一种水溶性杂多糖及其制备方法和用途

1.一种水溶性杂多糖，由下法制得：采用华中农业大学应用真菌研究所提供的编号P0的野 生茯苓菌种(Poria cocos)在含玉米浆的液体培养基中深层发酵培养出茯苓菌丝体，将 茯苓菌丝体依次用乙酸乙酯、丙酮进行索氏提取去除脂肪；然后浸泡在生理盐水中，离 心，收集提取液；提取液浓缩后，用H2O2脱色，用Sevag法除去游离的蛋白质直至紫外 检测无280nm的蛋白质吸收峰，然后透析、冷冻干燥得多糖纯品。
2.一种水溶性杂多糖，由下法制得：采用华中农业大学应用真菌研究所提供的编号P0的野 生茯苓菌种(Poria cocos)在含玉米浆的液体培养基中深层发酵培养出茯苓菌丝体，将 茯苓菌丝体依次用乙酸乙酯、丙酮进行索氏提取去除脂肪；然后浸泡在生理盐水中，离 心，离心后所得沉淀用105～120℃的热水在0.12～0.20MPa下浸泡提取，离心，收集提 取液；提取液浓缩后，用H2O2脱色，用Sevag法除去游离的蛋白质直至紫外检测无280nm 的蛋白质吸收峰，然后透析、冷冻干燥得多糖纯品。
3.一种水溶性杂多糖，由下法制得：华中农业大学应用真菌研究所提供的编号P0的野生茯 苓菌种(Poria cocos)在含玉米浆的液体培养基中深层发酵培养出茯苓菌丝体，茯苓菌 丝体的培养液浓缩后，用H2O2脱色，用Sevag法除去游离的蛋白质直至紫外检测无280nm 的蛋白质吸收峰，然后透析、冷冻干燥得多糖纯品。
4.权利要求1所述水溶性杂多糖的制备方法，其特征在于：华中农业大学应用真菌研究所 提供的编号P0的野生茯苓菌种(Poria cocos)在含玉米浆的液体培养基中深层发酵培养 出茯苓菌丝体，将茯苓菌丝体依次用乙酸乙酯、丙酮进行索氏提取去除脂肪；然后浸泡 在生理盐水中，离心，收集提取液；提取液浓缩后，用20％～30％(重量百分比)H2O2 脱色，用Sevag法除去游离的蛋白质直至紫外检测无280nm的蛋白质吸收峰，然后透析、 冷冻干燥得多糖纯品；所述培养基的基本组成为玉米浆5～15mL、D-葡萄糖20～30g、 酵母膏3～3.5g、KH2PO4 0.8～1.2g、CaCl2·2H2O 0.04～0.08g、MnCl2·4H2O 3～7mg、 MgSO4·7H2O 0.3～0.7g、ZnCl2 2～6mg、Fe2(SO4)3 3～7mg、维生素B1 0.08～0.12mg、 蒸馏水1L。
5.权利要求2所述水溶性杂多糖的制备方法，其特征在于：采用华中农业大学应用真菌研 究所提供的编号P0的野生茯苓菌种(Poria cocos)在含玉米浆的液体培养基中深层发酵 培养出茯苓菌丝体，将茯苓菌丝体依次用乙酸乙酯、丙酮进行索氏提取去除脂肪；然后 浸泡在生理盐水中，离心，离心后所得沉淀用105～120℃的热水在0.12～0.20MPa下浸 泡提取，离心，收集提取液；提取液浓缩后，用20％～30％(重量百分比)H2O2脱色， 用Sevag法除去游离的蛋白质直至紫外检测无280nm的蛋白质吸收峰，然后透析、冷冻 干燥得多糖纯品；所述培养基的基本组成为玉米浆5～15mL、D-葡萄糖20～30g、酵母 膏3～3.5g、KH2PO4 0.8～1.2g、CaCl2·2H2O 0.04～0.08g、MnCl2·4H2O 3～7mg、 MgSO4.7H2O 0.3～0.7g、ZnCl2 2～6mg、Fe2(SO4)3 3～7mg、维生素B1 0.08～0.12mg、 蒸馏水1L。
6.权利要求3所述水溶性杂多糖的制备方法，其特征在于：采用华中农业大学应用真菌研 究所提供的编号P0的野生茯苓菌种(Poria cocos)在含玉米浆的液体培养基中深层发酵 培养出茯苓菌丝体，茯苓菌丝体的培养液浓缩后，用20％～30％(重量百分比)H2O2脱 色，用Sevag法除去游离的蛋白质直至紫外检测无280nm的蛋白质吸收峰，然后透析、 冷冻干燥得多糖纯品；所述培养基的基本组成为玉米浆5～15mL、D-葡萄糖20～30g、 酵母膏3～3.5g、KH2PO4 0.8～1.2g、CaCl2·2H2O 0.04～0.08g、MnCl2·4H2O 3～7mg、 MgSO4·7H2O 0.3～0.7g、ZnCl2 2～6mg、Fe2(SO4)3 3～7mg、维生素B1 0.08～0.12mg、 蒸馏水1L。
7.权利要求1、2或3所述的水溶性杂多糖在制备抗肿瘤药物中的用途。
8.权利要求1、2或3所述的水溶性杂多糖在制备提高机体免疫功能的保健品中的用途。

技术领域    本发明涉及具有抗肿瘤活性的茯苓菌丝体水溶性杂多糖及其制备方法和用 途。它属于高分子化学领域，也属于分子生物学领域。
背景技术    80年代以来的研究表明，真菌多糖对多种危害人类健康的疾病，如免疫紊乱、 癌症、糖尿病、高血压、肝炎、肺炎等都具有显著的疗效。Chihara的研究认为该多糖类化合 物是一种免疫调节剂，它能够增强巨噬细胞和白细胞的吞噬功能，诱导产生肿瘤坏死因子 (TNF)和白细胞素，从而提高人体的免疫机能，而且对正常细胞没有毒副作用(Intern.J. Orient.Med.17，57，1992)。茯苓是生长在松树根上的一种真菌，由于生长条件所限，主要产 于东方如中国、日本。其作为我国特产资源，长期用于中药配方，在传统医学上被用作灵丹 妙药。Narui等人(Carbohydr.Res.87，161，1980)和Kanayama等人(Yakugaku Zasshi，106，307， 1986)分别报道了从茯苓菌核和菌丝体中碱提取的多糖具有明显的抗肿瘤活性。但是由于茯 苓人工栽培受地理条件限制大而较为困难，而且生长周期长，难以保存和运输，使得由菌核 制得的茯苓多糖难以推广。另外碱提取多糖的水不溶性限制了其在抗肿瘤方面的应用。采用 生物工程技术可克服这些缺点。
发明内容    本发明所要解决的问题是提供一种水溶性杂多糖及其制备方法和用途，所得 水溶性杂多糖具有明显抗肿瘤活性，而且其制备方法简单易行、成本较低廉。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
一种水溶性杂多糖，由下法制得：采用华中农业大学应用真菌研究所提供的野生茯苓菌 种(Poria cocos，编号P0)在含玉米浆的液体培养基中深层发酵培养出茯苓菌丝体，将茯苓 菌丝体依次用乙酸乙酯、丙酮进行索氏提取去除脂肪；然后浸泡在生理盐水中，离心，收集 提取液；提取液浓缩后，用20％～30％(重量百分比)H2O2脱色，用Sevag法除去游离的蛋 白质直至紫外检测无280nm的蛋白质吸收峰，然后透析、冷冻干燥得水溶性杂多糖 (wc-PCM1)纯品。上述离心后所得沉淀用105～120C的热水在0.12～0.20MPa下浸泡提取， 离心，收集提取液；提取液浓缩后，用20％～30％(重量百分比)H2O2脱色，用Sevag法除 去游离的蛋白质直至紫外检测无280nm的蛋白质吸收峰，然后透析、冷冻干燥得多糖 (wc-PCM2)纯品。上述茯苓菌丝体的培养液浓缩后，用20％～30％(重量百分比)H2O2脱 色，用Sevag法除去游离的蛋白质直至紫外检测无280nm的蛋白质吸收峰，然后透析、冷冻 干燥得多糖(wc-PCM0)纯品。
上述水溶性杂多糖主要由α-D-葡萄糖、甘露糖、半乳糖和不同含量的蛋白质组成。其中 wc-PCM0含蛋白质19.0％，多糖81.0％，重均分子量为9.2×104；wc-PCM1含蛋白质30.6 ％，多糖69.4％，重均分子量为26.2×104；wc-PCM2含蛋白质29.5％，多糖70.5％，重均 分子量为89.2×104。
上述茯苓菌丝体水溶性杂多糖的制备方法，采用华中农业大学应用真菌研究所提供的野 尘茯苓菌种(Poria cocos，编号P0)在含玉米浆的液体培养基中深层发酵培养出茯苓菌丝体， 将茯苓菌丝体依次用乙酸乙酯、丙酮进行索氏提取去除脂肪；然后浸泡在生理盐水中，离心， 收集提取液；提取液浓缩后，用20％～30％(重量百分比)H2O2脱色，用Sevag法除去游离 的蛋白质直至紫外检测无280nm的蛋白质吸收峰，然后透析、冷冻干燥得多糖(wc-PCM1) 纯品。上述离心后所得沉淀用105～120℃的热水在0.12～0.20MPa下浸泡提取，离心，收集 提取液。提取液浓缩后，用20％～30％(重量百分比)H2O2脱色，用Sevag法除去游离的蛋 白质直至紫外检测无280nm的蛋白质吸收峰，然后透析、冷冻干燥得多糖(wc-PCM2)纯品。 上述茯苓菌丝体的培养液浓缩后，用20％～30％(重量百分比)H2O2脱色，用Sevag法除去 游离的蛋白质直至紫外检测无280nm的蛋白质吸收峰，然后透析、冷冻干燥得多糖 (wc-PCM0)纯品。
上述培养基的基本组成为玉米浆5～15mL、D-葡萄糖20～30g、酵母膏3～3.5g、KH2PO4 0.8～1.2g、CaCl2·2H2O 0.04～0.08g、MnCl2·4H2O 3～7mg、MgSO4·7H2O 0.3～0.7g、ZnCl2 2～ 6mg、Fe2(SO4)3 3～7mg、维生素B1 0.08～0.12mg、蒸馏水1L。
上述茯苓菌丝体索氏提取去除脂肪时间在4～8小时，其在生理盐水中的提取时间在8～ 12小时；透析时间在5～10天。
上述水溶性杂多糖在制备抗肿瘤药物或提高机体免疫功能的保健品中的用途。
上述水溶性杂多糖用红外、核磁共振、气相色谱、蛋白质分析仪、粘度计及光散射仪确 定了其化学组成和二级结构。
本发明的茯苓菌丝体水溶性杂多糖为结构清楚的新的物质，它们具有明显抗肿瘤活性。 由于弄清了其化学组成和二级结构，加之无任何毒副作用，这种茯苓菌丝体杂多糖可成为理 想的和有开发前景的抗肿瘤药物或提高机体免疫功能的保健品。利用生物工程发酵技术培养 茯苓菌丝体，并从中分离出具有抗肿瘤活性的多糖，弄清了玉米浆作为培养基组分之一对多 糖的分子量，蛋白质含量及抗肿瘤活性的影响，并证明由该培养基提取出的多糖比含麸皮的 培养基的多糖有更好的生物活性。因此具有广阔的应用前景和潜在的经济效益。本发明的水 溶性杂多糖制备方法简单易行、成本低廉、易于工业化生产。
具体实施方式
以下结合具体的实例对本发明的技术方案作进一步说明：
实施例
茯苓菌种为华中农业大学应用真菌研究所从湖北罗田野生茯苓菌核分离出的野生茯苓 菌种(编号P0；公众可随时购买)。首先在斜面培养基中培养菌种。培养用的试管以及棉塞 先在121℃消毒灭菌30分钟(空消)，再装入培养基在121℃消毒灭菌30分钟，斜放冷却使其 凝固成斜面。然后在无菌室接种。斜面培养在恒温28℃下进行，为期7天。液体培养基配方如 下：玉米浆(10mL)，D-葡萄糖(25g)，酵母膏(3.2g)，KH2PO4(1.0g)，CaCl2·2H2O(0.06g)，MnCl2·4H2O(5mg)，MgSO4·7H2O(0.5g)，ZnCl2(4mg)，Fe2(SO4)3(5mg)， 维生素B1(0.1mg)，蒸馏水(1L)。培养用的摇瓶(150mL)和棉塞事先在121℃消毒灭菌 30分钟，装入液体培养基后再在121℃消毒灭菌30分钟。冷却后在无菌室接种。静置一天后将 摇瓶置于摇床上，于25±1℃条件下震荡培养12天。所得菌丝体为浅黄色，且有一种淡香味。
将茯苓菌丝体粉末依次用乙酸乙酯、丙酮进行索氏提取各8小时。然后用9g/L氯化钠水 溶液提取三次：浸泡在9g/L氯化钠水溶液中过夜，离心，收集上清液(wc-PCM1)。残渣 用热水于0.15MPa下提取三次，每次20～40分钟，离心，收集上清液(wc-PCM2)。提取液 浓缩后，均用30％(重量百分比)H2O2脱色至浅黄色，用Sevag法除去游离的蛋白质，反复 进行9次以上直至紫外检测无280nm的蛋白质吸收峰，然后分别用清水和二次蒸馏水透析5天 和3天，浓缩，最后冷冻干燥得多糖纯品。茯苓菌丝体培养液过滤，浓缩后用30％(重量百分 比)H2O2脱色，用Sevag法除去游离的蛋白质，反复进行9次，然后分别用清水和二次蒸馏水 透析5天和3天，浓缩，最后冷冻干燥得胞外多糖(wc-PCM0)。所得多糖均为白色粉状固体。
对照组液体培养基配方为：D-葡萄糖(25g)，酵母膏(3.2g)，KH2PO4(1.0g)，CaCl2·2H2O (0.06g)，MnCl2·4H2O(5mg)，MgSO4·7H2O(0.5g)，ZnCl2(4mg)，Fe2(SO4)3(5mg)， 维生素B1(0.1mg)，麸皮(200g)的提取液(1L)。菌丝体培养方法和茯苓菌丝体水溶性 杂多糖提取方法同上。所得多糖分别命名为：wb-PCM0，wb-PCM1，wb-PCM2。
这些多糖的组成、结合蛋白质含量、分子量及产率列于附表1。经香港中文大学生物系 对植入Sarcoma 180肿瘤的小鼠进行体内腹腔注射实验的生物活性结果列于附表2。显然，从 含玉米浆成分的培养基培养出的茯苓菌丝体中提取的杂多糖(实施例)的抗肿瘤活性明显高于 含麸皮提取液成分中提取的杂多糖(比较例)。同时对本发明的水溶性杂多糖进行人体急性白 血病毒细胞(HL-60)的抗增殖实验结果表明其对增殖有显著的抑制效果，而不会破坏正常 猴肾细胞的增殖。由此表明含玉米浆的培养基培养的茯苓菌丝体多糖含有较多蛋白质，并具 有明显抗肿瘤活性以及对人体急性白血病毒细胞增殖的抑制作用。该多糖可用于制备抗肿瘤 药物和提高机体免疫功能的保健品，具有极大的推广和应用前景。
附表1.茯苓菌丝体水溶性杂多糖单糖组成、蛋白质含量、产率和分子量
                            多糖中单糖含量(％)
                                                              蛋白质     Mw×10-4   产率
样品
                                                               (％)      (gmol-1)    (％)
            岩藻糖  阿拉伯糖  木糖   甘露糖   半乳糖   葡萄糖
    wc-PCM0   4.1     3.0      2.5    61.7     15.0     13.7   19.0       9.2
实
施  wc-PCM1   10.5    -        -      24.5     27.5     37.5   30.6       26.2        1.8
例
    wc-PCM2   3.4     -        -      12.5     13.4     70.7   29.5       89.2        3.1
    wb-PCM0   -       6.1      3.9    11.4     5.9      71.7   12.8       14.4
比 
较  wb-PCM1   -       -        -      7.7      19.2     73.1   7.6        33.3        1.3
例
    wb-PCM2   -       +       +       0.9      1.3      95.9   8.5                    2.0
-：未检测到；+：痕量
附表2.茯苓菌丝体水溶性杂多糖的分子量和抗肿瘤活性
                                   剂量
样品                                抑制率(％)      完全抑制
                    (mg/kg×days)
      wc-PCM0         20×10           42.7           1/8
实
施    wc-PCM1         20×10           56.0           0/8
例
      wc-PCM2         20×10           66.8           3/8
比    wb-PCM0         20×10           16.7           0/8
较
例    wb-PCM1         20×10           20.8           0/8