一种云芝多糖的制备方法

1. 一种云芝多糖的制备方法，包括以下的步骤：
(1)将云芝菌丝体按质量比1∶4，浸入加了质量分数2.0％Na2CO3的90℃热水中，浸提1～2h，反复浸提过滤2～3次，然后合并浸提液并浓缩至原体积的1/5～1/3；
(2)步骤(1)得到的浓缩提取液中加入体积为浓缩提取液3～4倍的乙醇，静置沉淀
24h后过滤，沉淀部分25℃烘干得到粗多糖；
(3)步骤(2)得到的粗多糖用70℃热水溶解，加入其水溶液体积的1/5氯仿和氯仿体积1/5的正丁醇，剧烈振荡至生成凝胶物，离心分离收集上清液，除去下层变性蛋白和氯仿；
(4)将步骤(3)得到的上清液调制至含粗多糖5％的水溶液，用NaOH调到pH＝9.0，于50℃水浴中，滴入体积为粗多糖水溶液的15％，质量分数为15％的H2O2溶液，保持pH为
8.0～9.0，持续水浴4h后终止反应，缓缓加入质量分数95％乙醇，置冰箱过夜，次日收集沉淀，干燥，得到产物。
2. 根据权利要求1所述的一种云芝多糖的制备方法，其特征在于步骤(1)热水中浸提的时间为2h，步骤(3)所述的振荡时间是20～30min，所述的离心分离条件是转速4000r/min，持续15min，步骤(4)所述的干燥采用真空冷冻干燥。

一种云芝多糖的制备方法\n技术领域\n[0001] 本发明涉及一种新的云芝多糖的制备方法。\n背景技术\n[0002] 云芝(Coriolus versicolor)是我国珍贵的中草药资源，云芝菌丝体内和体外均可以产生云芝多糖(Coriolus versciolor polysaccharides，CVP)，这是一种含蛋白质的糖肽复合物，主要成分是以β(1，4)、β(1，3)或β(1，4)、β(1，6)为主的葡聚糖复合物，上有β(1，3)或β(1，6)结合的发分支，多糖含量30％～60％，结合蛋白15％。\n[0003] 云芝多糖能激活免疫细胞，提高机体免疫功能，明显改善机体炎症反应的强度，具有抗肿瘤、抗溃疡、降血脂、保肝等多种生物活性，具有抗细菌、霉菌及病毒的功能，可刺激巨噬细胞转化，增加血液里的白细胞介素1，干扰素γ及肿瘤坏死因子的作用，能抑制癌细胞生成，是安全性高，生物活性强的人或动物的免疫增强剂，更可作为健康食品的添加剂。\n[0004] 目前云芝多糖提取的方法按提取溶剂的不同主要分为水浸提法、酸提法、碱提法等，虽然酸提法和碱提法提取云芝多糖的最高得率与水浸提法相比差别不大，但是会严重地污染环境，而水浸提法则在生产工艺、生产成本、产品安全性以及环保等方面有较强的优势。\n[0005] 目前的水浸提法常采用加热煮沸云芝子实体的方法来提取云芝多糖，仅此过程需要5～10h，甚至更长的时间，浸提液用量较大，有时高达30倍，在提取过程中要消耗大量能源，且云芝多糖的得率只有7.81％左右。\n发明内容\n[0006] 本发明的目的在于开发出一种能获得高产率高含量的云芝多糖的新的制备方法。\n[0007] 我们通过将云芝菌丝体浸入4倍热水中浸提至少两次，再用乙醇沉淀得到粗多糖，再除蛋白，脱色，干燥，得到的云芝多糖的得率至少在8％以上，提纯后的多糖含量在\n40％以上，从而实现了本发明的目的。\n[0008] 本发明的一种云芝多糖的制备方法，包括以下的步骤：\n[0009] (1)将云芝菌丝体按质量比1∶4，浸入加了质量分数2.0％Na2CO3的90℃热水中，浸提1～2h，反复浸提过滤2～3次，然后合并浸提液并浓缩至原体积的1/5～1/3；\n[0010] (2)步骤(1)得到的浓缩提取液中加入体积为浓缩提取液3～4倍的乙醇，静置沉淀24h后过滤，沉淀部分25℃烘干得到粗多糖；\n[0011] (3)步骤(2)得到的粗多糖用70℃热水溶解，加入其水溶液体积的1/5氯仿和氯仿体积1/5的正丁醇，剧烈振荡至生成凝胶物，离心分离收集上清液，除去下层变性蛋白和氯仿；\n[0012] (4)将步骤(3)得到的上清液调制至含粗多糖5％的水溶液，用NaOH调到pH＝\n9.0，于50℃水浴中，滴入体积为粗多糖水溶液的15％，质量分数为15％的H2O2溶液，保持pH为8.0～9.0，持续水浴4h后终止反应，缓缓加入质量分数95％乙醇，置冰箱过夜，次日收集沉淀，干燥，得到产物。\n[0013] 步骤(1)所述的云芝菌丝体可以通过过滤云芝菌丝发酵液得到，最好浸入热水中\n2h，所述的热水中加入Na2CO3，可防止多糖降解。\n[0014] 步骤(3)所述的振荡时间最好是20～30min，所述的离心分离条件最好是转速\n4000r/min，持续15min。\n[0015] 步骤(4)所述的干燥最好采用真空冷冻干燥。\n[0016] 本发明的制备方法能显著提高云芝多糖的得率，并明显缩短操作时间，降低能源的消耗，在较小的生产成本下可保证大批量生产获得活性较高的云芝多糖，从而使云芝多糖能在较大的工业化程度上实现商品化。\n附图说明\n[0017] 图1：云芝菌丝体提取物的紫外吸收光谱。\n[0018] 图2：葡萄糖含量标准曲线\n具体实施方式\n[0019] 实施例1：\n[0020] 称取云芝菌丝体净重122.13g(烘干重16.22g)，加入125mL纯净水后粉碎，添加水至350mL，然后加入7gNa2CO3，90℃水浴2h后，反复浸提过滤2次，然后取浸提液浓缩至原体积的1/5。将得到的浓缩液200mL加入3倍体积的95％乙醇进行沉淀，静置24h后过滤，沉淀部分烘干得到粗多糖。加入70℃热水200mL溶解粗多糖，加入40mL氯仿，8mL正丁醇，剧烈振荡20min，生成凝胶物，在离心机上4000r/min离心过滤15min，收集上清液，除去下层变性蛋白和上层氯仿，得到溶液130mL。用NaOH调节pH值至9.0，加入15％H2O220mL，然后再50℃水浴4h，并缓慢加入95％乙醇150mL。4℃冰箱过夜，次日4000r/min，20min离心过滤，收集沉淀，真空干燥，得到白色粉末1.432g，得率8.83％。\n[0021] 实施例2：实施例1得到的产物的紫外吸收光谱测定\n[0022] 紫外扫描仪HITACHI(日本)对样品水溶液进行190～360nm的紫外扫描，以确定是否是蛋白结合多糖，测定结果见附图1，云芝多糖是一种含蛋白质的糖肽复合物。从上图可以看出在260nm处无吸收，在270-280nm左右有一肩形峰，这是蛋白结合多糖的特征吸收。\n[0023] 实施例3：实施例1得到的产物的云芝多糖含量测定\n[0024] 准确称取标样葡萄糖20mg于500mL容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.2、0.4、\n0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8mL，分别以水补至2.0mL，然后加入5％苯酚1.0mL及浓硫酸\n5.0mL，静置10min，摇匀，30℃水浴20min。后于490nm测光密度值(OD)，2.0mL水为空白。\n横坐标为葡萄糖浓度，纵坐标为OD值，绘标准曲线图(见附图2)，进行线形回归，得回归方\n2\n程式：y＝0.0146x+0.0103，R ＝0.9984。吸取样液1.0ml，操作步骤同上，重复三次，测OD值分别为0.2983、0.2901、0.2956，取其平均值，查标准曲线。云芝多糖与葡萄糖含量的校正系数为2.5，经计算，提纯后多糖含量为48.69％。