同时鉴别β-内酰胺类抗生素耐药基因的GeXP多重PCR检测试剂盒及其引物组

1.同时鉴别β‑内酰胺类抗生素耐药基因的GeXP多重PCR检测引物组，其特征在于包括四对引物对：引物对A、引物对B、引物对C和引物对D，它们分别针对β‑内酰胺类抗生素耐药基因TEM、CTX‑M、SHV和bla‑CMY；每对引物包括上游引物和下游引物，每条引物由特异性嵌合引物在5’端添加相应GeXP通用引物构成；所述特异性嵌合引物分别为序列表中SEQ.ID.NO.9至SEQ.ID.NO.16所示的碱基序列。
2.根据权利要求1所述的GeXP多重PCR检测引物组，其特征在于：所述GeXP通用引物包括GeXP通用引物‑F和GeXP通用引物‑R，它们分别为序列表中SEQ.ID.NO.17至SEQ.ID.NO.18所示的碱基序列。
3.根据权利要求2所述的GeXP多重PCR检测引物组，其特征在于：所述四对引物对中的各条引物为等摩尔混合。
4.同时鉴别β‑内酰胺类抗生素耐药基因的GeXP多重PCR检测试剂盒，其特征在于含有权利要求1所述的GeXP多重PCR检测引物组。
5.根据权利要求4所述的GeXP多重PCR检测试剂盒，其特征在于包括PCR扩增缓冲液、引物对A、引物对B、引物对C和引物对D、MgCl2、DNA聚合酶和水。
6.根据权利要求5所述的GeXP多重PCR检测试剂盒，其特征在于所述四对引物对中的各条引物为等摩尔混合。
7.根据权利要求6所述的GeXP多重PCR检测试剂盒，其特征在于：所述各条引物的浓度均为10nM。
8.权利要求1所述GeXP多重PCR检测引物组或权利要求4所述GeXP多重PCR检测试剂盒在制备GeXP检测鉴定或辅助鉴定β‑内酰胺类耐药基因TEM、CTX‑M、SHV和bla‑CMY产品中的应用。

同时鉴别β‑内酰胺类抗生素耐药基因的GeXP多重PCR检测试\n剂盒及其引物组\n技术领域\n[0001] 本发明涉及抗生素耐药检测技术领域，尤其涉及同时鉴别β‑内酰胺类抗生素耐药基 因的GeXP多重PCR检测试剂盒及其引物组。\n背景技术\n[0002] 抗生素的发明和应用是人类在20世纪医药领域最伟大的成就之一。由于广谱抗菌药 的滥用，细菌耐药性的产生，给人类又造成了新的灾难。随着动物养殖业向规模化、集约 化方法发展，饲养密度提高，加上管理用药不合理，导致动物细菌性疾病的危害加重。动 物源食品也随之受到污染。近年来，由食源性致病菌引起的食物中毒在世界各地均有报道， 引发公共卫生安全问题。细菌耐药性是微生物对抗生素的一种自然反应，每一种抗生素进 入临床用药后随之而来的是细菌的耐药，这种耐药可能是天然的，也可能通过变异或者基 因转移获得，不同的抗生素有其主导的耐药机制。细菌耐药带来的问题日愈严重，随着分 子生物学技术的发展，细菌耐药性相关耐药基因陆续被鉴定。因此，要控制细菌耐药性， 不仅要合理使用抗生素，还应该建立细菌耐药性相关耐药基因监测网，准确系统连续地检 测本地细菌耐药情况，从而做好耐药趋势的追踪和控制。\n[0003] 细菌耐药性监测技术的发展对于控制细菌耐药性十分重要。常规的细菌耐药性检测方 法有K‑B法(药敏纸片扩散法)，MIC法(最小抑菌浓度法)和E‑test法等，这些方法对 细菌耐药性的检测有很重要的作用。然而，这些传统方法耗时长，操作繁琐，灵敏度低， 而且只能检测耐药表型不能检测耐药基因的流行规律，不能从根本上指导临床用药。因此， 急需建立一种高通量、快速、灵敏又能同时检测耐药表型和基因型的检测方法，以达到监 测和控制细菌耐药趋势的目的。\n[0004] 目前监测耐药基因的方法很多，如PCR技术、核酸杂交技术、基因芯片技术、质粒指 纹图谱、DNA序列测定技术等，其中单重PCR以及基于PCR技术衍生出的多重PCR的研究 报告最多，也具有一定的应用前景。PCR技术具有操作简便、快速、特异性强和敏感性高 等优点，但它检测的基因比较单一；多重PCR可同时检测几种目的基因，但需几对引物组 合在一起同时竞争性扩增，引物之间会产生相互干扰，多增加一对引物，敏感性就相应降 低。此外，PCR产物需通过琼脂糖电泳才可观察结果，该电泳难以区分50bp‑100bp以内的 条带，难以达到高通量检测目的。多重荧光PCR由于探针要标记不同发光波长的荧光基团， 如标记太多的荧光基团，相互会产生干扰。核酸杂交技术、基因芯片技术、质粒指纹图谱、 DNA序列测定等其他技术具有特异性好的特点，可操作过程繁琐，价格昂贵，远不能满足 临床需要，还需要大量的研究来克服目前分子生物学方法应用于临床的不足。因此，目前 急需建立一种同时可检测多种细菌耐药基因的高通量快速检测方法。\n[0005] GeXP系统(Gene Expression Profiler Genetic Analysis System)是美国Beckman Coulter公司研发的用于研究多基因表达定量分析的平台。GeXP多重PCR扩增采用荧光 标记通用引物和特异性嵌合引物(即基因特异性引物5’端连接通用引物序列)相结合引 发多重体系扩增。该技术可同时对30种目的基因进行检测分析，从而实现真正意义上的 高通量检测鉴别多种耐药基因的目的。\n[0006] β‑内酰胺类因其临床疗效突出、安全性好、品种多和选择面较广等优点而成为兽医 和人医临床应用最广的抗菌药物之一。不同时期或不同地区的细菌耐药情况有差异，联合 用药以期尽可能地弥补菌株对某一种或几种药物的耐药。β‑内酰胺类主要机制是产生β‑ 内酰胺类酶，介导这些酶的基因型主要为TEM、CTX‑M、SHV和bla‑CMY耐药基因，对这4 种基因的检测能反映细菌对β‑内酰胺类药物的耐药情况。\n发明内容\n[0007] 本发明要解决的技术问题是提供特异性好、灵敏度高、简便、高通量的同时鉴别β‑ 内酰胺类抗生素耐药基因的GeXP多重PCR检测试剂盒及其引物组。\n[0008] 为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：\n[0009] 同时鉴别β‑内酰胺类抗生素耐药基因的GeXP多重PCR检测引物组，包括四对引物对： 引物对A、引物对B、引物对C和引物对D，它们分别针对β‑内酰胺类抗生素耐药基因TEM、 CTX‑M、SHV和bla‑CMY；每对引物包括上游引物和下游引物，每条引物由特异性嵌合引物 在\n5’端添加相应GeXP通用引物构成；特异性嵌合引物分别具有序列表中SEQ.ID.NO.9至 SEQ.ID.NO.16的碱基序列。\n[0010] GeXP通用引物包括GeXP通用引物‑F和GeXP通用引物‑R，它们分别具有序列表中 SEQ.ID.NO.17至SEQ.ID.NO.18的碱基序列。\n[0011] 四对引物对中的各条引物为等摩尔混合。\n[0012] 同时鉴别β‑内酰胺类抗生素耐药基因的GeXP多重PCR检测试剂盒，含有上述的GeXP 多重PCR检测引物组。\n[0013] 上述GeXP多重PCR检测试剂盒，包括PCR扩增缓冲液、引物对A、引物对B和引物对C、引物对D、MgCl2、DNA聚合酶和水。\n[0014] 四对引物对中的各条引物为等摩尔混合。\n[0015] 各条引物的浓度均为10nM。\n[0016] 上述GeXP多重PCR检测引物组或GeXP多重PCR检测试剂盒在GeXP检测鉴定或辅助 鉴定β‑内酰胺类耐药基因TEM、CTX‑M、SHV和/bla‑CMY产品中的应用。\n[0017] 基于前期的工作基础，针对这β‑内酰胺类抗生素，并根据国内外的参考文献，发明 人选择这些抗生素最具代表的耐药基因进行组合进行研究。在对β‑内酰胺类抗生素的耐 药机制进行全面了解的基础上，根据本研究的目的和以下4个原则选择待扩增目的耐药基 因TEM、CTX‑M、SHV和bla‑CMY：①具有代表性，即所选的耐药基因应该是各类抗菌药物 不同类型耐药基因的代表；②与耐药表型有较强的相关性，即所选的耐药基因应该能在耐 药菌株中表达，并导致相关的耐药表型；③具有相对稳定性，即所选的耐药基因具有较明 显的保守区域，以便于引物设计和检测；④具有较低的同源性，即所选的各个耐药基因的 DNA序列要有明显差异，以确保PCR扩增的特异性。\n[0018] 据此，结合GeXP多重基因表达系统，发明人设计并合成了同时鉴别β‑内酰胺类抗生 素耐药基因的GeXP多重PCR检测引物组，包括四对引物对：引物对A、引物对B、引物对 C和引物对D，它们分别针对β‑内酰胺类抗生素耐药基因TEM、CTX‑M、SHV和bla‑CMY； 每对引物包括上游引物和下游引物，每条引物由特异性嵌合引物在5’端添加相应GeXP通 用引物构成；特异性嵌合引物分别具有序列表中SEQ.ID.NO.9至SEQ.ID.NO.16的碱基序 列。在此基础上，发明人进一步建立了相应GeXP快速检测方法及其试剂盒。实验证明， 使用本发明可同时检测β‑内酰胺类耐药基因TEM、CTX‑M、SHV和/bla‑CMY，具有简便快 速、特异性强、灵敏度高等特点，其灵敏度分别为10拷贝/μl、100拷贝/μl、10拷贝 /μl和100拷贝/μl，与药敏试验、测序等实验方法的鉴定结果相比，符合率达100％。 因此，本发明为常见的β‑内酰胺类耐药基因的检测提供了简便、高通量的检测试剂盒和 检测体系，更符合实际的需要。本发明研究从基因上了解广西地区细菌对β‑内酰胺类抗 生素的耐药情况，为调查耐药基因流行趋势提供一种全新的技术手段，应用前景广阔。\n附图说明\n[0019] 图1是应用本发明的TEM、CTX‑M、SHV和bla‑CMY耐药基因DNA混合模板的GeXP多 重PCR的毛细管电泳分析图。\n具体实施方式\n[0020] 为具体阐释本发明如何实施，以下结合实例进行详细说明。其中，所用实验方法如无 特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。\n[0021] 下述实施例中所用一些材料和试剂如下：\n[0022] 大肠杆菌O157(GX1、GX2)；沙门氏菌(SE28、CVCC533)；霍乱弧菌(KY448998、KY448999)； 李斯特菌(KY448997、KY449003)；空肠弯曲杆菌(KY449002)；副溶血弧菌(KY449000、 KY449001)；金黄色葡萄球菌(ATCC29213、ATCC43300)记载在“7种食源性致病菌GeXP 多重PCR检测方法的建立及其应用”，畜牧兽医学报，2020，51(10):2536‑2546和“2015 年南宁市动物源性食品中金黄色葡萄球菌污染状况及耐药调查”，中国食品卫生杂志， 2015，06:725‑729，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；\n[0023] TEM、CTX‑M、SHV和bla‑CMY耐药基因经上述细菌PCR检测后获得，测序上传，GenBank 登录号分别为MW554708、MW554707、MW535749和MW535747。公众可从广西壮族自治区兽 医研究所获得。\n[0024] 实施例1、引物对的设计\n[0025] 以GenBank公布的TEM、CTX‑M、SHV和bla‑CMY基因序列为参考，从NCBI上下载已 知序列使用DNASTAR软件进行序列比对，选取高度保守与特异的基因片段，由primer premier \n5.0软件设计了4种特异性引物，并在引物的5’端添加GeXP通用引物(下划线 标出的序列)，引物方向均为从5’‑3’端，具体如下：\n[0026] 1)、用以鉴定TEM的引物对A：\n[0027] A‑F:AGGTGACACTATAGAATA TTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACC(SEQ.ID.NO.1)；\n[0028] A‑R:GTACGACTCACTATAGGGA ACCGCTGTTGAGATCCAG(SEQ.ID.NO.2)；\n[0029] 预计扩增产物长度(即目的峰位置)为145bp。\n[0030] 2)、用以鉴定CTX‑M的引物对B：\n[0031] B‑F:AGGTGACACTATAGAATA AGCGATAACGTGGCGATGA(SEQ.ID.NO.3)；\n[0032] B‑R:GTACGACTCACTATAGGGA CCCGGAATGGCGGTGTTT(SEQ.ID.NO.4)；\n[0033] 预计扩增产物长度(即目的峰位置)为174bp。\n[0034] 3)、用以鉴定SHV的引物对C：\n[0035] C‑F:AGGTGACACTATAGAATA CGGCGACGCCCGCGACACCACTACC(SEQ.ID.NO.5)；\n[0036] C‑R:GTACGACTCACTATAGGGACGGCAGCACGGAGCGGATCAACGGT(SEQ.ID.NO.6)；\n[0037] 预计扩增产物长度(即目的峰位置)为194bp。\n[0038] 4)、用以鉴定bla‑CMY的引物对D：\n[0039] D‑F:AGGTGACACTATAGAATA TATCGCCAATAACCACCC(SEQ.ID.NO.7)；\n[0040] D‑R:GTACGACTCACTATAGGGA TGCCACTGTTTGCCTGTC(SEQ.ID.NO.8)；\n[0041] 预计扩增产物长度(即目的峰位置)为202bp。\n[0042] 根据实际检测的病原体的毒株不同以及GeXP系统(如GenomeLabTM GeXP Genetic Analysis System毛细管电泳仪)的误差，使用上述引物对A‑D及GeXP通用引物对检测 获得的实际扩增产物长度可在预计扩增产物的长度基础上下波动3bp。\n[0043] 实施例2、引物对的特异性检测\n[0044] 一、模板的制备\n[0045] 1、TEM、CTX‑M、SHV和bla‑CMY耐药基因DNA的获得\n[0046] 使用细菌DNA提取试剂盒(购自北京全式金生物技术有限公司，目录号为EE161)，按 照试剂盒说明书，分别从大肠杆菌O157(GX1、GX2)；沙门氏菌(SE28、CVCC533)；霍乱 弧菌(KY448998、KY448999)；李斯特菌(KY448997、KY449003)；空肠弯曲杆菌(KY449002)； 副溶血弧菌(KY449000、KY449001)；金黄色葡萄球菌(GX‑S‑1、GX‑S‑2)抽提细菌DNA， PCR检测TEM、CTX‑M、SHV和bla‑CMY耐药基因，获得阳性样本来自GX1、KY448998、 KY448999、KY448997、KY449003、KY449002、KY449000和KY449001。\n[0047] 2、测定核酸含量\n[0048] 用NanDrop ND‑2000微量核酸检测仪(赛默飞公司(美国))测定其OD值，得出其浓 度与纯度值，并以此控制核酸质量。\n[0049] 二、各引物对单重PCR的特异性检测\n[0050] 1、引物对A的特异性检测\n[0051] 1)PCR扩增\n[0052] 用引物对A对步骤一中1获得的TEM耐药基因DNA样品分别进行PCR扩增，反应体系 和反应程序如下：\n[0053] 反应体系(20μL)：GenomeLabTM GeXP Start Kit 5×PCR Buffer(含GeXP通用引物 对，美国贝克曼公司，PN A85017)4μL，引物对A(每条引物在反应体系中的终浓度为\n10nM)、 25mM MgCl2 4μL(美国贝克曼公司，PN A25395)、JumpStart Taq DNA Polymerase \n1.4μ L(美国SIGMA公司，D4184)，模板DNA 0.5pg‑0.5μg，加灭菌水至20μL。每个DNA设置 3个重复。\n[0054] 反应程序：95℃30s，55℃30s，72℃30s，10个循环；95℃30s，63℃30s， 72℃30s，10个循环；95℃30s，50℃30s，72℃30s，20个循环；4℃终止。\n[0055] 2)毛细管电泳\n[0056] 使用GenomeLab GeXP遗传分析系统对步骤1)的各PCR产物同时进行毛细管电泳检测， 操作步骤如下：\n[0057] 用甲酰胺为上样缓冲液(美国贝克曼库尔特公司，目录编号608082)，DNA size standard Kit‑400 Base Pairs(美国贝克曼库尔特公司，目录编号608098)与上样缓冲 液按体积比1:(80‑160)彻底混匀，在样品板上每孔加入39μL混匀好的液体，用PCR产 物进行\n10‑100倍稀释，取稀释后的产物1μL加至样品板，吹打混匀，最后在每孔滴入一 滴石蜡油封闭，以免甲酰胺氧化和样品蒸发。在缓冲液板上每孔加入2/3的缓冲液，进行 毛细管电泳。\n毛细管电泳的条件如下：毛细管升温：温度50℃；变性：90℃，120s；注入 样品：2.0KV，30s；\n分离：6.0KV，35min。利用GenomeLab GeXP遗传分析系统分析检测 结果。\n[0058] 结果：7种细菌的13份DNA样品有5份样品(KY448998、KY448999、KY448997、KY449003 和KY449001)可扩增得到145bp±3bp的扩增产物，经测序证实，该扩增产物的序列为引 物对A的靶序列。同时分别扩增步骤一CTX‑M、SHV和bla‑CMY的DNA样品，以ddH2O为阴 性对照。结果表明：引物对A的特异性很好，可以特异检出TEM耐药基因。\n[0059] 2、引物对B的特异性检测\n[0060] 1)PCR扩增\n[0061] 用引物对B对步骤一中1大肠杆菌O157(GX1、GX2)；沙门氏菌(SE28、CVCC533)； 霍乱弧菌(KY448998、KY448999)；李斯特菌(KY448997、KY449003)；空肠弯曲杆菌 (KY449002)；副溶血弧菌(KY449000、KY449001)；金黄色葡萄球菌(GX‑S‑1、GX‑S‑2) 的DNA样品分别进行扩增，同时扩增TEM、SHV和bla‑CMY耐药基因，以ddH2O为阴性对 照，反应体系和反应程序与步骤1中1)方法相同。\n[0062] 2)毛细管电泳\n[0063] 与步骤1中2)方法相同。\n[0064] 结果：7种细菌的13份DNA样品有4份样品(GX1、KY448999、KY449003和KY449000， 可扩增得到174bp±3bp的扩增产物，经测序证实，扩增产物的序列为引物对B的靶序列； 非CTX‑M基因及阴性对照无任何扩增产物。结果表明，引物对B的特异性很好，可以特异 检出CTX‑M耐药基因。\n[0065] 3、引物对C的特异性检测\n[0066] 1)PCR扩增\n[0067] 用引物对C对步骤一中1的大肠杆菌O157(GX1、GX2)；沙门氏菌(SE28、CVCC533)； 霍乱弧菌(KY448998、KY448999)；李斯特菌(KY448997、KY449003)；空肠弯曲杆菌 (KY449002)；副溶血弧菌(KY449000、KY449001)；金黄色葡萄球菌(GX‑S‑1、GX‑S‑2) 的DNA样品分别进行PCR扩增，同时分别扩增步骤一获得的TEM、CTX‑M和bla‑CMY，以 ddH2O为阴性对照，反应体系和反应程序与步骤1中1)方法相同。\n[0068] 2)毛细管电泳\n[0069] 与步骤1中2)方法相同。\n[0070] 结果：7种细菌的13份DNA样品有6份样品(GX1、KY448998、KY448999、KY448997、 KY449003和KY449001)的DNA样品可扩增得到194bp±3bp的扩增产物，经测序证实，该 扩增产物的序列为引物对C的靶序列；非SHV基因及阴性对照无任何扩增产物。结果表明， 引物对C的特异性很好，可以特异检出SHV耐药基因。\n[0071] 4、引物对D的特异性检测\n[0072] 1)PCR扩增\n[0073] 用引物对D对步骤一中1的大肠杆菌O157(GX1、GX2)；沙门氏菌(SE28、CVCC533)； 霍乱弧菌(KY448998、KY448999)；李斯特菌(KY448997、KY449003)；空肠弯曲杆菌 (KY449002)；副溶血弧菌(KY449000、KY449001)；金黄色葡萄球菌(GX‑S‑1、GX‑S‑2) 的DNA样品分别进行PCR扩增，同时分别扩增步骤一获得的TEM、CTX‑M和SHV，以ddH2O 为阴性对照，反应体系和反应程序与步骤1中1)方法相同。\n[0074] 2)毛细管电泳\n[0075] 与步骤1中2)方法相同。\n[0076] 结果：7种细菌的13份DNA样品有4份样品(KY448999、KY448997、KY449003和 KY449001)的DNA样品可扩增得到202bp±3bp的扩增产物，经测序证实，该扩增产物的 序列为引物对D的靶序列；非bla‑CMY基因及阴性对照无任何扩增产物。结果表明，引物 对D的特异性很好，可以特异检出bla‑CMY耐药基因，以ddH2O为阴性对照，反应体系和 反应程序与步骤1中1)方法相同。\n[0077] 三、4种引物对混合的特异性检测\n[0078] 1)将引物对A、B、C和D同时加入同一个PCR反应体系，分别对步骤一获得的TEM、 CTX‑M、SHV和bla‑CMY耐药基因，以ddH2O为阴性对照，反应体系和反应程序如下：\n[0079] 反应体系(20μL)：GenomeLabTM GeXP Start Kit 5×PCR Buffer(含GeXP通用引物 对，美国贝克曼公司，PN A85017)4μL，引物对A、B、C、D(各引物对中的每条引物在反 应体系中的终浓度均为10nM)、25mM MgCl2 4μL(美国贝克曼公司，PN A25395)、JumpStart Taq DNA Polymerase 1.4μL(美国SIGMA公司，D4184)，模板cDNA或DNA 0.5pg‑0.5μg， 加灭菌水至20μL。每个cDNA/DNA设置3个重复。\n[0080] 反应程序：95℃30s，55℃30s，72℃30s，10个循环；95℃30s，63℃30s， 72℃30s，10个循环；95℃30s，50℃30s，72℃30s，20个循环；4℃终止。\n[0081] 2)毛细管电泳：与“步骤二”中的“步骤1中2)”相同。\n[0082] 结果：4种引物对A‑D混合后分别对4种耐药基因(TEM、CTX‑M、SHV和bla‑CMY) 的单一模板DNA样品检测，分别检出了143bp、175bp、194bp和202bp的扩增产物，阴性 对照无任何扩增产物。上述结果表明：引物对A‑D混合后对各引物对的特异性无影响，可 用于特异地检出TEM、CTX‑M、SHV和bla‑CMY耐药基因。\n[0083] 因此，引物对A‑D、含有引物对A‑D的PCR试剂或含有引物对A‑D的PCR试剂盒均可 用来对待测样本进行GeXP检测，从而判断待测样本是否含有TEM、CTX‑M、SHV和bla‑CMY 耐药基因。\n[0084] 为方便基层检测工作，可参照上述反应体系组装试剂盒：每20μL PCR试剂由5×PCR Buffer、引物对A‑D(终浓度均为10nM)、25mM MgCl2(终浓度为5mM/μL)4μL、Taq DNA聚 合酶1.4μL(终浓度为0.175unit/μL)；模板cDNA或DNA，其余为灭菌水。\n[0085] 使用时，根据检测结果按如下判断待测样本是否含有对应的耐药基因：\n[0086] 若引物对A的扩增产物为145bp±3bp，则待测样本中含有TEM耐药基因；\n[0087] 若引物对B的扩增产物为174bp±3bp，则待测样本中含有CTX‑M耐药基因；\n[0088] 若引物对C的扩增产物为194bp±3bp，则待测样本中含有SHV耐药基因；\n[0089] 若引物对D的扩增产物为202bp±3bp，则待测样本中含有bla‑CMY耐药基因。\n[0090] 实施例3、引物对的灵敏度检测\n[0091] 一、制备含靶基因的单克隆质粒标准品\n[0092] 分别以实施例2中步骤一获得的TEM、CTX‑M、SHV和bla‑CMY耐药基因的DNA样品为 模板，将PCR扩增获得的TEM、CTX‑M、SHV和bla‑CMY的基因DNA片段，分别与质粒pMD 18‑T vector连接(购自大连宝生物公司)连接，获得4种重组质粒PA、PB、PC和PD，经测序 证实这4种重组质粒为质粒pMD 18‑T vector分别插入了一种上述基因的重组质粒，且分 别可作为上述4种引物对A‑D的靶基因。\n[0093] 利用NanDrop ND‑2000微量核酸检测仪测定各含靶基因重组质粒的浓度，并根据重组 质粒的分子量和浓度计算相应的拷贝数。将高浓度的各重组质粒分别稀释成靶基因\n6 5 4 3 2 1\n浓度为 10、10 、10 、10、10、10拷贝/μL的单一质粒稀释液。将各重组质粒混合，制成在混\n5 4 3 2\n合 溶液中各质粒的浓度均为10拷贝/μL的混合液，再按10倍比稀释为10 、10、10拷贝/μL 的混合质粒稀释液。\n[0094] 二、3种引物对混合的灵敏度检测\n[0095] 1.将引物对A‑D进行等摩尔混合，不同浓度的不同单一质粒稀释液为模板，按照实施 例2中步骤三的方法进行PCR扩增和电泳检测；结果，检测TEM的灵敏度为10拷贝/μL， 检测CTX‑M的灵敏度为10拷贝/μL，检测SHV的灵敏度为10拷贝/μL，检测bla‑CMY的灵 敏度为\n100拷贝/μL。\n[0096] 2.以引物对A‑D混合为引物，不同浓度的混合4种质粒稀释液为模板，按照实施例2 中步骤三的方法进行PCR扩增和电泳检测；结果，检测TEM的灵敏度为10拷贝/μL，检测 CTX‑M的灵敏度为100拷贝/μL，检测SHV的灵敏度为10拷贝/μL，检测bla‑CMY的灵敏 度为100拷贝/μL。\n[0097] 实施例4、引物对检测的准确率\n[0098] 分别取经分离培养、生化试验和血清学鉴定等常规实验方法及经测序鉴定为大肠杆菌 O157、沙门氏菌、霍乱弧菌、李斯特菌、空肠弯曲杆菌、副溶血弧菌和金黄色葡萄球菌(按 照实施例2中步骤一的方法分别提取DNA)，PCR检测得到含TEM、CTX‑M、SHV和bla‑CMY 的耐药基因的细菌，按照实施例2中步骤三的方法分别对上述单一病原体的DNA样品、上 述\n3种病原体DNA样品的混合模板进行PCR扩增和电泳检测，具体结果如下：\n[0099] 1、4种单一耐药基因的DNA样品均可检出相应目的峰，无其他杂峰，与上述测序、PCR 等常规实验方法的检测结果相符合。\n[0100] 2、模拟临床感染\n[0101] 从上述4种耐药基因的DNA样品两两的DNA混合分别试验，经实施例2中步骤三的方 法检测，均可检测相应耐药基因，无其他杂峰，与实际相符。\n[0102] 3、4种耐药基因混合\n[0103] 如图1所示，可检出4个目的峰，无其他杂峰，表明检测样品中含有TEM、CTX‑M、SHV 和bla‑CMY的基因的DNA模板，与实际相符。