一种基于特异抗体的硝基化修饰位点的检测方法及特异识别SCOT硝基化位点的抗体

1.一个单克隆抗体，其特征为由保藏号为CGMCC 4876的小鼠杂交瘤细胞系产生，能够特异识别第4位酪氨酸发生硝基化修饰的SCOT蛋白质。
2.权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于其免疫小鼠用的抗原是将具有序列表中SEQ ID No：1的氨基酸残基序列的多肽与载体蛋白偶联得到。
3.权利要求1所述的单克隆抗体，其用于检测SCOT第4位酪氨酸的硝基化修饰水平的变化。

一种基于特异抗体的硝基化修饰位点的检测方法及特异识\n别SCOT硝基化位点的抗体\n技术领域\n[0001] 本发明涉及一种检测蛋白质特异位点硝基化的方法，制备了特异识别SCOT硝基化位点的抗体及将其应用在生物疾病模型样本的检测中，属于生物工程领域。\n背景技术\n[0002] 酪氨酸硝基化是蛋白质翻译后修饰的一种形式，该修饰可能引起蛋白质功能的改变。现有对于蛋白质硝基化的分析主要采用3NT抗体法普适性识别硝基化蛋白质和质谱法特异性鉴定硝基化氨基酸残基。3NT是广泛识别硝基化酪氨酸的抗体，具有操作简单易行的特点，但对于某种特定的蛋白质或某个特定的硝基化位点，无法给出准确的定量测定结果。\n质谱固然能鉴定特异硝基化的蛋白质基团，然而其实验操作流程复杂，而且高度依赖昂贵的精密分析仪器，所以很难满足一般实验室和常规操作对硝基化蛋白质分析的需求。我们提出，在质谱精密分析硝基化位点的基础上，通过严格筛选识别特异硝基化位点的单克隆抗体，然后建立对特定硝基化蛋白质的免疫化学鉴定方法，就能够解决硝基化蛋白质的常规鉴定问题，实现对大规模样本的硝基化半定量分析。\n[0003] 线粒体蛋白琥珀酰辅酶A转移酶(SCOT)是酮体代谢的重要限速酶，催化CoA从琥珀酰CoA转移至乙酰乙酸。SCOT在肝脏以外的大多数组织中有表达。一般认为，SCOT功能异常可直接造成体液酮体增加(J.T.Tildon，M.Cornblath.Succinyl-CoA：3-Ketoacid CoA-Transferase Deficiency.J Clin Invest.51(1972)：493-498.)，从而引发多种疾病。\n所以对于控制和调节SCOT功能的分子机制的探讨，将为寻找组织特异性的药物治疗靶标，特别是为糖尿病、心肌病的预防及治疗提供理论基础。在糖尿病和衰老小鼠模型中，研究者报道SCOT的硝基化修饰增加并伴随酶活性的改变(C.Brégère，I.Rebrin，T.K.Gallaher.R.S Sohal.Effects of age and calorie restriction on tryptophannitration，protein content，and activity of succinyl-CoA：3-ketoacid CoA transferase in rat kidney mitochondria，Free Radical Biology&Medicine.48(2010)：609-618；\nS.M.Illarion V.Turko，and F Murad，Diabetes-associated nitration of tyrosine and inactivation of succinyl-CoA：3-oxoacid CoA-transferase，Am.J.Physiol.Heart.Circ.Physiol.281(2001)：2289-2295)。\n[0004] 我们采用细胞线粒体内高表达iNOS的细胞模型，引发SCOT的硝基化修饰，结果显示线粒体内高表达iNOS的细胞中，SCOT硝基化水平显著增加，并伴随它的催化活性的下降。我们还利用ONOO作为NO的供体，以大肠杆菌中表达的重组SCOT为修饰靶标，综合酶活性实验及质谱的方法进行鉴定，确定了SCOT发生硝基化修饰的位点，并进一步利用定点突变的技术，确定了硝基化修饰时对活性有关键影响的两个位点：分别是SCOT第4位和第\n76位的酪氨酸(Y.Wang，F.Peng，W.Tong，H.Sun，N.Xu，and S.Liu，The Nitrated Proteome in Heart Mitochondria of the db/db Mouse Model：Characterization of Nitrated Tyrosine Residues in SCOT，J.Proteome.Res.9(2009)：42544263)。虽然基于体外重组蛋白的质谱鉴定结果以及广泛识别硝基化酪氨酸的3NT抗体的研究方法可以使我们找到并确定了对活性有关键影响的硝基化位点，但依赖这些方法在动物模型或临床样本中进行检测时，即探测这两个位点在体内实验中是否发生相应的硝基化修饰，我们却遭遇到较大的困难。一方面是由于SCOT的表达丰度较低而且修饰蛋白质的量更低，另一方面则是由于线粒体制备可引发SCOT的丢失，造成硝基化信号降低。因此，发展一种高灵敏度和特异性，并且在实验操作上简易可行的方法是硝基化蛋白质分析领域一个迫切需要解决的问题。本发明以质谱对硝基化SCOT的分析为出发点，选择其中的一个硝基化位点，制备了特异识别SCOT第4位酪氨酸硝基化状态的单克隆抗体，并建立了对SCOT特定位点硝基化的免疫化学检测方法。采用该方法对小鼠糖尿病模型的组织线粒体SCOT进行了检测，实验表明，这个方法不仅验证了其他实验室的观察，而且进一步提供了相应硝基化位点的信息。\n发明内容\n[0005] 本发明的目的之一是提供一种简便地检测蛋白质特定位点硝基化修饰状态的方法。\n[0006] 本发明的目的之二是提供一种特异识别蛋白质特定位点硝基化抗体的制备方法。\n[0007] 本发明的目的之三是提供一种识别SCOT蛋白的第4位酪氨酸硝的抗体。\n[0008] 本发明的目的之四是提供利用该抗体在研究或临床应用中大规模检测SCOT蛋白第4位酪氨酸硝基化的方法。\n[0009] 本发明的具体技术方案：\n[0010] 利用特定酪氨酸位点硝基化修饰的肽段作为半抗原，将其与载体蛋白偶联后免疫小鼠。经细胞融合，并利用该位点修饰与未修饰的肽段以及其他位点修饰的肽段进行鉴别筛选，获得高效分泌特异识别第4位酪氨酸硝基化的SCOT抗体的杂交瘤细胞系。\n[0011] 利用该杂交瘤细胞系用小鼠进行腹水制备，Protein A/G柱亲和层析纯化腹水，获得鼠单克隆抗体。用ELISA技术测定该单克隆抗体的亚类和亲和常数。利用ELISA和免疫印记(Western Blot)实验显示抗体特异识别第4位酪氨酸硝基化的SCOT蛋白的能力。\n[0012] 利用该抗体对糖尿病动物模型心脏及肾脏蛋白质中SCOT进行检测分析，从而为糖尿病心脏、肾脏中SCOT活性的变化给出理论解释，并提供该病临床诊断及药物研发的靶标。\n[0013] 具体地，本发明涉及以下几个方面：\n[0014] 1、一种检测蛋白质特定位点修饰状态的方法，其特征在于利用特异识别特定位点修饰的抗体检测该位点的修饰状态。\n[0015] 2、上述技术方案描述的抗体制备方法，其特征在于利用载体偶联的硝基化的多肽作为免疫原，并利用该位点修饰与未修饰的肽段以及其他位点修饰的肽段进行鉴别筛选，获得针对特异位点硝基化的抗体。\n[0016] 3、上述技术方案制备的一个单克隆抗体，其特征为由保藏号为CGMCC 4876的小鼠杂交瘤细胞系(杂交瘤细胞株为：70524(CN：10)，保藏号为：CGMCCNO.4876，保藏日期为\n2011年05月19号。保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：\n北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)产生。\n[0017] 4、上述的单克隆抗体，其特征在于其免疫小鼠用的抗原是将具有序列表中SEQ ID No：1的氨基酸残基序列的多肽与载体蛋白偶联得到。\n[0018] 5、上述的单克隆抗体，其特征在于特异识别第4位酪氨酸硝基化的SCOT蛋白。\n[0019] 6、上述的单克隆抗体，其用于检测SCOT第4位酪氨酸的硝基化修饰水平的变化。\n[0020] 本发明的优点及有益效果：\n[0021] (1)本发明提供了利用特异识别特定位点硝基化的抗体对蛋白质特定位点硝基化状态进行检测的方法。该方法相比现有的对硝基化酪氨酸进行检测的3NT抗体具有特异性强的优点，能够直接指示SCOT的特定位点的硝基化修饰；与对具体位点进行硝基化鉴定的质谱相比，具有简便易行的可操作性。\n[0022] (2)本发明首次采用硝基化修饰的肽段作为抗原并利用免疫原、非硝基化修饰的同一肽段和硝基化修饰的其他肽段进行差异筛选，成功制备了特异识别特定位点硝基化的抗体。利用该方法可以制备特异识别其他位点硝基化的抗体。\n[0023] (3)本发明产生了特异识别第4位酪氨酸硝基化的SCOT的抗体一种。该抗体可以用来检测SCOT蛋白在第4位酪氨酸硝基化修饰的状态。\n附图说明\n[0024] 图1是ELISA检测抗体的滴度及特异性。抗体为CN-10：包被抗原分别为：\nBSA-CN-NO2(●)，BSA-CE-NO2(○)，BSA-CG-NO2 BSA-CL-NO2(△)，BSA(■)。\n[0025] 图2是Western blot检测抗体对硝基化SCOT的特异性。CCB staining(考马斯亮蓝染色)检测两个泳道上样量的一致性；抗体为CN-10；抗原分别是硝基化和非硝基化的SCOT。\n[0026] 图3是Western blot检测抗体对4种硝基化蛋白以别的特异性。CCB staining(考马斯亮蓝染色)检测每个泳道上样量的一致性；抗体分别为3NT，CN-10；抗原分别是SCOT，CG11963，HADHB，BSA。\n[0027] 图4是Western blot检测糖尿病小鼠模型中SCOT硝基化酪氨酸的变化情况。\nSDS-PAGE分离蛋白质分别为对照组及db/db糖尿病小鼠心脏、肾脏及肝脏的线粒体蛋白质。抗体分别为ATP synthase β，SCOT，CN-10。\n具体实施方式\n[0028] 下面结合图表和具体实施的方式对本发明做进一步阐述，以使本领域技术人员可以更清楚地得知本发明的技术方案，并非对本发明的限制。\n[0029] 实施例1.免疫抗原及筛选抗原的制备\n[0030] 一、合成含有硝基化修饰的SCOT关键位点的肽段及用于筛选的肽段[0031] 通过对SCOT蛋白第4位所在蛋白质序列的抗原性分析，确定了作为抗原的肽段。\n利用硝基化酪氨酸代替酪氨酸作为合成底物，使合成的肽段为硝基化修饰的状态，同时在其N末端加上半胱氨酸作为与载体蛋白连接的手臂，将肽段命名为CN-NO2。\n[0032] 为了后期筛选特异抗体，除了免疫用的多肽外，还合成了另外四种肽段，作为筛选时的参考肽段：分别是含SCOT的另外三个酪氨酸位点(第76位、第117位和第368位酪氨酸)的肽段(CE-NO2，CG-NO2和CL-NO2)，将其中的酪氨酸也替换为硝基化酪氨酸，同时也将半胱氨酸连接至其N末端；以及含SCOT位点为第4位酪氨酸的肽段(KN)，该肽段中的酪氨酸为未硝基化的状态。这五种肽段的序列见序列表。\n[0033] 上述肽段均送交上海吉尔生化有限公司合成。合成的多肽配成10mg/ml的溶液。\n[0034] 二、肽段与载体蛋白KLH的耦联\n[0035] 将10mg/ml的sulfoGMBS(PIERCE公司)和10mg/ml的mcKLH(Thermo Fisher公司)以1∶5的比例混合，室温下置于摇床上缓慢摇匀30min后，12,000rpm离心5min。取TM\n上清，经sephadex G 25Fine(GE公司)分离收集活化好的载体蛋白质KLH sulfoGMBS，以等质量比滴加到步骤一得到的多肽溶液(CN NO2)中，在室温下旋转混匀3h(或4℃旋转过夜)即可。\n[0036] 实施例2.杂交瘤细胞系的建立\n[0037] 一、免疫\n[0038] 将肽段CN-NO2与KLH耦联产物用弗氏完全佐剂(Sigma公司)乳化，免疫4-6周龄雌性Balb/c小鼠(由军事医学科学院提供)，腹部皮下注射每只小鼠6点，剂量为60μg/只。每14天加强免疫一次，免疫原使用弗氏非完全佐剂(Sigma公司)乳化，剂量为30μg/只。第3次加强免疫后10天以间接ELISA(波长450nm)检测小鼠血清中抗免疫原的多抗效价，效价最高的小鼠以腹腔注射冲击免疫，免疫原用生理盐水混匀，剂量为50μg/只。\n[0039] 二、细胞融合\n[0040] 无菌制备免疫达标的小鼠脾细胞悬液，与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0(ATCC)以5∶1比例混合，离心1500rpm，5min。弃上清后离心管放入37℃水浴中，在1分钟内缓慢加入\n1ml的PEG1500(Roche公司)，并搅动细胞。在温水中静置1min后，加入10ml无血清的IMDM(Sigma公司)，混匀，离心1,000rpm，5min。弃上清后，加入10ml血清(PAA公司)小心的将细胞吹打起来，并加入5ml混合10xHAT(Sigma公司)的胸腺细胞，混匀。再加入25ml含有2.1％硝基纤维素(Sigma公司)的半固体培养基充分混匀，然后均匀的倒入20个细胞培养皿中。将细胞培养皿放入到湿盒中，放入37℃5％CO2培养箱中培养。\n[0041] 三、挑克隆\n[0042] 融合后11天克隆细胞团大小密度适中，在解剖镜下，吸取圆、实、大的克隆团打入事先准备好培养基的96孔培养板中，放入37℃5％CO2培养箱中培养。\n[0043] 四、ELISA筛选阳性杂交瘤细胞\n[0044] 挑克隆3天后，细胞量大约占底面积2/3，取100μl上清用KLH-CN-NO2作为包被抗原对融合克隆进行ELISA筛选。阳性克隆完全换液，加入200μl含饲养细胞和1％HT(Sigma公司)的完全培养基。两天后进行第二次ELISA筛选，用KLH-CN-NO2与KLH的免疫反应进行ELISA的比较，以及利用修饰肽段与未修饰肽段进行ELISA的比较，从而选取其中特异性较好的阳性克隆，阳性克隆转入事先准备好培养基(含饲养细胞和HT)的24孔板培养。四天后取100μl上清进行第三次ELISA筛选，阳性克隆逐次转入6孔板和细胞培养瓶扩大培养并冻存。\n[0045] 实施例3.腹水诱生法制备单克隆抗体\n[0046] 一、腹水制备\n[0047] 对数生长期细胞用无血清培养基洗涤并悬起，计数～5×105，1ml。悬浮的细胞腹腔注射事先用石蜡油致敏的小鼠。7天后开始收集腹水。取出的腹水于4℃离心4000rpm，\n10min。小心吸出中间的腹水收集于离心管中，4℃或-20℃保存。\n[0048] 二、单克隆抗体的纯化\n[0049] 用HiTrap rProteinAFF(GE公司)亲和层析法按说明书从腹水中纯化抗体。\nSDS-PAGE胶鉴定纯度，Bradford法测定浓度。纯化的抗体保存于-20℃。\n[0050] 实施例4.单克隆抗体特性鉴定\n[0051] 一、亚类鉴定\n[0052] 用100mM PBS(pH7.4)稀释包被羊抗鼠IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司)至\n0.5μg/ml，每孔加100μl，4℃，过夜。倾空液体，用含0.05％Tween的PBS(PBS-T)洗3次，每孔加入200μl封闭液(含2％BSA和3％蔗糖的PBS)，37℃孵育1h。倾空液体，用PBS-T清洗3次。每孔加入0.1ml杂交瘤上清，37℃孵育1h。倾空液体用PBS-T清洗3次。用封闭液1∶1000稀释HRP标记的羊抗鼠(k，λ)抗体或1∶2000稀释HRP标记的羊抗鼠(IgM，IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3，IgA)抗体(Southern Biotech公司)0.1ml每孔分别加入适当的孔中，37℃孵育1h。倾空液体，用PBS-T清洗3次。每孔加50μl含0.15％ABTS(Southern Biotech公司)和0.03％H2O2的柠檬酸缓冲液(PH4.0)进行显色反应，10-20min内测定\n405nm波长下的OD值。结果显示，本发明单克隆抗体CN-10为G2a型鼠源单克隆抗体。\n[0053] 二、亲和常数测定(ELISA方法)\n[0054] 包被合成多肽，包被浓度为2μg/ml，100μl/孔，4℃包被过夜，PBS-T洗3次。\n每孔加200μl封闭液37℃封闭1h，PBS-T洗3次。用封闭液倍比(2倍)稀释纯化抗体(1∶1000起始)，加入相应孔中100ul，37度温育1小时，PBS-T洗3次。HRP标记的羊抗鼠二抗1∶3000稀释，每孔100μl，37℃孵育1h，PBS-T洗3次。每孔加入100μl含0.1％TMB(Sigma公司)和0.03％H2O2的柠檬酸-磷酸缓冲液显色10min，加50μl 0.5M硫酸溶液终止反应。用酶标仪测定波长450nm的吸光值。利用抗体稀释倍数对OD值，画出OD值对应抗体稀释倍数的曲线，找出≥1/2“平台OD值”对应的稀释倍数A。利用下列公式计算\n8\n出单克隆抗体CN-10的亲和常数为6.2*10。\n[0055] \n[0056] 实施例5.抗体特异性的鉴定\n[0057] 一、ELISA鉴定抗体特异性\n[0058] 将4个含硝基化酪氨酸(Tyr4、Tyr 76、Tyr 117、Tyr368)的肽段(CN-NO2、CE-NO2、CG-NO2、CL-NO2)与BSA相耦联，然后采用实施例4中测亲和力的方法对本发明的单抗与这\n4个位点的识别能力进行比较。结果如图1所示，CN-10只识别含在第4位酪氨酸有硝基化修饰的肽段CN-NO2，对其他3个SCOT的硝基化修饰酪氨酸肽段无免疫反应。\n[0059] 二、Western blot鉴定抗体特异性\n[0060] 用Western blot对SCOT硝基化修饰与非修饰形式识别能力进行比较，利用大肠杆菌表达系统产生的重组SCOT为检测底物，在体外采用过氧亚硝酸为NO供体，使其发生硝基化修饰。\n[0061] 免疫印迹实验过程如下：每种蛋白上样约100ng，进行12％聚丙烯酰胺凝胶电泳。\n按常规方法在Bio-Rad电转移系统中将凝胶蛋白带转移到PVDF膜上(Millipore公司)。\n将膜置于含5％脱脂奶粉的TBS-T封闭液中4℃过夜。加入单克隆抗体(1∶2500稀释)震荡孵育1小时。用TBS-T洗膜后，加入1∶3000稀释的羊抗鼠二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)，室温震荡孵育1小时。再次TBST洗膜，加入ECL超敏显色液(普利莱公司)，用ImageQuant ECL仪器(GE公司)捕获显色图像。\n[0062] 如图2所示，这两种形式的SCOT在相同的上样量条件下，只有硝基化修饰的SCOT有明显的免疫杂交。\n[0063] 用Western blot方法对硝基化修饰的SCOT与硝基化修饰的其他3种蛋白的识别能力进行比较。首先利用过氧亚硝酸分别将SCOT、skpA associated protein(大肠杆菌表达的重组蛋白质)、Hydroxyacyl-Coenzyme A dehydrogenase beta subunit(HADHB)(大肠杆菌表达的重组蛋白质)和BSA(Calbiochem公司)进行硝基化修饰，图3表明，通过考马斯亮蓝染色和3NT(Santa Cruz公司)的杂交信号显示，相等量的这4种蛋白都发生了硝基化修饰，而且其水平相当，但CN-10只识别含硝基化修饰的SCOT。\n[0064] 综合上述结果，CN-10对第4位酪氨酸硝基化修饰的SCOT能够特异识别。\n[0065] 实施例6.对糖尿病小鼠组织SCOT特定位点硝基化修饰进行检测\n[0066] 采用实施例5所述的Western blot方法，利用本发明所产生的特异抗体CN-10对糖尿病小鼠(北京美森生物医药科技有限公司)组织线粒体中SCOT第4位酪氨酸的硝基化修饰水平变化与否进行检测。如图4所示，通过ATP synthaseβ抗体(BD Bioscience公司)的免疫信号显示心脏、肾脏、肝脏线粒体的上样量基本一致，通过SCOT抗体(北京华大蛋白质研发中心有限公司)的免疫信号显示SCOT的表达水平在糖尿病心脏和肾脏组织线粒体中基本没有变化，而CN-10抗体的杂交信号显示在糖尿病小鼠的心脏和肾脏中硝基化修饰明显比对照组增加。在肝脏中则没有SCOT的表达及其修饰的信号。\n[0067] 利用5对小鼠组织分别进行对比检测，结果见表1。统计学结果显示，在糖尿病小鼠心脏和肾脏组织线粒体中SCOT第4位酪氨酸硝基化修饰增加了2-3倍。SCOT第4位和第76位酪氨酸硝基化水平的增加与糖尿病具有相关性。用SCOT蛋白特定位点的硝基化修饰的特异抗体可以简便地检测SCOT蛋白的硝基化状态，并可能用于糖尿病的研究和检测。\n[0068] 表1SCOT第4位酪氨酸硝基化修饰变化的统计结果\n[0069]