膀胱癌检测试剂盒、检测方法及人类补体因子H相关蛋白在其中的应用

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膀胱癌检测试剂盒、检测方法及人类补体因子H相关蛋白在其\n中的应用\n技术领域\n[0001] 本发明属于生物医药领域，具体涉及一种膀胱癌检测试剂盒、检测方法及人类补体因子H相关蛋白在其中的应用。\n背景技术\n[0002] 人补体因子H相关蛋白(human complement factor H related protein，HCFHrp)，又称为膀胱肿瘤抗原(Bladder tumor antigen，BTA)，补体因子H（Complement Factor H）是其具体成分，补体因子H是由癌症细胞和巨噬细胞产生的，不是正常表皮细胞产生的，肿瘤细胞分泌内源性基底蛋白与基底膜表面蛋白受体结合，并释放蛋白水解酶破坏基底膜，基底膜碎片（胶原片段、 糖蛋白和蛋白多糖等）进入膀胱内聚成高分子复合物即BTA。大小为16～165kd，随尿液排出，可作为膀胱癌抗原检测出来。\n[0003] BTA在控制补体激活替代途径的时候扮演关键的负反馈作用，这个替代途径可以裂解外来细胞（通过膜攻击复合物裂解细胞）。BTA结合补体因子C3b后，可以抑制膜攻击复合物的形成，从而阻止肿瘤细胞裂解。BTA的产生赋予体内肿瘤细胞一种选择性生长优势，让细胞逃逸宿主免疫系统监视。简单地说，BTA帮助肿瘤细胞逃脱人体内在调控，避免凋亡。\n[0004] 早期诊断和复发监测是膀胱癌诊治的重要内容。目前临床上诊断措施主要有尿脱落细胞学检查、膀胱镜检及组织活检。尿脱落细胞学检查特异性高，但敏感性低，尤其易漏检C1级肿瘤（BTA90%）。而膀胱镜是有创检查，不能早期诊断且患者依从性差。因此BTA受到越来越多的关注。尿脱落细胞学检查，留置24小时尿，取下面沉积的尿液做显微镜检查，连续做三天膀胱癌活检一般是膀胱镜下用钳取一块组织做病理学检查。封蜡切片镜检尿脱落细胞学检查主要用于上尿路细胞癌，尿路上皮癌最重要的临床特点是容易复发并且随着复发次数增加肿瘤更倾向恶性。因此选择合适的分子生物学标志预测尿路上皮癌的复发，可早期采取有效治疗措施，减少肿瘤进展机会。\n[0005] 膀胱肿瘤的筛查是超声，超声发现有东西，做盆腔CT，如果要确定是不是癌症，做膀胱镜取组织活检（是不做尿脱落细胞学的）先超声（无创又便宜），然后再CT（昂贵又有射线），最后才是膀胱镜（有创还昂贵）。\n[0006] 现阶段，急迫研发出一种能够作为膀胱癌早期诊断又快速定性的一种检测方法，且方法可普遍用于大众。\n发明内容\n[0007] 本发明所要解决的技术问题是，提供一种检测精度高、特异性好、患者依从性高、使用方便的膀胱癌检测试剂盒、膀胱癌检测方法，同时提供人类补体因子H相关蛋白在制备所述膀胱癌检测试剂盒中的应用。\n[0008] 本发明的技术方案为：一种膀胱癌检测试剂盒，包括多克隆抗体，利用人类补体因子H构建重组质粒pET32a-CFH，以大肠杆菌BL21(DE3)为表达宿主，然后使用ÄKTA系统进行蛋白纯化，得到BTA原核表达蛋白，免疫新西兰白兔，得到多克隆抗体。\n[0009] 进一步的，所述构建重组质粒时，正向引物序列为SEQ  ID  No.  1：\nagacttctagcaaagattat，反向引物序列为SEQ ID No. 2：tctttttgcacaagttggat。\n[0010] 进一步的，所述多克隆抗体进行辣根过氧化酶标记来作为酶标抗体，多克隆抗体浓度为7.5μg/mL。\n[0011] 进一步的，还包括单克隆抗体，选取BTA氨基酸序列中的三段合成多肽，多肽分别免疫BALB/c雌性6周龄健康小鼠，得到三个单克隆抗体1B9，5F6和6D2，序列分别为SEQ ID No. 3：tgsws dqtypegtqa iykcr、SEQ ID No. 4：qkrpcghp gdtpfgtftl tggnvfeyg和SEQ ID No. 5：fvc nsgykiegde emhcsddgfw。\n[0012] 更进一步的，单克隆抗体的质量比例为1B9：5F6：6D2=2:1:3，作为包被抗体，包被缓冲液为0.01M CB，即常规使用的pH9.6的碳酸盐缓冲液，包被浓度为5μg/mL。\n[0013] 本发明还提供一种利用所述试剂盒进行检测的方法，采用双抗夹心ELISA检测方法。\n[0014] 本发明同时提供人类补体因子H相关蛋白在制备所述膀胱癌检测试剂盒中的应用。\n[0015] 有益效果：本发明选取BTA为检测膀胱癌的标志物，针对3个不同多肽免疫所得单抗来混合作为本发明的包被抗体，灵敏度高，特异性强；包被抗体与检测抗体为不同来源的抗原免疫所得，进而提升检测准确性。\n[0016] 本发明检测精度高、特异性好、患者依从性高、检测方便。\n附图说明\n[0017] 图1为实施例中试剂盒的标准曲线。\n具体实施方式\n[0018] 为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面将结合本发明实施例中的具体实施方式，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。\n[0019] 实施例1\n[0020] 一种膀胱癌检测试剂盒，包括多克隆抗体，利用人类补体因子H构建重组质粒pET32a-CFH，以BL21(DE3)为表达宿主，进行蛋白表达，使用ÄKTA系统进行蛋白纯化，得到BTA原核表达蛋白，免疫新西兰白兔，得到多克隆抗体。\n[0021] 所述构建重组质粒时，以GenBank编号CAA68704.1为模板，使用Primer Premier 5 设计引物：正向引物为agacttctagcaaagattat，反向引物为Tctttttgcacaagttggat。\n[0022] 所述多克隆抗体进行辣根过氧化酶标记来作为酶标抗体，多克隆抗体浓度为7.5μg/mL。\n[0023] 本试剂盒还包括单克隆抗体，选取BTA氨基酸序列中的三段合成多肽，多肽分别免疫BALB/c雌性6周龄健康小鼠，得到三个单克隆抗体1B9，5F6和6D2。\n[0024] 单克隆抗体的比例为1B9：5F6：6D2=2:1:3，作为包被抗体，包被缓冲液为0.01M CB，包被浓度为5μg/mL。\n[0025] 本试剂盒检测膀胱癌采用双抗夹心ELISA检测方法，建立双抗夹心检测体系：抗BTA 3段多肽免疫所得的3个单克隆抗体按一定比例混合（1B9：5F6：6D2=2:1:3），用于作为包被抗体，包被缓冲液为0.01M CB，其包被浓度为5μg/mL；所得多克隆抗体进行辣根过氧化酶标记来作为酶标抗体，其浓度为7.5μg/mL，其检测线为0.5-16U/mL。\n[0026] 实施例2\n[0027] 以实施例1的试剂盒检测样品。\n[0028] （1）标准曲线的绘制\n[0029] 将试剂盒中包被板取出，于恢复室温30min，取10个检测孔，每孔加入100微升的标准品，具体为以正常尿液为空白，分别加入0 U/ml、0.5U/ml、1 U/ml、2 U/ml、4 U/ml、8 U/ml、16 U/ml、32U/ml的BTA标准品，于37度温箱孵育40min,清洗检测板3遍，每孔加入100微升的酶标抗体，于37度温箱孵育25min,清洗检测板5遍，每孔加入100微升的显色液，于37度温箱孵育10min,每孔加入50微升的终止液，于酶标仪450nm处检测结果，绘制标准曲线。具体见图1。\n[0030] （2）样品的检测\n[0031] 将试剂盒中包被板取出，于恢复室温30min，取10个检测孔，每孔加入100微升的样品，其样品为医院随机取样10个阳性样于37度温箱孵育40min,清洗检测板3遍，每孔加入\n100微升的酶标抗体，于37度温箱孵育25min,清洗检测板5遍，每孔加入100微升的显色液，于37度温箱孵育10min,每孔加入50微升的终止液，于酶标仪450nm处检测结果。然后与标准曲线对照，得出BTA含量。采用市面上某市售试剂盒产品进行检测对照。结果见表1。\n[0032]\n[0033] 实施例3\n[0034] 河北某医院病例监测\n[0035] 2014.12-2015.6 共66例患者因血尿（53例）或其他主诉到某医院门诊就诊。\n[0036] 本组66例，男50例，女16例，年龄20-88岁。\n[0037] 所有患者入院后进行常规术前检查，及B超、CT或CTU等影像学检查。\n[0038] 所有患者的尿液样本在膀胱镜检查前留取，进行本发明BTA试剂盒的检测。\n[0039] 阳性35例：包括尿路上皮肿瘤25例（膀胱癌16例，肾盂肿瘤5例，输尿管肿瘤4例)；\n膀胱上皮乳头状增生伴异增3例，输尿管结石3例，泌尿系感染2例，乳糜尿1例，膀胱全切术后肾积水1例；本试剂盒检测呈强阳性。\n[0040] 弱阳性8例：包括膀胱癌1例，膀胱腺癌1例，前列腺癌1例，腺性膀胱炎1例，膀胱上皮乳头状增生伴异增1例，输尿管结石1例，肾囊肿1例，前列腺增生1例；本试剂盒检测呈弱阳性。\n[0041] 阴性23例：包括膀胱癌5例，肾盂癌1例，肾透明细胞癌4例，前列腺癌1例，膀胱上皮乳头状增生伴异增2例，肾囊肿2例，尿道肉阜1例，前列腺增生3例，输尿管结石1例，膀胱癌术后复查未见异常3例；本试剂盒检测呈阴性。