，背面颜色黄色，孢子颜色白或黄，菌落气生菌丝茂盛；该菌株已于2017年7月31日提交广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC）（地址为：广州市先烈中路\n100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所）进行保藏，保藏编号为：GDMCC No. 60214；2017年8月7检测为存活。\n[0011] 所述利用植物油脂脱臭馏出物生产脂肪酶的雅致放射毛霉菌株在脂肪酶生产中的应用，该菌株以植物油脂脱臭馏出物为发酵原料，用于发酵制备脂肪酶；具体而言，用于制备脂肪酶时，产酶培养基包括下列各组分（/mL）：植物油脂脱臭馏出物40 60g，酵母膏1~ ~\n3g（优选配方为：植物油脂脱臭馏出物50g，酵母膏2g）；培养条件为：25 30℃、120 180 rpm~ ~\n摇床培养（优选培养条件为：28℃、150rpm条件下摇床培养）。\n[0012] 一种发酵制备脂肪酶的生产方法，该方法以植物油脂脱臭馏出物为发酵原料，以雅致放射毛霉gc-1（Actinomucor elegans）（保藏编号为：GDMCC No. 60214）为发酵菌株，用于制备脂肪酶时，产酶培养基包括下列各组分（/mL）：植物油脂脱臭馏出物40 60g，酵母~\n膏1 3g（优选配方为：植物油脂脱臭馏出物50g，酵母膏2g）；培养条件为：25 30℃、120 180 ~ ~ ~\nrpm摇床培养（优选培养条件为：28℃、150rpm条件下摇床培养）。\n[0013] 植物油脂脱臭馏出物作为植物油脂精炼的下脚料，现有技术中对其利用方法较为有限，例如授权号为CN 102352400 B 的中国专利，其公开了一种利用微生物发酵植物油脂脱臭馏出物生产植物甾醇的方法，但研究该方法后，发明人发现，含量很少的植物甾醇在发酵中期就会被吸收利用，从而影响了对于植物油脂脱臭馏出物的开发利用效果。为较好解决植物油脂脱臭馏出物的开发利用问题，因而极有必要开发新的生产利用途径。\n[0014] 本申请的主要创新性体现在如下几个方面：\n[0015] 1、利用微生物发酵制取脂肪酶，本发明对于植物油脱臭馏出物提供了一种新的开发利用方法，可为植物油脱臭馏出物的高效处理开辟新的途径；\n[0016] 2、本发明为脂肪酶生产菌株的筛选提供了新的思路，现有技术中，在筛选脂肪酶高产菌时，培养基中的油脂几乎都采用橄榄油，个别采用其它植物油，而本申请以植物油脂脱臭馏出物作为发酵物料和唯一碳源的营养来源属于首创，为高效脂肪酶菌株筛选、同时也为其他菌株筛选提供了新的借鉴；\n[0017] 3、本发明提供了一株高效利用植物油脱臭馏出物的微生物菌株，为脂肪酶的产业化生产奠定了一定的生物菌株基础，具有较好的应用价值。\n[0018] 总之，本申请提供了一株能够以植物油脱臭馏出物为唯一碳源的菌株，而利用该菌株，可较好以植物油脂脱臭馏出物作为原料进行发酵生产脂肪酶，最高酶活可达10.89 U/mL，表现出较好地应用前景。由于脂肪酶制备过程中相关原料价格廉价、生产工艺简便，无环境污染，经济效益显著，因而表现出较好的经济价值和推广应用意义。\n附图说明\n[0019] 图1为雅致放射毛霉菌落；\n[0020] 图2为雅致放射毛霉在产酶培养液中的生长。\n具体实施方式\n[0021] 下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例中涉及部分实验材料等背景情况简要介绍说明如下。\n[0022] 实验原料：\n[0023] 实施例中所采用植物油脂脱臭馏出物为大豆油脱臭馏出物，购自阳光油脂有限公司（河南省郑州市荥阳），主要含有甘油酯，脂肪酸，甾醇，生育酚，磷脂等成分；另外，查阅资料后，不同植物油脂脱臭馏出物中代表成分含量（%）列表如下：\n[0024] 。\n[0025] 实施例1\n[0026] 本实施例就雅致放射毛霉（Actinomucor elegans，保藏号：GDMCC No. 60214）的筛选获得过程简要介绍如下。\n[0027] （1）菌种富集：\n[0028] 将在粮油有限公司（或者说油脂厂）附近采集的筛选源样品添加到高温灭菌后的富集培养基中，在25℃、恒温培养箱培养96 h，得到富集混合菌系。\n[0029] 所述富集培养基成分组成如下（/mL）：棉籽油油脂脱臭馏出物20 g，酵母浸膏5 g，氯化钠5 g，磷酸二氢钾2g，琼脂18 g。\n[0030] （2）选择性培养\n[0031] 将步骤（1）中的混合菌进行系利梯度稀释后，接种到以植物油脂脱臭馏出物为唯一碳源的选择性平板培养基上（选择培养基），在25℃、恒温培养箱培养96 h，筛选能够利用植物油脂脱臭馏出物的微生物菌株。\n[0032] 所述选择培养基成分如下（/mL）：棉籽油脱臭馏出物30 g，硝酸钠5g，琼脂18 g。\n[0033] （3）菌种分离纯化：\n[0034] 将步骤（2）筛选获得的菌株在PDA培养基上在25℃的恒温培养箱培养，并进行分离纯化培养，获得纯的单菌株。\n[0035] 脂肪酶高产菌株的驯化：\n[0036] 将步骤（3）中获得的纯化单菌株接种到脱臭馏出物浓度逐渐升高的驯化培养基中，在25℃下进行驯化培养96 h，提高菌株的降解产酶能力。\n[0037] 所述驯化培养基成分如下（/mL）：棉籽油脱臭馏出物30 g，硝酸钠5g，琼脂18 g g。\n培养条件如下：25℃、恒温培养箱培养96 h。\n[0038] 筛选高产菌株：\n[0039] 将步骤（4）中驯化后的纯化菌株在优化的产酶培养基中培养后，在10000rpm、\n10min的条件下进行离心，收集含脂肪酶的上清液，测定脂肪酶的酶活，并以此判断不同菌株的产酶能力，获得脂肪酶高产目标菌株（培养过程如图2所示）。\n[0040] 需要解释说明的是，筛选时技术原理为：在液体培养中，脱臭馏出物会和培养液中的水产生分层，由于该菌种能够产生脂肪酶，而脂肪酶具有油-水界面的亲和力，能在油-水界面上高速率的催化水解甘油三酯，随着雅致毛霉对甘油三酯和脂肪酸的消耗利用，分层现象逐渐消失。\n[0041] 所述优化的产酶培养基，包括下列各组分（/mL）：植物油脂脱臭馏出物50g，酵母膏\n2 g。培养条件如下：28℃、150rpm条件下在摇床中培养120 h。\n[0042] 对所获得脂肪酶高产菌株分别进行形态特征和核糖体18S rDNA序列测定，最终鉴定结果为：该菌株属于真菌界，接合菌门，毛霉目，毛霉科，放射毛霉属，命名为雅致放射毛霉gc-1（Actinomucor elegans），该菌菌落表面颜色为白色，背面颜色黄色，孢子颜色白或黄，菌落气生菌丝茂盛（图1）；该菌株已于2017年7月31日提交广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC）（地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所）进行保藏，保藏编号为：GDMCC No. 60214；2017年8月7检测为存活。\n[0043] 实施例2\n[0044] 利用实施例1中筛选所得雅致放射毛霉gc-1（Actinomucor elegans）菌株，在产酶培养基进行培养，对其生产性能进行具体测定；\n[0045] 所述产酶培养基，包括下列各组分（/mL）：植物油脂脱臭馏出物50g，酵母膏2 g。培养条件如下：28℃、150rpm条件下在摇床中培养120 h。\n[0046] 脂肪酶的酶活测定采用滴定法，其技术原理为：脂肪酶隶属于羧基酯水解酶类，在一定的温度、pH值范围内，能够逐步的将甘油三酯水解成甘油和脂肪酸，所释放的脂肪酸可用标准碱溶液进行中和滴定，用pH计或酚肽指示液指示反应终点，根据消耗的碘量计算其酶活力（反应式为RCOOH + NaOH → RCOONa + H2O）；\n[0047] 脂肪酶制剂的酶活力，按以下公式计算：\n[0048] X1 = (V1-V2 )*c*50*n/0.05*1/15；\n[0049] 式中：X1-----样品的酶活力，u/ml；\n[0050] V1----滴定样品时消耗氢氧化钠标准溶液的体积,单位为毫升（ml）；\n[0051] V2----滴定空白时消耗氢氧化钠标准溶液的体积,单位为毫升（ml）；\n[0052] c----氢氧化钠标准溶液浓度，单位为摩尔每升（mol/L）；\n[0053] 50---0.05mol/L氢氧化钠溶液1.00ml，相当于脂肪酸50umol；\n[0054] n----样品的稀释倍数；\n[0055] 0.05----氢氧化钠标准溶液浓度换算系数；\n[0056] 1/15----反应时间15min，以1min计。\n[0057] 本申请中酶活定义为：在40℃温度和pH 7.5条件下，1 mL液体酶，1 min水解底物产生1 umol的可滴定的脂肪酸，即为1个酶活力单位，U/ml表示。\n[0058] 具体测定发酵液中脂肪酶活，首先预备部分检测用试剂如下：\n[0059] 聚乙烯醇（PVA）：聚合度1750±50；\n[0060] 橄榄油；95 %（体积分数）乙醇；\n[0061] 底物溶液：称取聚乙烯醇（PVA）40 g（精确至0.1g），加水800 ml，在沸水浴中加热，搅拌，直至全部溶解，冷却后定容至1000 ml用干净的双层纱布过滤，取滤液备用；取上述滤液150 ml，加橄榄油50 ml，用高速匀浆机处理6 min（分两次处理，间隔5 min，每次处理3 min），即得乳白色PVA乳化液；该溶液现用现配；\n[0062] 磷酸缓冲溶液（pH=7.5）：分别称取磷酸二氢钠1.96 g和十二水磷酸氢二钠39.62 g，用水溶解并定容到500 ml；如需要，调节溶液的pH到7.5±0.05；\n[0063] 氢氧化钠标准溶液[(NaOH)=0.05mol/l]：按QB/T 601配置与标定，使用时，准确稀释10倍；\n[0064] 酚酞指示液（10g/l）：按QB/T603 配制。\n[0065] 脂肪酶活力测定步骤为：\n[0066] 取两个100ml三角瓶，分别于空白瓶（A）和样品瓶（B）中各加入底物溶液4.00ml和磷酸缓冲液5.00ml；\n[0067] 于A瓶中加入95%乙醇15.00 ml，于40℃±0.2℃水浴中预热5 min；\n[0068] 然后于A、B瓶中各加待测酶液1.00 ml，立即混匀计时，于40℃±0.2℃水浴中准确反应15 min，于B瓶中立即补加95%乙醇15.0 ml终止反应，取出；\n[0069] 于空白和样品溶液中各加酚肽指示液2滴，用0.05 mol/L氢氧化钠标准溶液滴定，直至微红色并保持30s不褪色为滴定终点，记录消耗0.05 mol/L氢氧化钠标准溶液的体积。\n[0070] 测定结果表明，筛选获得的高产脂肪酶菌株，其酶活力可达10.89 U/mL，表现出较好的应用前景。