游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒及其制备和检测方法

1.一种游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，其特征在于，包括如下试剂：
第一试剂：含荧光素标记的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位抗体、pH为7.0-9.0的缓冲溶液，所述的荧光素标记的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位抗体的浓度为
0.5~1μg/mL；
第二试剂：含碱性磷酸酶标记的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位抗体、pH为
7.0-9.0的缓冲溶液，所述的碱性磷酸酶标记的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位抗体的浓度为0.5~1μg/mL；
磁分离试剂：含包被着荧光素抗体的磁微粒的悬浮液。
2.根据权利要求1所述的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，其特征在于：所述的碱性磷酸酶标记的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位抗体由碱性磷酸酶与游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位抗体通过交联剂琥珀酰亚胺基-4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧化物和2-亚氨基四氢噻吩连接构成。
3.根据权利要求1所述的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位的纳米磁微粒化学发光测定试剂盒，其特征在于：所述的包被着荧光素抗体的磁微粒中，荧光素抗体与磁微粒之间化学偶联。
4.一种如权利要求1-3中任一项所述的试剂盒的制备方法，其包括分别制备所述的第一试剂、所述的第二试剂以及所述的磁分离试剂的步骤，其特征在于：所述的第二试剂的制备方法如下：
（1）使游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位抗体与交联剂2-亚氨基四氢噻吩在甘氨酸溶液中，室温静置反应，生成游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位抗体与2-亚氨基四氢噻吩的连接物，于2-8℃下保存备用；
（2）使碱性磷酸酶溶液与交联剂琥珀酰亚胺基-4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧化物溶液混合，室温静置反应，将反应液通过G-25凝胶柱除盐，将收集到的碱性磷酸酶与琥珀酰亚胺基-4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧化物的连接物于2-8℃下保存备用；
（3）将步骤（1）所得溶液与步骤（2）所得溶液按照游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位抗体与2-亚氨基四氢噻吩的连接物与碱性磷酸酶与琥珀酰亚胺基-4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧化物的连接物的摩尔比为1:1~2混合，在2-8℃下反应，使生成所述的碱性磷酸酶标记的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位抗体，反应结束，将反应液通过Supperdex200凝胶纯化柱纯化，选择合适的pH缓冲液调整浓度和pH值即得所述的第二试剂。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位抗体、所述的碱性磷酸酶的纯度均大于等于95wt%，且所述碱性磷酸酶的比活性超过
1000u/mg，所述碱性磷酸酶的缓冲液的浓度超过5mg/ml。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述的第一试剂的制备方法如下：配制含有荧光素的pH为9~10的缓冲液，然后按照荧光素与游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位抗体的分子比为20~200:1的比例，将所述含有荧光素的pH为9~10的缓冲液与游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位抗体混合，室温静置反应，将反应液通过G-25凝胶柱进行分离，除去游离的荧光素，获得荧光素标记的游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位抗体的溶液，接着用具有适当的pH值的缓冲液调整浓度和pH，即得所述第一试剂。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述的磁分离试剂的制备方法如下：
使含有羧基活性基团的磁微粒与荧光素抗体在偶联剂的存在下，室温反应2~12小时，反应结束，磁分离，去上清，用具有适当pH值的缓冲液调整pH和浓度，即得所述磁分离试剂。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述的磁微粒具有超顺磁性，其直径为0.5~2微米，每克磁微粒上所带的羧基活性基团的含量不低于0.4mmol；所述的荧光素抗体为单克隆抗体或多克隆抗体，纯度大于等于90wt%，稀释效价大于1:100万；所述的偶联剂为碳二亚胺。
9.一种采用如权利要求1所述的试剂盒用于定量检测血清或血浆样本中游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位的检测方法，该方法是基于磁微粒分离技术的化学发光免疫检测法，所述检测方法包括依次进行的免疫反应步骤、使用磁分离及洗涤设备对免疫反应的反应液进行洗涤的步骤以及向洗涤后的反应液内加入底物溶液并利用化学发光检测仪检测发光强度的步骤，其特征在于，该检测方法包括以下步骤：
（1）、免疫反应：在检测管中加入待测样本原液，然后加入第一试剂，混匀，25-40℃条件下进行第一次温育；
（2）、加入磁分离试剂，混匀，25-40℃条件下进行第二次温育；
（3）、多次洗涤；
（4）、加入第二试剂，混匀，25-40℃条件下进行第三次温育；
（5）、多次洗涤；
（6）、加底物溶液检测发光强度；
所述的底物溶液为碱性磷酸酶化学发光底物溶液。
10.根据权利要求9所述的定量检测方法，其特征在于：所述的第一次温育的时间为
5-15min，第二次温育的时间为3-10min，第三次温育的时间为5-15min。

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