胞外基质信号分子

1.分离的具有序列4所示氨基酸序列的多肽，及与其有至少91％相似 性并包含38个半胱氨酸的其生物学活性片段，类似物，或衍生物，所述片 段、类似物、或衍生物具有ECM信号分子活性。
2.权利要求1的多肽及其片段、类似物、或衍生物，所述片段、类似物、 或衍生物包含序列4的163到229位氨基酸残基。
3.权利要求1的多肽及其片段、类似物、或衍生物，所述片段、类似物、 或衍生物包含序列4的170到185位氨基酸残基。
4.权利要求2或3的多肽及其片段、类似物、或衍生物，其中上述多肽 是免疫原性的。
5.权利要求2或3的多肽及其片段、类似物、或衍生物，其中上述多肽 是共价修饰的。
6.权利要求5的多肽及其片段、类似物、或衍生物，其中上述共价修饰 包括聚乙二醇的共价结合。
7.权利要求5的多肽及其片段、类似物、或衍生物，其中上述修饰是与 一种不同多肽的全部或部分融合。
8.一种抗体，其专一结合权利要求1-7之一的多肽。
9.权利要求8的抗体，其中上述抗体是一种单克隆抗体。
10.药物组合物，含有生物学有效量的权利要求1-7之一所述多肽和一 种药学可接受佐剂，稀释剂或载体。
11.一种分离的多核苷酸，其编码具有序列4所示氨基酸序列的多肽。
12.权利要求11的多核苷酸，其中上述多肽是人Cyr 61及其具有ECM 信号分子活性的片段，类似物或衍生物。
13.一种纯化的多核苷酸，它编码含有序列4所示氨基酸序列的多肽及 与其有至少91％相似性并包含38个半胱氨酸，且包含序列4的163到229 位氨基酸残基的其片段，类似物或衍生物，所述片段、类似物、或衍生物 具有ECM信号分子活性。
14.一种纯化的多核苷酸，它编码含有序列4所示氨基酸序列的多肽 及与其有至少91％相似性并包含38个半胱氨酸，且包含序列4的170到185 位氨基酸残基的其片段，类似物或衍生物，所述片段、类似物、或衍生物 具有ECM信号分子活性。
15.分离的权利要求13或14所述的多核苷酸，其中上述多核苷酸编码 序列4所示氨基酸序列的亚序列。
16.权利要求11的分离的多核苷酸，其具有序列3所示的序列。
17.一种分离的多核苷酸，其在严格条件下与依据权利要求11的多核 苷酸杂交。
18.一种载体，含有权利要求11-17任一项的多核苷酸。
19.宿主细胞，被权利要求11-17任一项的多核苷酸转化或转染。
20.制取Cyr 61多肽的方法，包括以下步骤：
(a)在合适的营养条件下培养权利要求19的宿主细胞；以及
(b)从上述宿主细胞或上述宿主细胞生长培养基中纯化上述多肽。
21.纯化人Cyr 61的方法，包括以下步骤：
(a)提供含人Cyr 61的生物材料；
(b)将上述生物材料暴露于从含有抗Cyr 61抗体和αvβ3整联蛋白的组 中选出的Cyr 61专一性分子；
(c)将上述人Cyr 61专一性结合到Cyr 61专一性生物分子；以及
(d)洗脱上述人Cyr 61，从而纯化上述人Cyr 61。
22.依据权利要求21的方法，其中上述生物材料的来源包括人细胞。
23.依据权利要求21的方法，其中上述人Cyr 61专一性生物分子是一 种抗人Cyr 61抗体。
24.一种筛选血管形成调节剂的方法，包括步骤：
(a)将第一份能够进行血管形成的生物样品与生物有效量的权利要求 1-7之一所述多肽及怀疑的调节剂接触；
(b)另外将第二份生物样品与权利要求1的多肽相结触，以便提供对 照；
(c)测量步骤(a)和(b)中产生的血管形成水平；以及
(d)比较步骤(c)中测得的血管形成水平，通过与步骤(b)中对照相比能 够改变血管形成水平的能力来确定血管形成调节剂。
25.权利要求24的方法，其中上述调节剂是一种血管形成抑制剂，并且 上述抑制剂是通过与步骤(b)中对照相比能够降低上述血管形成水平的能力 来确定。
26.权利要求24的方法，其中所述其片段，类似物或衍生物包含序列4 的163到229位氨基酸残基并具有ECM信号分子活性。
27.权利要求24的方法，其中所述其片段，类似物或衍生物包含序列 4的170到185位氨基酸残基并具有ECM信号分子活性。
28.一种筛选血管形成调节剂的方法，包括步骤：
(a)制备第一份含Cyr 61的移植物和第二份含Cyr 61及怀疑的Cyr 61 调节剂的移植物；
(b)将上述第一份移植物移植到实验动物的第一个角膜，并将上述第二 份移植物移植到上述实验动物的第二个角膜，
(c)测定上述第一和第二个角膜中血管的发育，
(d)比较步骤(c)中测量的血管发育水平，通过与上述第一个角膜中血管 发育相比能改变上述第二个角膜中血管发育水平的能力，来确定血管形成 的调节剂。
29.一种筛选软骨形成调节剂的方法，包括步骤：
(a)将一份能够进行软骨形成的生物样品与生物学有效量的权利要求 1-7之一所述多肽及怀疑的调节剂接触。
(b)另外将第二份能够进行软骨形成的生物样品与生物学有效量的权 利要求1-7之一所述多肽接触，从而提供对照；
(c)测定步骤(a)和步骤(b)产生的软骨形成水平；以及
(d)比较步骤(c)中测量的软骨形成水平，通过与步骤(b)中对照相比能 够改变软骨形成水平的能力，来确认软骨形成的调节剂。
30.依据权利要求29的方法，其中上述调节剂是一种软骨形成抑制剂， 并且上述抑制剂是通过与步骤(b)中对照相比能够降低上述软骨形成水平的 能力来确认。
31.筛选肿瘤发生调节剂的方法，包括步骤：
(a)诱导第一个肿瘤和第二个肿瘤；
(b)将含有生物学有效量的权利要求1-7之一所述多肽的第一生物样品 和怀疑的调节剂与第一个肿瘤接触；
(c)另外将生物学有效量的权利要求1-7之一所述多肽与上述第二个肿 瘤接触，以便提供对照；
(d)测定步骤(b)和步骤(c)产生的肿瘤发生水平；以及
(e)比较步骤(d)中测量的肿瘤发生水平，通过与步骤(c)中对照相比能 够改变肿瘤发生水平的能力来确认肿瘤发生的调节剂。
32.依据权利要求31的方法，其中上述调节剂是肿瘤发生的抑制剂， 并且上述抑制剂是通过与步骤(b)中对照相比能够降低上述肿瘤发生水平的 能力来确认。
33.Cyr 61抑制剂在制备用于治疗固相肿瘤的药物中的应用，所述药物 可以抑制肿瘤的新血管形成。
34.依据权利要求33的用途，其中上述抑制剂选自含有抑制剂肽和细 胞毒素的组中。
35.依据权利要求33的用途，其中上述抑制剂是一种结合到Cyr 61的 细胞毒素。
36.筛选细胞粘着调节剂的方法，包括步骤：
(a)制备一种适于细胞粘着的表面；
(b)分别将第一和第二份生物样品放置好，每一样品均能在上述表面上 进行细胞粘着，
(c)将第一份生物样品与一种怀疑的调节剂以及一种生物学有效量的 ECM信号分子相关生物材料接触，所述材料选自含有人Cyr 61，人Cyr 61 片段，人Cyr 61类似物，和人Cyr 61衍生物的组中，所述片段、类似物、 或衍生物具有ECM信号分子活性；
(d)另外将第二份生物样品与生物学有效量的ECM信号分子相关生物 材料接触，从而提供对照，其中所述材料选自含有人Cyr 61，人Cyr 61片 段，人Cyr 61类似物及人Cyr 61衍生物的组中，所述片段、类似物、或衍 生物具有ECM信号分子活性；
(e)测量步骤(c)和步骤(d)产生的细胞粘着水平；以及
(f)比较步骤(e)中测量的细胞粘着水平，通过与步骤(d)中对照相比能够 改变细胞粘着水平的能力来确定细胞粘着的调节剂。
37.筛选细胞迁移调节剂的方法，包括步骤：
(a)制成凝胶基质，其含有Cyr 61和怀疑的细胞迁移调节剂；
(b)制备含有Cyr 61的对照凝胶基质；
(c)将能够进行细胞迁移的内皮细胞接种到步骤(a)的凝胶基质和步骤 (b)的对照凝胶基质；
(d)培养上述内皮细胞；
(e)通过检查上述凝胶基质和上述对照凝胶基质内部的细胞，来测定细 胞迁移水平；
(f)比较步骤(e)中测定的细胞迁移水平，通过与对照凝胶基质中细胞迁 移水平相比能够改变凝胶基质中细胞迁移水平的能力，来确定细胞迁移的 调节剂。
38.依据权利要求37的方法，其中上述内皮细胞是人细胞。
39.依据权利要求37的方法，其中上述基质选自含有Matrigel，胶原， 和血纤蛋白的组中。
40.依据权利要求37的方法，其中上述检查步骤包括显微镜镜检。
41.筛查细胞迁移的体外方法，包括步骤：
(a)制成第一片凝胶化滤膜和第二片凝胶化滤膜，每片滤膜有两个面；
(b)将上述每一滤膜的第一个面与能够进行细胞迁移的内皮细胞接触， 从而将上述细胞粘着到上述每一滤膜；
(c)将权利要求1-7之一的多肽和怀疑的细胞迁移调节剂加到上述第一 片凝胶化滤膜的第二个面，并将权利要求1-7之一的多肽加到上述第二片凝 胶化滤膜的第二个面；
(d)培养上述每一片滤膜；
(e)测定上述每一滤膜第二面上的细胞；以及
(f)将上述第一片凝胶化滤膜的第二面上存在的细胞与上述第二片凝 胶化滤膜第二面上存在的细胞相比较，通过与上述第二片凝胶化滤膜上测 量的细胞迁移相比，能改变上述第一片凝胶化滤膜上测量的细胞迁移水平 的能力，来确定细胞迁移的调节剂。
42.依据权利要求41的方法，其中上述内皮细胞是人微血管内皮细胞。
43.依据权利要求41的方法，其中上述多肽是人Cyr 61。
44.依据权利要求41的方法，进一步包括将上述每一滤膜置于Boyden 槽中的步骤。
45.血管形成有效量的人Cyr 61在制备用于诱导组织中伤口愈合的药物 中的用途。
46.含有控制表达序列的核酸在制备用于诱导组织中伤口愈合的药物 中的用途，所述控制表达序列与权利要求1-7之一的多肽可操作地联结。
47.依据权利要求46的用途，其中上述多肽是人Cyr 61。
48.依据权利要求46的用途，其中上述核酸包括一个选自含有疱疹病 毒，腺病毒，腺相关病毒，巨细胞病毒，杆状病毒，逆转录病毒和痘苗病 毒的组中的载体，且上述载体含有权利要求1-7之一的多肽的编码区。
49.依据权利要求46的用途，其中上述伤口组织选自包括皮肤组织和 肺上皮组织的组中。
50.Cyr 61在制备用于促进器官再生的药物中的用途。
51.Cyr 61在制备用于改善组织移植术的药物中的用途，其可有效增进 组织移植物新血管形成速率。
52.权利要求1-7之一的多肽在制备用于促进骨移植的药物中的用途。
53.权利要求1-7之一的多肽在制备用于促进假体移植的药物中的用 途。
54.筛选细胞增殖调节剂的一种方法，包括步骤：
(a)将第一份能够进行细胞增殖的生物样品与怀疑的调节剂和生物学 有效量的ECM信号分子相关生物材料相连接，其中所述材料选自包括人 Cyr 61，人Cyr 61片段，人Cyr 61类似物和人Cyr 61衍生物的组中，所述 片段、类似物、或衍生物具有ECM信号分子活性；
(b)另外将第二份生物学样品与生物学有效量的ECM信号分子相关生 物材料相连接，从而提供对照，其中所述材料选自包括人Cyr 61，人Cyr 61 片段，人Cyr 61类似物，和人Cyr 61衍生物的组中，所述片段、类似物、 或衍生物具有ECM信号分子活性；
(c)培养上述第一和第二份生物学样品；
(d)测定步骤(c)中产生的细胞增殖水平；以及
(e)比较步骤(d)中测量的细胞增殖水平，通过与步骤(b)中对照相比较 能够改变细胞粘着水平的能力来确定细胞增殖调节剂。
55.在培养物中扩增未分化造血干细胞种群的方法，包括步骤：
(a)从供体获取造血干细胞；以及
(b)在合适的营养条件下及存在生物学有效量Cyr 61的条件下培养上 述细胞。
56.筛选促细胞分裂剂的方法，包括步骤：
(a)将能够进行细胞增殖的细胞铺平板；
(b)将第一部分上述细胞与含有Cyr 61和怀疑的促细胞分裂剂的溶液 相接触；
(c)将第二部分上述细胞与含有Cyr 61的溶液相接触，从而提供对照；
(c)培养上述细胞；
(d)测定上述第一部分细胞和第二部分细胞的生长；以及
(e)比较上述第一部分和第二部分细胞的生长，通过与上述第二部分细 胞生长相比能够诱导上述第一部分细胞更强生长的能力，来确定促细胞分 裂剂。
57.依据权利要求56的方法，其中上述细胞选自包括内皮细胞和成纤 维细胞的组中。
58.依据权利要求56的方法，进一步包括将上述第一部分和第二部分 细胞与核酸标记相连接，并在上述细胞中测定上述核酸标记的存在。
59.依据权利要求58的方法，其中上述核酸标记是[3H]-胸苷。
60.试剂盒，含有依据权利要求2或3的多肽。
61.权利要求8的抗体，其在序列4的163到229位氨基酸残基内结 合。
62.权利要求8的抗体，其在序列4的170到185位氨基酸残基内结 合。
63.特异性结合融合蛋白的抗体，所述融合蛋白包含序列4的序列。
64.权利要求8的抗体，其中所述抗体还包含标记。
65.权利要求64的抗体，其中所述标记选自酶，蛋白，肽，抗原，抗 体，凝集素，碳水化合物，生物素，抗生物素蛋白，放射性同位素，毒素 和重金属。
66.权利要求8或63-65任一项的抗体，其中所述抗体是人源化抗体。
67.权利要求8或63-65任一项的抗体，其中所述抗体是CDR移植抗 体。
68.权利要求8或63-65任一项的抗体，其中所述抗体是嵌合抗体。
69.权利要求8或63-65任一项的抗体，其中所述抗体是抗体片段。
70.权利要求8或63-65任一项的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
71.权利要求8或63-65任一项的抗体，其中所述抗体是多克隆抗体。
72.药物组合物，其包含权利要求8或63-65任一项的抗体，以及药用 可接受助剂，稀释剂，或载体。
73.试剂盒，包含权利要求8或63-65任一项的抗体。
74.检测样品中人Cyr61的表达改变的方法，包括：
a.将样品与权利要求8或63-65任一项的抗体接触；
b.测定所述抗体与所述样品的结合；
c.将步骤(b)的结合与对照对比，从而通过步骤(b)的结合与对照间的差 异证实人Cyr61的表达改变。
75.权利要求74的方法，其中所述样品得自需要观察Cyr61的表达的 病人。
76.权利要求72的组合物在制备用于治疗血管疾病的药物中的用途。
77.权利要求72的组合物在制备用于抑制癌症的药物中的用途。

                            发明领域\n本发明目的涉及胞外基质信号分子-与对生长因子的细胞反应有关的 多肽的材料和方法。更特定地，本发明目的在于Cyr61-，Fisp12-及CTGF -相关的多核苷酸，多肽，其组合物，纯化这些多肽的方法，以及使用这些 多肽的方法。\n                            发明背景\n多肽生长因子紧密调节哺乳动物细胞的生长。在成年动物中，大多数细 胞是代谢活性的但其细胞分裂是静止的。在特定条件下，这些细胞可受刺激 重新进入细胞周期并分裂。当静止细胞重新进入活性生长和细胞周期的分裂 期时，迅速激活了一些特定基因，立即早期基因。重新进入活性细胞周期必 须是紧密调节的，因为这种控制的障碍能导致非控制生长，常可辨认为癌。 特定的细胞可控的重新进入生长期对诸如血管形成(例如血管生长和修复)， 软骨形成(例如骨胳发育和假体同化(prosthesis integration))，肿瘤发生(例如癌 细胞转移和肿瘤新血管形成)和其它生长-需要的过程的生物学过程是重要 的。\n血管形成，从已存在的血管的内皮细胞形成新的血管，是一个复杂的过 程，涉及与细胞迁移，增殖和分化有关的内皮细胞基因表达的变化的分布。 血管形成始于父血管(parent vessel)基底膜的局部解离。在体内，基底膜(主要 由层粘连蛋白，IV型胶原，巢蛋白，和蛋白聚糖组成)支持内皮细胞并提供 屏障将这些细胞与下面的基质隔开的屏障。基底膜也影响多种生物学活性， 包括在发育和分化中的细胞粘着，迁移和生长。\n在基底膜解离后，至少部分由于趋化梯度，内皮细胞从父血管迁移到间 质的胞外基质(ECM)。迁移的内皮细胞形成毛细芽，并延伸。这种延伸是新 芽中的细胞迁移和增殖的结果。位于毛细芽顶部的细胞向血管形成刺激物迁 移，但并不合成DNA，也不分裂。同时，在这些顶部细胞后面，其它内皮 细胞进行快速增殖以保证充分供应用于形成新血管的内皮细胞。毛细芽此后 在顶端分枝，分枝吻合或相互连接形成腔，重建基底膜，并构建血管连接引 导血流。\n在血管形成中发生了至少三种内皮细胞功能的变更；1)与ECM相互作 用的调节，这需要改变细胞-基质联系和产生基质降解性蛋白酶；2)内皮细 胞迁移中的初始增长及随后的降低，影响细胞向血管形成刺激物转位；以及 3)细胞增殖的瞬时增长，提供用于生长和延伸血管的细胞，以及在血管形成 后随即恢复到静止细胞状态。这三种功能分别认为是附着，趋化，以及促细 胞分裂相互作用或反应。因而，控制血管形成需要干涉三种独特的细胞活性： 1)细胞附着，2)细胞迁移，以及3)细胞增殖。另一个包括相似的细胞活性复 杂排列的生物学过程是软骨形成。\n软骨形成是引起骨骼组织的细胞过程，包括骨和软骨的发育。软骨形 成，类似于血管形成，涉及由静止细胞可控重新进入细胞周期的生长期。生 长期转换与改变的细胞粘着特性，变化的细胞迁移模式，及瞬时增加的细胞 增殖相关。软骨形成包括通过原始未分化间充质细胞的软骨形成能力的初始 发育(即，原分化态)。此阶段包括软骨细胞特异性标记的产生，而不具有产 生典型软骨ECM的能力。随后，细胞形成产生软骨特异ECM的能力，由于 它们分化成软骨细胞。Langille，Microscop.Res.& Tech.28：455- 469(1994)。然后软骨细胞迁移，粘着，及增殖促成了骨和软骨，骨架的发育。 参与软骨形成过程的细胞的程序发育的不正常细节导致骨骼缺陷，表现为从 面貌缺陷到危及生命疾病的问题。\n与血管形成和软骨形成类似，肿瘤发生也表征为细胞粘着，迁移，和增 殖的改变。迁移的癌细胞显示改变的粘着和迁移特性。肿瘤块的建立需要细 胞增殖的增加以及在肿瘤新血管形成中表征血管形成的细胞特性的详细描 述。\n血管形成或软骨形成的不正常进展，或仅仅肿瘤发生的进展，实际上损 害了患病个体的生活质量并增加了现代健康护理的费用。这些复杂生物学过 程中共同的特征，包括变化的细胞粘着，迁移，和增殖，暗示能够影响所有 这三种细胞活性的药剂将能有效筛查和调节上述复杂生物学过程。虽然本技 术领域已知影响单独的细胞活性的试剂，例如，整联蛋白和选择蛋白(细胞粘 着)，趋化因子(细胞迁移)，以及多种生长因子或细胞因子(细胞增殖)，直至 最近并未确认对人体所有三种细胞活性均产生影响的药剂。\n鼠Cyr 61(富半胱氨酸蛋白)是一种在活性生长和分裂细胞中表达的可能 影响这些三种细胞活性的蛋白质。RNA酶(RNase)保护测定显示编码鼠Cyr 61的基因，鼠cyr 61在发育的鼠胚胎中转录。O′Brien et al.，Cell Growth & Diff.3：645-654(1992)。原位杂交测定显示鼠胚胎发育中Cyr 61的表达与从 外胚层，中胚层衍生软骨细胞的间充质细胞的分化密切相关。此外，在发育 的循环系统的管壁中也表达Cyr 61。这些观察表明鼠Cyr 61是在细胞增殖 和分化中表达的，这是涉及控制细胞生长周期的调控级联系统的基因表达的 特征。\n由于不能纯化有用量的蛋白，阻碍了对Cyr 61多肽的进一步表征。通过 从真核或原核细胞过量表达纯化定量Cyr 61的努力失败了。Yang，芝加哥伊 利诺伊大学，博士论文(1993)。与尝试获得有用量的Cyr 61有关的一个问题 是由于过量表达Cyr 61导致哺乳动物生长速率的降低。另一个与Cyr 61纯 化有关的问题是，当使用重组DNA技术在细菌中表达富半胱氨酸多肽时， 常出现不可溶蛋白质团。尽管如此，Cyr 61已表征为349个氨基酸的多肽， 含有39个半胱氨酸残基，一个疏水的推断的N末端信号序列，以及可能的 N-联糖基化位点(Asn28和Asn225)。Grotendorst等，美国专利号 5,408,040，第3栏，41-54行，以参考文献(′040专利)并于此处。\n近来，已表征了与Cyr 61相关的一些蛋白。例如，鉴定了一种人源蛋白， 结缔组织生长因子(CTGF)。(参看专利′040)。CTGF在诸如成纤维细胞和内 皮细胞(专利′040，第5栏，62-64行)等活性生长细胞中表达，具有与Cyr  61相同的表达模式。在功能上，由于宣称其基本生物学活性是促细胞分裂活 性，(专利′040，第2栏，25-27行及53-55行)，CTGF被描述为蛋白质 生长因子。此外，报道了CTGF显示趋化活性。专利′040，第2栏，56-59 行。在结构方面，已公开了编码CTGF的多核苷酸序列，及CTGF的氨基酸 序列分别是专利′040的序列7和序列8。\n另一个显著相关的蛋白是鼠蛋白Fisp 12(成纤维细胞分泌蛋白)。已对 Fisp 12进行了氨基酸序列测定，揭示其一级结构富含半胱氨酸。Ryseck et.a1.， Cell Growth & Diff.2：225-233(1991)，以参考文献并于此处。这种蛋白 质亦含有一段疏水的N末端序列，暗示为分泌蛋白信号序列的特征。\n包括Cyr 61，Fisp 12，CTGF及其它蛋白质的序列测定促使确定了一 个富半胱氨酸分泌蛋白家族。该家族的成员具有由显示相似序列的基因编码 的相似一级结构。在这一出现家族中的每种蛋白质进一步由存在疏水性N末 端信号序列和在分泌形式的蛋白中有38个半胱氨酸表征。至今确认的该家族 成员包括上述的Cyr 61(人或鼠)，Fisp 12(鼠)，和CTGF(Fisp 12的人类直向 同源)，以及CEF 10(鸡)，和Nov(鸟类)。\n能够影响细胞粘着，迁移和增殖特性的纯化蛋白的各种用途中的一个包 括产生稳定的，长期的来自体内的造血干细胞培养物。进行了高剂量化疗的 病人血细胞生成受到抑制；干细胞的扩展，其成熟为多种造血谱系，以及成 熟细胞迁移到循环血中，正常需要很多个星期才能完成。对于这些病人，以 及其它需要造血细胞移植的人，向这些病人中引入在培养物中操作和扩展的 自身干细胞是有利的。这些造血干细胞(HSC)表达CD 34干细胞抗原，但不 表达谱系定型抗原(lineage commitment antigen)。这些细胞可逐步产生所有血 细胞谱系(例如，红细胞，淋巴细胞，和中幼粒细胞)。\n能够起始和维持长期培养物的造血祖细胞(即，长期培养物系统起始细胞 或LTC-IC)代表一种干细胞原代种群。已建立的LTC-IC频率在正常人 骨髓中是每104细胞中1-2个，在高度纯化的CD34+亚种群中只有大约每 50-100个细胞中一个。因而，具有用于维持和扩展原始多能性人HSC的 长期细胞培养物的方法和系统是有用的，用于体内重建造血系统。\n血细胞生成的细胞培养模型揭示看来在造血过程中具有重要功能的多 种细胞因子，包括多种集落刺激因子，白介素，干细胞因子，以及C-kit 配体。然而，在来自体内的培养物中，这些细胞因子的不同组合有利于不同 类型的定型祖先的扩展。例如，在索血浆中的一种因子增强粒细胞-红细胞 -巨噬细胞系-巨核细胞集落形成单位(CFU-GEMM)祖先的扩展，但这些 培养物中的扩展有助于细胞的更成熟的部分(subset)。因而，很难建立一个模 仿体内血细胞生成的培养系统。\n一个HSC培养系统应当能维持和扩展大量的多能干细胞，它们能长期 重建种群并在适当引导下最终谱系定型。然而，在多数来自体内的培养物系 统，含有LTC-IC的部分细胞种群连续培养时稳定衰减，当培养物由不再 有多能性的血细胞生成祖细胞的更成熟子代形成种群时，常在几个星期后降 至初始水平的20％。此外，单独的LTC-IC表现的增殖能力可能变化很大。 因而，HSC培养物系统在现有技术上存在的一个需要包括维持和促进诸如 LTC-IC的细胞的多能性能力的生物学药剂。除了在形成来自体内的HSC 培养物中的功用之外，影响细胞粘着，迁移和增殖的生物学药剂在多种其它 方面也是有用的。\n加强促细胞分裂剂的活性但其本身不具有促细胞分裂活性的蛋白质可 能作为信号分子在诸如血细胞生成等过程中起着重要作用。此外，这些信号 蛋白也可用作探针寻找另外的促细胞分裂剂，因为它们中的许多都未确认或 表征。多种本身不是促细胞分裂剂的生物学因子显示能加强其它因子的促细 胞分裂活性。这些增强剂中的一些是与细胞表面和/或胞外基质相联系的。这 一组中包括一种分泌性的碱性成纤维细胞生长因子-结合蛋白(bFGF-结合 蛋白)，基底膜蛋白质基底膜蛋白聚糖，以及人免疫缺陷病毒-1TAT蛋白， 每种蛋白能促进bFGF诱导的细胞增殖和血管形成。这一促细胞分裂增强剂 组中也包括血小板反应蛋白，能够激活潜伏形式的转化生长因子-β，以及 一种未确定的来自血管平滑肌细胞的分泌性生长增强因子(Nakano et al.，J. Biol.Chem.270：5702-2705[1995])，后一生长因子是有效激活表皮生长因 子或凝血酶诱导的DNA合成所需的。此外，B细胞刺激因子-1/白介素- 4，一种没有可证明的促细胞分裂活性的T细胞产物，能够1)增强粒细胞- 巨噬细胞祖细胞对粒细胞集落刺激因子的增殖反应，2)增强红细胞系祖细胞 对促红细胞生成素的增殖反应，以及3)与促红细胞生成素一起，诱导多能祖 细胞的集落形成。类似地，虽然白介素-7本身不具增殖效应，但能增强干 细胞因子诱导的由原代鼠骨髓祖细胞的集落形成。此外，已发现淋巴细胞生 长增强因子(LGEF)以剂量依赖方式增强促细胞分裂剂刺激的人外周血淋巴 细胞(PBL)或纯化的T细胞的增殖。单独使用LGEF不能刺激PBL或T细胞 增殖。\n因而，仍旧需要能够对一种或多种共同表征诸如血管形成，软骨形成， 及肿瘤发生的复杂生物学过程的特定功能产生一致的和协调的影响的生物学 制剂。此外，本技术领域还需要能够促进这些体内过程在来自体内环境中重 建，例如HSC培养物的形成的制剂。进一步，还需要工具，例如促细胞分裂 剂探针来寻找这些复杂过程的其余生物学组份，缺乏它们时会阻碍对这些过 程便利的调节和控制的努力。\n                        本发明的总结\n本发明提供了与胞外基质(ECM)信号分子有关的材料和方法。特别地， 本发明涉及编码ECM信号分子的多核苷酸及其片段或类似物，ECM信号分 子相关多肽及其片段，类似物和衍生物，涉及产生ECM信号分子的方法， 以及使用ECM信号分子的方法。\n本发明一方面涉及一种纯化和分离的含ECM信号分子的多肽。根据本 发明的多肽至少保留一种ECM信号分子生物学活性，例如刺激细胞粘着， 细胞迁移，或细胞增殖的能力；调节血管形成，软骨形成，或肿瘤生成的能 力；免疫原性或诱发一种免疫反应的能力；以及与具有ECM信号分子特异 结合位点的多肽，包括抗体和整联蛋白相结合的能力。多肽可以是天然的或 是重组分子。进一步，本发明包含全长ECM信号分子及其片段。此外，本 发明的多肽可以是未经衍生化的，或依据一种天然或非天然衍生化模式进行 衍生化的。本发明进一步扩展到具有天然或天然存在的氨基酸序列的多肽， 及其变体(即具有不同氨基酸序列的多肽)，类似物(即具有与常规氨基酸不同 的非标准氨基酸或其它结构改变的多肽)和同系物(即与另一多肽具有相同进 化祖先的多肽)。本发明细致考虑了与其它复合物诸如聚乙二醇，或其它蛋白 或肽(即形成融合蛋白)共价联结的多肽。\n实施例ECM信号分子包括哺乳动物Cyr 61，Fisp 12，和CTGF多肽。 除了ECM信号分子之外，本发明还包括与本发明中ECM信号分子特异结合 的多肽，诸如上述的抗体产品。多种抗体产品落入本发明的范围，包括多克 隆和单克隆抗体，抗体片段，嵌合抗体，CDR一移植抗体，“人源化”抗体， 及本技术领域已知的其它抗体。本发明亦考虑到诸如设计为可与ECM分子 活性位点结合从而抑制其活性的肽类，糖类或脂类等其它分子。此外，诸如 增强或促进ECM分子活性的肽类等分子亦在本发明范围内。本发明进一步 扩展到一种药物组合物，含有依据本发明的生物学有效量的多肽及药物可接 受佐剂，稀释剂或载体。“生物学有效量”是指生物物质的量足以引起与缺乏 生物物质的对照相比较的生物样品中的可检测到的反应。\n本发明另一方面涉及含有编码本发明多肽的序列的纯化和分离的多核 苷酸。依据本发明的多核苷酸可以是DNA或RNA，单链或双链，可以从天 然来源纯化和分离，或使用本技术领域已知的合成或重组技术产生。本发明 亦扩展到编码ECM分子的片段，类似物(即含有非标准核苷酸的多核苷酸)， 同系物(即与另一序列具有共同进化祖先的多核苷酸)，变体(即核苷酸序列不 同的多核苷酸)，及衍生物(即不涉及一级核苷酸序列的结构方式不同的多核 苷酸)的多核苷酸。亦考虑了含有依据本发明多核苷酸的载体。此外，本发 明包括用本发明的多核苷酸或载体转化或转染的宿主细胞。\n本发明的其它方面涉及制造和使用本发明多肽和/或多核苷酸的方法。 制造依据本发明的多肽的一种方法包括在合适的宿主细胞中表达编码依据 本发明多肽的多核苷酸并纯化多肽。制造本发明多肽的其它方法使用本技 术领域已知的技术，诸如分离纯化天然多肽或使用合成技术产生多肽。特 殊地，纯化诸如人Cyr 61的ECM信号分子的一种方法包括以下步骤，确定 含有Cyr 61的来源物，将来源物暴露于诸如抗人Cyr 61抗体等结合Cyr 61 的人Cyr 61特异性生物分子，并从抗体或其它生物分子洗脱Cyr 61，从而 纯化人Cyr 61。\n本发明另一方面是一种筛查血管形成调节剂的方法，包括以下步骤： (a)将第一份能进行血管形成的生物样品与生物有效(即血管形成有效)量的 ECM信号分子相关生物物质和一种怀疑的调节剂(抑制剂或增强剂)接触；(b) 单独地将第二份生物样品与生物有效量的ECM信号分子相关生物物质接 触，作为对照；(c)测定步骤(a)和(b)产生的血管形成水平；以及(d)将步骤(c) 中测定的血管形成水平相比较，从而通过它在与步骤(b)对照相比较时改变 血管形成水平的能力确定血管形成的调节剂。调节剂可以是血管形成的增 强剂或抑制剂，ECM信号分子相关生物物质包括但不限于Cyr 61或其片段， 变体，同系物，类似物，衍生物及抗体。\n本发明亦扩展到筛查一种血管形成调节剂的方法，包括以下步骤；(a) 制备一种含Cyr 61的移植物和第二种含Cyr 61和一种怀疑的Cyr 61血管形 成调节剂；(b)将第一片移植物移植到试验动物的一个角膜并将第二片移植 物移植到试验动物的第二个角膜；(c)测定第一和第二个角膜中的血管形成； 以及(d)比较步骤(c)中测得的血管形成水平，从而通过它在与第一个角膜中 血管形成相比较时改变第二个角膜中的血管形成水平确定血管形成的调节 剂。\n本发明另一方面涉及一种筛查软骨形成调节剂的方法，包括下列步骤： (a)将第一份能进行软骨形成的生物样品与生物有效(即软骨形成有效)量的 ECM信号分子相关生物物质和一种怀疑的调节剂接触；(b)单独地将第二份 能进行软骨形成的生物样品与生物有效量的ECM信号分子相关生物物质接 触，作为对照；(c)测定步骤(a)和(b)产生的软骨形成水平；以及(d)将步骤(c) 中测定的软骨形成水平相比较，从而通过它在与步骤(b)中对照相比较时改变 软骨形成水平的能力确定软骨形成的调节剂。调节剂可以是软骨形成的促进 剂或抑制剂；ECM信号分子包括以上所定义的以及诸如6磷酸甘露糖，肝 素，及肌腱蛋白等化合物。\n本发明亦涉及一种筛查肿瘤发生调节剂的体外方法，包括以下步骤：(a) 诱发第一和第二个肿瘤；(b)将生物有效量的ECM信号分子相关生物物质与 怀疑的调节剂施加到第一个肿瘤；(c)单独将生物有效量的ECM信号分子相 关生物物质施加到第二个肿瘤，作为对照；(d)测量步骤(b)和步骤(c)中产生的 肿瘤发生水平；以及(e)比较步骤(d)中测得的肿瘤发生水平，从而通过它在与 步骤(c)中对照相比较时改变肿瘤发生水平的能力确定肿瘤发生的调节剂。本 发明考虑的肿瘤发生调节剂包括肿瘤发生的抑制剂。可通过多种技术诱发肿 瘤，包括但不限于施用例如致癌剂的化学药品以及移植癌细胞。本发明的一 个相关方面是一种处理实体肿瘤的方法，包括将治疗有效量的Cyr 61抑制剂 施药给个体的步骤，从而抑制肿瘤的新血管形成。抑制剂包括，但不限于诸 如具有“RGD”基序的肽的抑制剂肽，以及细胞毒素，它可以是游离的或 是结合到诸如Cyr 61的分子。\n本发明又一方面涉及一种筛查细胞粘着调节剂的方法，包括下面步骤： (a)制备适于细胞粘着的表面；(b)分别将第一和第二份能进行细胞粘着的生物 样品置于表面上；(c)将第一份生物样品与怀疑的抑制剂和选自包括人Cyr  61，人Cyr 61片段，人Cyr 61类似物，和人Cyr 61衍生物的组中的生物学 有效量的ECM信号分子相关生物物质接触；(d)单独将第二份生物样品与选 自包括人Cyr 61，人Cyr 61片段，人Cyr 61类似物，及人Cyr 61衍生物的 组中的生物学有效量的ECM信号分子相关生物物质接触，从而提供了对照； (e)测定步骤(c)和(d)产生的细胞粘着水平；及(f)比较步骤(e)中测得的细胞粘着 水平，通过它与步骤(d)中对照相比能改变细胞粘着水平的能力确认细胞粘着 的调节剂。\n本发明亦扩展到筛查细胞迁移调节剂的方法，包括下面步骤：(a)制成含 有Cyr 61和怀疑的细胞迁移调节剂的凝胶基质；(b)制备含有Cyr 61的对照 凝胶基质；(c)将能够进行细胞迁移的内皮细胞接种到步骤(a)中的凝胶基质和 步骤(b)中的对照凝胶基质；(d)培养内皮细胞；(e)通过检查凝胶基质及对照凝 胶基质内部的细胞测定细胞迁移水平；(f)比较步骤(e)中测得的细胞迁移水 平，从而通过具有与对照凝胶基质中细胞迁移水平相比较改变凝胶基质中细 胞迁移水平的能力确定细胞迁移调节剂。内皮细胞包括但不限于人细胞，例 如人微血管内皮细胞。基质可由诸如Matrigel，胶原，或血纤蛋白，或其组 合的凝胶物质制成。\n本发明另一方面涉及一种筛查细胞迁移的体外方法，包括下面步骤：(a) 制成第一片和第二片凝胶化滤膜，每一滤膜有两面；(b)将每一滤膜的一个面 与内皮细胞接触，从而将细胞粘着到滤膜上；(c)将ECM信号分子和一种怀 疑的细胞迁移调节剂加到第一片凝胶化滤膜的第二个面，并将ECM信号分 子加到第二片凝胶化滤膜的第二个面；(d)培养每一滤膜；(e)检测每一滤膜第 二面上的细胞；以及(f)比较第一片凝胶化滤膜第二面上存在的细胞与第二片 凝胶化滤膜第二面上存在的细胞，通过与第二片凝胶化滤膜上测得的细胞迁 移相比能改变在第一片凝胶化滤膜上测得的细胞迁移水平的能力确定细胞迁 移调节剂。内皮细胞已在上面定义。ECM信号分子扩展到人Cyr 61，可将 每一滤膜置于诸如Boyden槽，包括改进的Boyden槽仪器中。\n本发明还包括筛查细胞迁移调节剂的一种体内方法，包括下面步骤：(a) 去除第一份生物相容性海绵的第一块中央部分并去除第二份生物相容性海绵 的第二块中央部分；(b)将ECM信号分子和怀疑的调节剂加到第一块中央部 分并将ECM信号分子加到第二块中央部分；(c)将第一块中央部分与上述第 一份生物相容性海绵重新结合并将上述第二块中央部分与第二份生物相容性 海绵重新结合；(d)将一片滤膜加到第一份生物相容性海绵的一侧并将第二片 滤膜加到第一份生物相容性海绵的另一侧；(e)将第三片滤膜加到第一份生物 相容性海绵的一侧并将第四片滤膜加到第二份生物相容性海绵的另一侧；(f) 将每一包括中央部分和滤膜的生物相容性海绵移植到试验动物；(e)在培养一 段时间后除下每一海绵；(f)测定每一生物相容性海绵中发现的细胞；以及(g) 将第一块生物相容性海绵中存在的细胞与第二块生物相容性海绵中存在的细 胞相比较，通过当与使用第二块生物相容性海绵测得的细胞迁移上比能够改 变使用第一块生物相容性海绵测得的细胞迁移水平的能力确定细胞迁移的调 节剂。ECM信号分子包括，但不限于人Cyr 61；ECM信号分子也可结合 到海昌(Hydron)。另外，筛查细胞迁移调节剂的体内方法可包括提供试验动 物放射标记并检测一个或多个海绵中的放射标记的步骤。\n本发明另一方面涉及一种调节止血的方法，包括将ECM信号分子加到 药物可接受佐剂，稀释剂或载体的步骤。本发明亦扩展到诱导组织伤口愈合 的方法，包括将伤口组织与生物学有效量的ECM信号分子接触从而促进伤 口愈合的步骤。ECM信号分子可以提供为ECM信号分子多肽形式或ECM 信号分子核酸方式，例如使用基因治疗技术。例如，核酸可包括可操作的与 ECM信号分子相联的表达控制序列，然后引入到伤口组织的细胞中。编码序 列的表达可由在表皮组织中可操作的诸如K14启动子的组织特异性启动子控 制，以影响伤口愈合的控制性诱导。核酸可包括诸如疱疹病毒，腺病毒，腺 相关病毒，巨细胞病毒，杆状病毒，逆转录病毒，及痘苗病毒的载体。适于 用本方法治疗的伤口组织包括但不限于表皮组织和肺上皮。一种相关方法包 括将生物学有效量的ECM信号分子，例如Cyr 61施加到动物中以促进器官 再生。损伤的器官可能是创伤，例如手术或疾病引起的。本发明的另一方法 涉及增进移植体例如皮肤移植的血管形成。本发明另一方法涉及一个促进骨 骼移植的过程，包括骨移植物。促进骨移植的方法包括将骨移植物或接受的 部位与生物学有效量(即软骨形成有效量)ECM信号分子接触的步骤。接触步 骤可通过将ECM信号分子加到生物相容性覆盖物诸如生物可降解纱布并将 覆盖物与骨移植物接触来进行，从而促进骨移植。骨移植物包括天然骨或其 片段，以及无生命的生物可容性天然和合成材料，诸如假体。除了直接将ECM 信号分子用于骨，假体，或接受的部位之外，本发明考虑了除纱布材料外可 使用基质材料用于ECM信号分子的可控制释放。\n本发明又一方面涉及一种筛查细胞增殖调节剂的方法，包括下面步骤： (a)将第一份能进行细胞增殖的生物样品与怀疑的调节剂及生物学有效(即促 细胞分裂有效)量的选自包括人Cyr 61，人Cyr 61片段，人Cyr 61类似物， 及人Cyr 61衍生物的组中的ECM信号分子相关生物物质接触；(b)单独将第 二份能进行细胞增殖的生物样品与生物学有效量的选自包括人Cyr 61，人 Cyr 61片段，人Cyr 61类似物，及人Cyr 61衍生物的组中的ECM信号分子 相关生物物质匀接触，从而提供了对照；(c)培养第一份和第二份生物样品； (d)测定从步骤(c)产生的细胞增殖水平；以及(e)比较步骤(d)中的细胞增殖水 平，从而通过与步骤(b)对照相比能改变细胞粘着水平的能力确定细胞增殖调 节剂。\n本发明亦包括在培养基中扩展未分化造血干细胞种群的方法，包括下面 步骤：(a)从供体获取造血干细胞；以及(b)在生物有效(即血细胞形成有效)量 Cyr 61存在的合适营养条件下培养上述细胞。\n依据本发明的另一方法是一种筛查促细胞分裂剂的方法，包括下面步 骤：(a)将能进行细胞增殖的细胞铺平板；(b)将第一部分细胞与含有Cyr 61 和怀疑的促细胞分裂剂的溶液接触；(c)将第二部分细胞与含有Cyr 61的溶液 相接触；从而提供对照；(c)培养细胞；(d)检测第一部分细胞和第二部分细胞 的生长；以及(e)比较第一和第二部分细胞的生长，从而通过与第二部分细胞 生长相比较诱导第一部分细胞更快生长确定促细胞分裂剂。细胞包括但不限 于上皮细胞和成纤维细胞。进一步，本方法可包括将细胞与核酸标记，例如 [3H]胞苷接触，并测定细胞中标记的存在。另一方法涉及增进组织移植，包 括向动物施加一定量的Cyr 61以有效增进移植物的新血管形成速度。\n本发明多种其它方面和优点可通过考虑下列图表和详细描述明显了 解。\n                     附图的简要说明\n图1显示了生长调节蛋白的富半胱氨酸蛋白家族成员的氨基酸序列比 较。\n                    本发明的详细描述\n在鼠中，发现Cyr 61蛋白影响细胞粘着，迁移，和增殖。在鼠成纤维细 胞中，编码Cyr 61的Cyr 61基因是由血清生长因子激活转录的立即早期基 因。Lau et al.，EMBO J.4：3145-3151(1985)，以参考文献并于此处；Lau et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)84：1182-1186(1987)，以参考文献并于 此处。鼠Cyr 61 cDNA编码序列陈述于序列1。(人Cyr 61 cDNA编码序列 提供于序列3)。鼠Cyr 61氨基酸序列陈述于序列2。(人Cyr 61氨基酸序列 显示于序列4)。Cyr 61是一种41千道尔顿(KDa)的多肽，含39个半胱氨酸 残基，约为组成未处理蛋白379氨基酸的大约10％。Yang et al.，Cell Growth & Diff2：351-357(1991)，以参考文献并于此处。研究表明鼠Cyr 61与 肝素结合并且是分泌的。Yang et al.与观察到的Cyr 61的分泌相一致的是， 从考察鼠Cyr 61 cDNA序列推导鉴别出新生Cyr 61的N端信号序列。Yang et al.此外，在培养表达Cyr 61的细胞的条件培养基中未发现Cyr 61，但发现伴 生于胞外基质(ECM)和细胞表面。Yang et al。已表征了结构类似的富半胱氨 酸哺乳动物蛋白。\nFisp 12，一种富半胱氨酸鼠蛋白，显示与Cyr 61的结构类似性。编码 Fisp 12的cDNA序列陈述于序列5，Fisp 12的氨基酸序列显示于序列6。 鼠Fisp 12，类似于Cyr 61，影响细胞粘着，增殖和迁移。人的Fisp 12同源 物是结缔组织生长因子(CTGF)，一种结构和功能类似于Cyr 61的蛋白。Fsip 12和CTGF与Cyr 61是可区别的。例如，在培养基中可发现与Cyr 61相比 更多的分泌的Fisp 12；相应地与Cyr 61相比有较少部分Fisp 12位于表达细 胞区域(细胞表面和附近的胞外基质)。本发明中包括ECM信号分子的蛋白之 间的其余相似之处与区别将在下面的陈述中变的明显。\n本发明包括多个方面，由下面的实施例说明。实施例1描述编码ECM 信号分子富半胱氨酸蛋白家族成员的多核苷酸的克隆；实施例2描述序列测 定；实施例3描述RNA测定；实施例4描述转基因动物的产生；实施例5 描述Cyr 61多肽的表达；实施例6描述Fisp 12多肽的表达；实施例7叙述 多肽纯化的方法；实施例8提供了本发明多肽的特征；实施例9公布了富半 胱氨酸蛋白家族成员多肽的肝素结合测定；实施例10涉及多肽的受体；实施 例11描述抗ECM信号分子抗体；实施例12涉及抑制性肽；实施例13描述 细胞粘着以及多肽为基础的影响细胞粘着过程的方法；实施例14描述多肽- 影响的成纤维细胞迁移；实施例15描述内皮细胞迁移以及迁移的体外检测； 实施例16描述内皮细胞迁移抑制剂的体外检测；实施例17描述内皮细胞迁 移的体内检测；实施例18描述可由本发明多肽增强的促细胞分裂剂；实施例 19描述体内测定角膜的血管形成因子和调节剂；实施例20涉及使用本发明 多肽影响血液凝结的方法；实施例21公布了将多肽用于来自体内的造血干细 胞培养；实施例22论述器官再生；实施例23描述软骨形成以及间充质细胞 胞外基质信号分子的表达；实施例24描述使用本发明多肽促进软骨形成过程 中的细胞粘着；实施例25描述软骨形成以及本发明多肽对细胞聚集的影响； 实施例26描述本发明多肽促进软骨形成过程中的细胞增殖；实施例27叙述 使用本发明多肽影响软骨形成的方法；以及实施例28提供了使用本发明多核 苷酸的遗传学方法。这些实施例是为了说明本发明而不应解释为限制本发明 的范围。\n                         实施例1\n                      多核苷酸克隆\n使用本技术领域标准技术，用鼠Cyr 61 cDNA序列为探针从人胎盘 cDND库中选出人Cyr 61 cDNA。参看Sambrook et al.，以参考文献并于此 处。已经描述了从BALB/C 3T3(ATCC CRL-1658)cDNA库中筛选全长鼠 Cyr 61 cDNA.O′Brien et al.，Mol.Cell.Biol.10：3569-3577(1990)，以参 考文献并于此处。鼠Cyr 61的核苷酸及推导的氨基酸序列存在于GenBank 数据库中，登记号为M32490。鼠Cyr 61的核苷酸序列列于序列1；鼠Cyr 61 的氨基酸序列列于序列2。\n使用λ gt 11(Promega Corp.，Madis on，WI)作为载体转染到大肠杆菌 (E.coli)并在LB琼脂上铺平板构建了人cDNA库。使用含有全长鼠Cyr 61编 码序列[按O′Brien et al.，(1990)编号，为核苷酸56-1560；参看序列1]的 克隆到pGEM-2(O′Brien et al.，[1990])的鼠cDNA表达构建体作为探针。 通过本技术领域标准方法将鼠cDNA探针进行放射性标记。Sambrook et al. 使用标准方法用鼠探针进行了噬斑筛选。Sambrook et al.\n更特别地，将上述含人cDNA库的琼脂平板暴露于置于每一平板上的硝 酸纤维膜(BA85，82毫米，Schleicher & Schuell，Keene，NH)。噬斑吸附后(大 约20分钟)，将滤膜取下并空气干燥大约30分钟。随后，将每一滤膜顺次浸 入0.2M NaOH，1.5M NaCl(100毫升)；2倍SSC，0.4M Tris-HCl， pH7.4(100毫升)；及0.2倍SSC(100毫升)30到60秒。然后将滤膜在室温下 干燥大约1小时以及在80℃真空干燥2小时。用放射标记的鼠Cyr 61 cDNA 探测滤膜。\n或者，用通过RT-PCR产生的探针确认人Cyr 61 cDNA克隆。特别地， 筛选人胎盘cDNA库的探针是用简并引物通过对数生长的WI 38细胞的总 RNA的RT-PCR产生的PCR片段。引物是从相应于鼠Cyr 61 cDNA开放 阅读框最保守区序列衍生的。一个命名为H61-5的引物[5′- GGGAATTCTG(TC)GG(GATC)TG(TC)TG(TC)AA(GA)GT(GC)TG-3′]，含 有除用于引入Ecor I位点的5′端“GGGAATTC”序列外，从陈述于序列1 的鼠Cyr 61序列核苷酸327-346(有义链)衍生的简并序列。简并性出现于 相应序列1密码子第三位的位置。第二个用于PCR扩增人Cyr 61序列的引 物命名为H61-3[5′-CCGGATCC(GA)CA(GA)TT(GA)TA(GA)TT(GA)CA -3′]，除了用于引入BamHI位点的5′“CCGGATCC”序列外，相应于与陈 述于序列1的鼠Cyr 61序列核苷酸1236-1250互补的反义链。简并性出现 在与叙述于序列1的鼠Cyr 61密码子第三位互补的位置。将扩增的Cyr 61 cDNA克隆到pBlueScript SK+载体(Stratagene，La Jolla，CA)并用Sequenase II试剂盒(U.S.Biochemicals，Cleveland，OH)测序。\n对人胎盘cDNA库的系统筛选导致了一个含人Cyr 61 cDNA的克隆的分 离。人Cyr 61 cDNA大约长1,500碱基对(bp)。人cDNA包含于克隆到pGEM 2的EcoRI位点的EcoRI片段。如序列3所示，人cDNA序列包括人Cyr 61 的全长编码区以及120bp的5′侧翼序列和大约150bp的3′侧翼序列。\n本发明的多核苷酸可以是全部或部分合成的，DNA或RNA，单链或双 链。由于本发明多苷酸编码可能为ECM信号分子蛋白片段的ECM信号分子 多肽，多核苷酸可能编码ECM信号分子的部分序列。本发明多核苷酸序列 可用于通过重组方法产生ECM信号分子以及作为杂交探针探测编码ECM信 号分子的多核苷酸。\n依据本发明的DNA多核苷酸包括基因组DNA，cDNA，以及寡核苷 酸，它们包含一个如上所述的ECM信号分子，或ECM信号分子片段或类似 物分子的编码序列，这样分子、分子片段或类似物至少保持ECM信号分子 的一种生物学活性，诸如在血管形成，软骨形成，以及肿瘤发生等生物学过 程中促进细胞粘着，细胞迁移或细胞增殖的能力，或引发识别ECM信号分 子的抗体的能力。\n依据本发明的其它多核苷酸与天然ECM信号分子多核苷酸中含有的序 列不同(即进行了核苷酸的增加，缺失，插入或替代)，条件是多核苷酸编码 一种保留ECM信号分子至少一种生物学活性的蛋白质。本发明多核苷酸序 列与天然ECM信号分子多核苷酸序列的不同之处可能是沉默突变，它因而 不改变编码的氨基酸序列。此外，本发明多核苷酸可能编码一种与如上所述 天然ECM信号分子序列或亚序列的氨基酸序列不同的ECM信号分子。例 如，本发明考虑了编码通过保守性替代一个或多个氨基酸残基而在氨基酸序 列与上天然ECM信号分子不同的多肽的多核苷酸。本发明亦扩展到在标准 严格条件下与编码本发明ECM信号分子的多核苷酸杂交的多核苷酸，或由 于遗传密码简并性而杂交的多核苷酸。举例的严格杂交条件包括在42℃下 50％甲酰胺，5倍SSC，20mM Na·PO4，pH6.8中杂交和在55℃下0.2 倍SSC中冲洗。本技术领域熟练人员可以理解这些条件可依据要杂交序列的 长度和GC核苷酸含量进行改变。本技术领域的标准准则适于确定精确的杂 交条件。参看Sambrook等，分子克隆：实验室手册(第二版，冷冻泉港实验 室出版社1989)9.47-9.51。\n包括RNA的ECM信号分子多核苷酸也在本发明范围内。依据本发明的 优选RNA多核苷酸是人Cyr 61的mRNA。本发明的其它RNA多核苷酸包 括由于核苷酸的插入，缺失，增加或替代与天然ECM信号分子mRNA不同 的RNAs(参看上述)，条件是它们编码一种保留一种与ECM信号分子有关的 生物学活性的多肽。本发明还包括反义RNA等其它RNA(即，含有与ECM 信号分子mRNA互补的RNA序列的RNA)。\n相应地，在另一个实施方案中使用本技术领域熟知方法将总起来跨越人 Cyr 61 cDNA的一组DNA片段克隆到pGEM-2和MB衍生物以便于核苷 酸序列测定。pGEM-2克隆为使用本技术领域熟知技术进行酶法产生系列 缺失提供了底物。这批克隆总起来含有跨越Cyr 61 cDNA编码区不同部分的 一系列DNA片段，在本发明方法中是有用的。产生的系列嵌套PGEM-2 克隆，依次为使用酶法链终止技术进行核苷酸序列测定提供了底物。片段也 可用作核酸探针以及用于制备Cyr 61缺失或截短类似物。例如，可使用Cyr 61  cDNA克隆从商品化人基因组库筛选Cyr 61克隆。(Clontech Laboratories， Inc.，Palo Alto，CA)。基因组克隆依次可用于将Cyr 61基因座位在人基因组 上作图，基因座可能与已知的疾病座有关。\n其它实施方案涉及的本发明多核苷酸包含于多种载体，包括质粒，病毒 (例如，从入噬菌体，疱疹病毒，腺病毒，腺相关病毒，巨细胞病毒，痘苗病 毒，M13-fl-fd家族病毒，逆转录病毒，杆状病毒及其它衍生的原核和 真核病毒载体)，噬菌粒，粘粒，以及YAC(即，酵母人工染色体)载体。\n其它实施方案涉及的本发明多核苷酸包含于异源多核苷酸环境。将本发 明多核苷酸插入到异源基因组，从而产生依据本发明的转基因以及转基因动 物。特别地，将两种含部分鼠Cyr 61基因序列的融合基因用于产生转基因鼠。 (参看下面)。一种融合基因将Cyr 61编码序列与下列三种不同启动子中的一 种重组1)K14角蛋白启动子，2)β-肌动蛋白启动子，或3)磷酸甘油酸激酶 启动子。Adra et al.，Gene 60：65-74(1987)。如下所述的磷酸甘油酸激 酶启动子(pgk-1)-Cyr 61融合基因的内容，这些融合基因构建体是使用标 准技术产生的。将一段含有全长Cyr 61编码区和所有内含子，但缺乏转录起 始位点和聚腺苷酸化信号的XhoI-ScaI基因组DNA片段克隆到质粒pgk/ β-gal，置换lacZ编码序列。产生的构建体将Cyr 61置于在所有细胞中都 具活性的强pgk-I启动子控制下。\n第二种基因融合体将Cyr 61表达控制序列(即启动子)与大肠杆菌β-半 乳糖苷酶编码序列重组。Cyr 61-lacZ融合基因是使用下面的方法构建的。 通过钝末端克隆将与转录起始核苷酸相关的跨越核苷酸-2065至+65的 DNA片段用于置换质粒pgk/β-gal的pgk-I启动子(Adra et al.，Gene 60： 65-74[1987])。此外，将来自牛生长激素基因的聚腺苷酸化信号克隆到含有 融合基因的质粒。产生的构建体，质粒2/lac Z，含有处于含Cyr 61启动子 的2kbDNA片段转录控制下的大肠杆菌lac Z基因。相关的质粒1.4/lacZ是通 过去掉Cyr 61 DNA位于一个AflII位点上游约600bp后从质粒2 lacZ衍生 的。质粒2M/lacZ也是与质粒2/lacZ相似的，只是通过PCR在CArG盒中产 生了C到T的转换。通过NotI消化从载体上切下这些构建体，使用GeneClean 纯化[Biolol，Inc.，La Jolla，CA]并用于产生转基因鼠(参看下面)。\n使用标准技术亦克隆了编码鼠fisp 12的cDNA片段。Ryseck et al.，Cell Growth & Diff.2：225-233(1991)，以参考文献并于此处。通过将含fisp 12 cDNA编码区的XhoII片段连接到Bam HI-切割的杆状病毒表达载体pBlue BacIII(Invitrogen Corp.，San Diego，CA)完成了克隆。如Summers et al.，TX Ag.Exp.Sta.，Bulletin 1555(1987)中所述获得了重组杆状病毒克隆。\nfisp 12的人直向同源物(ortholog)，编码CTGF的基因，如美国专利号 5,408,040，从第12栏，第16行到第13栏第29行所述，通过使用抗血小板 衍生生长因子(抗-PDGF)抗体筛选融合cDNA库得到了克隆，以参考文献 并于此处。筛选策略使用了CTGF和PDGF的免疫交叉反应性。\ncyr 61，fisp 12，和ctgf cDNAs克隆拷贝为便于分离基因组编码区，以 及基因组DNA或cDNA的等位基因变体的多核苷酸探针提供了现成的来 源。此外，可使用存在的cDNA克隆，或使用上述探针分离的克隆产生转基 因生物。例如，如下一实施例中所述，使用标准方法产生了含Cyr 61的转基 因鼠。\n将一个含有陈述于序列3的人Cyr 61 cDNA的克隆，hCyr 61 cDNA以 及用此克隆转化的细菌菌株，大肠杆菌DH5α(hCyr 61 cDNA)，在1997年3 月14日保存为美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection12 301 Parklawn Drive，Rockville，MD20852 usa)。\n                          实施例2\n                          序列测定\n鼠Cyr 61的核苷酸序列已陈述于O′Brien et al.(1990)；Latinkic et al.， Nucl.Acids Res.19：3261-3267(1991)，并陈述于序列1。\n推导的鼠Cyr 61氨基酸序列已在O′Brien et al.(1990)中报道并陈述于序 列2。\n使用如Sambrook et al中所述的Sanger方法测定了Cyr 61 cDNA核苷酸 序列。通过构建如上述实施例1所述的一系列pGEM-2人Cyr 61 cDNA克 隆的嵌套缺失产生了测序模板。人Cyr 61 cDNA序列陈述于序列3。人Cyr 61 氨基酸序列是从人Cyr 61 cDNA序列推导的并列于序列4。\n比较分别列于序列2和序列4的鼠和人Cyr 61序列，显示91％同源性。 两序列均显示N末端信号序列，暗示为加工和分泌的蛋白；两种蛋白均含38 个半胱氨酸残基；它们在两蛋白整体中均有分布但在鼠和人Cyr 61中心区域 显著缺乏。值得注意的是，鼠和人Cyr 61编码区序列差异最大的区域正是这 段不含半胱氨酸残基的中心区域。然而，鼠和人Cyr 61 cDNA的5′不翻译区 甚至差别更大(67％同源性)。相比较，3′不翻译区是同源性最高区域(91％同 源性)。在全长上，编码的鼠Cyr 61有379氨基酸；人Cyr 61有381氨基酸。\n亦测定了fisp 12 cDNA序列并列于序列5。从fisp 12 cDNA序列推导了 Fisp 12的氨基酸序列并列于序列6。鼠Cyr 61和Fisp 12的氨基酸序列相比 较揭示两种蛋白有65％相同。如下所述，Cyr 61和Fisp 12结构上的相似性 与两种蛋白功能特征的相似性是一致的。\n亦测定了含有全长CTGT编码区的CTGF部分cDNA序列，使用M13 克隆作为酶法测序反应的模板获得了CTGF cDNA序列，描述于′040专利， 第12栏，68行至第13栏14行。与双链酶法测序反应偶联的其它克隆，阐 明了编码CTGF的cDNA全长序列。美国专利号5,408,040，第14栏44行 至第15栏8行，以参考文献并于此处。编码CTGF的cDNA核苷酸序列列 于序列7。由编码CTGF的cDNA推导的氨基酸序列列于序列8。\n                        实施例3\n                        RNA测定\n因为合理设计的探针能揭示转录水平上Cyr 61基因表达的位置和水 平，所以多核苷酸探针是血管形成和其它与Cyr 61表达相关疾病的有效诊断 工具。Cyr 61的表达，同样也指示控制血管生成过程的基因是否以典型或预 期水平表达。\n使用这些工具，运用RNA酶保护技术，确定了鼠Cyr 61 mRNA表达模 式。O′Brien et al.，(1992)。特别地，使用了一个会保护鼠Cyr 61 mRNA246 个核苷酸(核苷酸67到313，按照O′Brien et al编号)的289个核苷酸的反义 核糖核酸探针(ribo probe)。检测表明了未分化阶段或分化的阶段1，2和3(PSA -1细胞的细胞分化进行三个阶段，相应于鼠胚胎细胞的下列妊娠时期，4.5 -6.5天[PSA-1阶段1]；6.5-8.5天[PSA-1阶段2]；8.5-10.5天[PSA -1阶段3])的PSA-1细胞中的Cyr 61mRNA水平。胚胎和胎盘总RNA(各 20微克)保护的比较表明Cyr 61是在胚胎组织中与细胞分化和增殖同时的时 期表达的。\n使用本技术领域标准方法，Sambrook et al.，通过Northern检测确定了 人Cyr 61的表达特征。从人二倍体成纤维细胞系WI 38(ATCC CCL-75)分 离到RNA。此外，从大鼠细胞(REF 52)，仓鼠细胞(CHO)，和猴细胞(BSC40) 分离了RNA。每一细胞系在MEM-10(含有Earle盐[GIBCO-BRL，Inc.]， 2mM谷氨酰胺，和10％胎牛血清[fcs]的Eagle极限必需培养基)中培养至铺 满并在MEM-0.5(0.5％血清培养基)中保持两天。然后使用本技术领域已 知的技术，Lau et al.(1985；1987)，在存在或不含环己酰亚胺的情况下，用 20％fcs刺激培养物。然后将从这些细胞系分离的10微克等份RAN用甲醛 琼脂凝胶电泳分级，转移并固定于硝酸纤维素膜，并在高度严格的杂交条件 下暴露于全长[32P]-放射标记的鼠Cyr 61 cDNA探针。人Cyr 61 RNA表达 与鼠Cyr 61表达类似。鼠和人Cyr 61表达均产生大约2千碱基的RNAs。此 外，鼠和人的Cyr 61表达均可由血清刺激并且对环己酰亚胺有抗性。\n亦使用多组织Northern印迹(Clontech)检查了人Cyr 61 mRNA的分布。 根据制造商的建议，印迹在Express Hyb溶液(Clontech)中进行杂交。结果表 明，Cyr 61 mRNA在人心，肺，胰和胎盘中丰富存在；在骨骼肌，肾和脑中 以低水平存在；在肝中未检测到。这些结果与Cyr 61在鼠组织中的表达是一 致的。\n此外，从静止的，指数生长的，由血清刺激的，或暴露于环己酰亚胺的 人皮肤成纤维细胞(HSFs)分离了总细胞RNA。将HUVE细胞(ATCC CRL 1730) 保存于补充有10％fbs(Intergene)，100微克/毫升肝素(Gibco BRL)和30微 克/毫升内皮细胞生长补充物(Collaborative Biomedical Products)的Ham′s F12 培养基中。在补充有10％fbs的Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)中培 养人皮肤成纤维细胞(HSF，ATCC CRL-1475)和WI 38成纤维细胞(ATCC CCL-75)。通过在补充有10％ fbs的DMEM中培养至铺满，随后将培养 基换为含0.1％ fbs的DMEM中培养两天制备了静止HSFs。将培养基改变 成20％fbs 1小时进行血清刺激。在此说明，与血清同时加入10微克/毫升 的环己酰亚胺保持3小时。\n使用异硫氰酸胍方法，Chomczynski et al.，Anal.Biochem.162：156 -159(1987)，从前面提及的细胞中分离到RNA。通过在甲醛琼脂凝胶上电 泳分离随后转移到尼龙膜检测RNA样品。将印迹与使用Cyr 61或GAPDH 为模板产生的随机引物探针杂交。Adams et al.，Nature 355：632- 634(1992)。结果表明人Cyr 61 mRNA在静止人皮肤成纤维细胞中未检测到 存在，在对数生长期和血清刺激的HSF中丰富存在，并且由环己酰亚胺超诱 导。\n编码CTGF的RNA的测定亦涉及本技术领域标准技术。特别地，对编 码CTGF的RNA的研究包括分离总细胞RNA和Northern测定，如美国专利 号5,408,040，第11栏59行至第12栏14行，和第13栏10-29行所述进 行，以参考文献并于此处。确定了一段2.4Kb的RNA。CTGF在胎盘，肺， 心，肾，骨骼肌和胰中有较高表达。然而，CTGF在肝和脑中只有较低表达。\n                         实施例4\n                        转基因动物\n使用含有融合基因的线性DNA片段完成了含有重组Cyr 61序列的整合 拷贝的转基因鼠的构建。如上所述，将Cyr 61编码序列分别与β-肌动蛋白， K14和pgk启动子融合。在转基因动物中由这些启动子驱动Cyr 61的表达。 使用标准技术，通过合适的限制性内切核酸酶消化产生融合基因。将融合基 因片段注射到Swiss Webster鼠的单细胞受精卵。然后将注射过的受精卵移植 到假孕母体。用这种方式产生了几窝小鼠。将显示非常规表型的新生鼠用于 进一步检测。例如，在pgk启动子控制下表达Cyr 61的新生转基因鼠出现骨 骼畸形，包括卷曲尾，不能移动的关节，以及扭曲的手足，导致运动困难。 这些鼠典型地为侏儒并在出生7天内死亡。在β-肌动蛋白启动子控制下表 达Cyr 61的转基因鼠除了较小外未显示明显的表型。当含转基因的鼠与近交 品系C57BL/6回交时，子代鼠随着连续的回交逐渐的更侏儒化。三到四次这 种回交以后，基本上不再有用于繁殖的子代存活。在K14启动子控制下表达 Cyr 61的转基因鼠出现一种纤维变性型皮炎。其病状包括过度的表面搔痒， 有时导致出血。也可使用标准技术，Hogan et al.，Manipulating the Mouse Embryo：Alaborator Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press 1994)产生具 有Cyr 61剔除突变的转基因生物，并可用作疾病状况的模型。\n                         实施例5\n                       Cyr 61的表达\n天然的Cyr 61在胚胎组织表达并可在多种伤口组织中诱导。参看下面； 也可参看，O′Brien et al.(1992)。借助使用常规免疫学技术(Harlow et al.，1987) 和亲和纯化的免抗-Cyr 61多克隆抗体对Cyr 61在组织中的分布进行了检 测。使用依据本发明的亲和纯化的抗-Cyr 61多克隆抗体，发现Cyr 61在 多种组织中表达，包括心血管系统的平滑肌，心肌细胞，及内皮；神经系统 的脑，脊髓，神经节和神经元，及视网膜；骨骼系统的软骨和骨；皮肤的头 发，口腔上皮，及角膜；肺的细支气管和血管；以及胎盘组织。除了涉及天 然Cyr 61(mRNA和蛋白质)的表达研究外，如上所述使用Cyr 61转基因的研 究促进了我们对Cyr 61表达的理解。使用含有Cyr 61表达控制序列和lac Z 编码序列(编码β-半乳糖苷酶)的转基因融合体为蛋白表达提供了方便的比 色测定。\n比色测定涉及使用5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷 (Galactopyranoside)(即X-Gal)作为1acZ基因产物β-半乳糖苷酶的底物。 X-Gal的β-半乳糖苷酶切割产生一种在组织化学染色中有用的深色靛蓝 染料。在实践中，将用于检测的胚胎和成人组织解剖并在含2％甲醛，0.2 ％戊二酸醛，0.02％乙基苯基聚乙二醇(Nonidet P-40)，和0.01脱氧胆酸 钠的标准磷酸盐缓冲液(PBS)中固定。固定时间依赖于进行检测的器官或胚胎 样品的大小和密度在15-120分钟范围变化。随后将样品在PBS中冲洗并 在含有5mM氰亚铁酸钾，5mM氰铁酸钾，2mM氯化镁，0.02％乙基苯基 聚乙二醇(Nonidet P-40)，0.01％脱氧胆酸钠和1毫克/毫升X-Gal(二甲 基亚砜[DMSO]中40毫克/毫升)的PBS溶液中37℃下染色过夜。然后将样品 在PBS中漂洗，在4％仲(多聚)甲醛中后固定1-2小时，贮存于4℃下70 ％乙醇中直至进行显微镜镜检。使用含Cyr 61-lacZ转基因的小鼠进行 Cyr61的表达曲线作图。将胚胎组织在12.5天时的结果显示于表I。\n                          表I   转基因鼠系   血管   骨骼   神经系统   表皮   1.S1   +2   -   +   +   2.S   +   +   +   +   3.S   +   +/-   +   +   4.T   +   -   -   未测到   5.T   +   -   -   未测到   6.T   +   +/-   -   未测到   7.T   +   +/-   -   未测到   8.T   +   +/-   +   未测到\n1转基因系，S-稳定(建立的)转基因系；T-瞬时系。\n2+/-仅部分再现的表达模式。\n结果表明Cyr 61在多种胚胎细胞类型中表达。从另一类型的含有与Cyr 61编码序列偶合的异源表达控制序列的转基因融合体产生的Cyr 61的异位 表达发现了其它信息。控制序列，K14角蛋白启动子，β-肌动蛋白启动子， 和磷酸甘油酸激酶启动子，指导Cyr 61以不同于其天然表达的模式进行表 达。\n异位表达Cyr 61的转基因鼠通常比野生型鼠小并且表现出平均寿命减 小。此外，这些转基因鼠有不正常的心脏(即腔壁加厚，相应减小了内在容积) 和不正常的骨骼，特征为弯曲的脊柱，关节肿胀至不能移动，以及卷曲的尾 巴。因而，Cyr 61的异位表达干扰了血管形成(血管发育和心脏发育)和软骨 形成(骨骼发育)。此外，可将携带Cyr 61剔除突变的转基因鼠作为与缺乏Cyr 61活性相关的病病状态的模型来发育和测试。\n设计了使用杆状病毒表达载体载体在Sf9细胞中表达重组Cyr 61的策 略。包含杆状病毒表达载体和Sf9的表达系统描述于Current Protocols in Molecular Biology§16.9.1-16.12.6(Ausubel et al.，eds.，1987)。本发明的一 个实施例通过将鼠Cyr 61 cDNA克隆到转移载体pBlue Bac2补充了表达策 略。依据制造商建议，使用MaxBac试剂盒(Invitrogen，Inc.，San Diego，CA)， 通过脂质体-介导的转染，将重组克隆和靶AcMNPV(即苜蓿银纹夜蛾多核 型多角载体病毒[Autographa californica nuclear polyhedrosis virus]，或杆状病 毒)DNA送递到Sf9细胞。重组病毒经噬斑纯化并通过感染在Sf9细胞中3 次传代进行扩增。\n用驱动鼠Cyr 61的合成的杆状病毒构建体感染的Sf9昆虫细胞条件培养 基，用作纯化Cyr 61的来源(参看下面)。纯化的重组Cyr 61保持内源蛋白的 特定特征，例如，来自3T3成纤维细胞的Cyr 61(描述于下面)的肝素结合活 性以及如通过使用胰凝乳蛋白酶或胰蛋白酶(测序级；Boehringer- Mannheim，Inc.，Indianapolis，IN)部分蛋白酶解产生的独立肽分布图揭示的与 内源蛋白的结构类似性。\n亦使用杆状病毒系统表达了人Cyr 61。将跨越全长人Cyr 61开放阅读 框的Cyr 61 cDNA的一段Smal-HindIII片段(相应于序列3的核苷酸100 -1649)亚克隆到pBlueBac3杆状病毒表达载体(Invitrogen)。使用常规技术， 通过Sf9感染的三次传代获得，噬斑纯化和扩增了重组杆状病毒克隆。使用 有些改进的标准技术进行了Sf9细胞感染和人Cyr 61(hCyr 61)纯化。将Sf9 细胞保持于无血清Sf900-II培养基(Sigma)。将Sf9细胞接种为每150毫米 平板2-3×106细胞并用每细胞5个噬斑形成单位(PFU)的重组病毒感染。 感染后8和96小时收集条件培养物，离心澄清(5000×g，5分钟)并调节至 50mM MES[2-IN-吗啉代]乙磺酸]，pH6.0，1mM PMSF(苯甲基磺酰氟)， 及1mM EDTA。以每500毫升条件培养物5毫升琼脂糖凝胶S珠的比率将培 养物与用加样缓冲液(50mM MES，pH6.0，1mM PMSF，1mM EDTA， 150mM NaCl)平衡的琼脂糖凝胶S珠混合，并在40℃(o/n)下轻微震荡使蛋白 与琼脂糖凝胶S结合。通过停止震荡20分钟收集沉淀的琼脂糖凝胶S珠并 装到柱中。用6倍体积的含0.3M NaCl的加样缓冲液洗柱并用加样缓冲液中 NaCl的分步梯度(0.4-0.8M)洗脱重组人Cyr 61。这一步骤从500毫升条件 培养物中产生3-4毫克纯化的Cyr 61蛋白质，通过SDS-凝胶的考马斯 亮蓝染色判定纯化的Cyr 61有超过90％的纯度。\n在另一实施例中，使用聚合酶链式反应(Hayashi，in PCR；聚合酶链式反 应3-13[Mullis et al.eds.，Birkhauser 1994])和有编辑功能的Taq聚合酶，随 之通过常规克隆技术将PCR片段插入载体，将全长Cyr 61 cDNA克隆到了诸 如pBK-CMV(Stratagene，LaJolla.CA)的巨细胞病毒载体。然后通过脂质体 -介导的转染将表达载体引入到HUVE细胞。使用G418选择含有载体一产 生的新基因的受体克隆。通过逆转录聚合酶链式反应(即，RT-PCR； Chelly et al.，in PCR：The Polymerase Chain Reaction 97-109[Mulis et al.eds， Birkhauser 1994])或酶联免疫吸附测定(即ELISA；Stites et al.，in Basic and Clincal Immunology 243[Stites et al.eds.，Appleton & Lange 1991])扩展选择的 克隆以及确定Cyr 61的表达。\n在本发明其它实施例中，使用与在使用的细胞类型中可操作的启动子相 连接的Cyr 61 cDNA编码区在细菌细胞或其它表达系统(例如酵母)中表达 Cyr 61蛋白。使用这些方法中的一种，可能获得能以诸如静脉途径等直接施 用于病人形式的Cyr 61蛋白，以治疗血管形成的，软骨形成的，或肿瘤发生 的病。本技术领域熟练人员会认识到也可使用其它给药途径，例如局部用药， 脂质体一介导的递药技术，或皮下，皮内，腹膜内，或肌内注射。\n                               实施例6\n                            Fisp 12的表达\n运用免疫组织化学技术研究了Fisp 12的表达以及Cyr 61和Fisp 12表达 特征的比较。为了这些免疫组织化学检测，首先将组织样品(参看下面)用 methyl-Carnoy固定液(60％甲醇，30％氯仿和10％冰醋酸)固定2-4小 时。然后在55-56℃下最短持续时间内将其在Para plast X-tra wax中脱 水，澄清和浸润。在聚-L-赖氨酸覆盖的载片(Sigma)上收集7微米厚的切 片，封固并脱腊。然后用0.03％双氧水的甲醇溶液处理30分钟，以灭活内 源性过氧化物酶活性。再水化以后，将切片置于Tris缓冲盐溶液(TBS：10mM Tris，pH7.6和140mM NaCl)中15分钟。在此时。吸收切片以用纸巾除去多余 的TBS并在潮湿腔中用3％正常山羊血清的TBS溶液封闭10分钟。然后排 干多余的缓冲液并加上初级抗体。亲合纯化的抗-Cyr 61抗体以1∶50比 例稀释于3％正常山羊血清-TBS溶液中。亲合纯化的抗-Fisp 12抗体的 稀释度为1∶25。常规对照是3％正常山羊血清-TBS，或相关抗体(例如 抗平滑肌细胞α-肌动蛋白单克隆抗体)。在用于切片之前，通过将抗-Cyr 61或抗-Fisp 12抗体与过量的相应抗原在冰上至少温育2小时证实了染色 的特异性。观察到完全的竞争。作为对照，未出现交叉竞争(将抗-Cyr 61 抗体与Fisp 12抗原一起温育以及反之亦然)。\n在4℃下将初级抗体置切片上过夜。然后用TBS洗两次，并在室温下将 其暴露于次级抗体温育30分钟。使用的次级抗体是来自Boehringer- Mannheim，Inc.，Ind ianapolis，IN(以1∶400稀释后使用)的羊抗兔辣根过氧化 物酶缀合物。用TBS洗切片两次并加入显色的辣根过氧化物酶底物5分钟 (50mM Tris-HCl中1毫克/毫升二氨基联苯胺，pH7.2以及0.03％的 H2O2)。然后将切片在Ehrich′s haematoxylin或Alcian蓝中复染，脱水并在 Permount上封固载片。\n将处于神经褶(E8.5)和器官发生晚期(E18.5)发育阶段之间的鼠胚胎制成 切片并用抗原亲和纯化的免抗Cyr 61和抗Fisp 12抗体进行免疫染色。当胚 胎形成中多种器官发育时，测到有Cyr 61和Fisp 12存在。Cyr 61和Fisp 12 共同定位于多种组织和器官。显著的例子是胎盘，其中两种蛋白均可容易地 检测到。特别是，在滋养层巨大细胞内和周围同时发现Cyr 61和Fisp 12， 证实了先前通过原位杂交在这些细胞中检测到Cyr 61 mRNA(O′Brien and Lau，1992)。在免疫组织化学染色中Cyr 61和Fisp 12信号均可由相应的Cyr 61 或Fisp 12抗原封闭，但并不相互封闭或被相关蛋白封闭，证明其专一性。概 括来讲，可在胞内和胞外检测到Cyr 61和Fisp 12。\n除了胎盘之外，也在心血管系统，包括平滑肌，心肌细胞，和内皮中检 测到Cyr 61和Fisp 12。也在肺中的细支气管和血管中发现两种蛋白。在骨 骼肌中可瞬时检测到低水平的抗Cyr 61和抗Fisp 12染色。这一染色与结缔 组织片，而不是与肌细胞相联系；此时的染色模式明显为胞外。\n在表皮和上皮中发现了更复杂的分布模式。在早期，单细胞层胚胎表皮 以及晚期，多层分化的表皮中均可检测到Cyr 61和Fisp 12染色。在妊娠末 期，表皮中的Fisp 12降至不能检测的水平并在成人期保持如此，而Cyr 61 在表皮中是易于检测到的。在新生儿中，口腔上皮中观察到Fisp 12的强烈染 色而Cyr 61则非常微弱，但在上颌中发现了Cyr 61而未观察到Fisp 12。在 口腔上皮中，抗Fisp 12信号逐渐增强并保持强度至成人期。在舌中，在角质 化上皮中观察到Cyr 61和Fisp 12，但Fisp 12的染色模式不包括线形乳头状 突起，Cyr 61则并非如此。\n除了上述的定位部位之外，Cyr 61和Fisp 12也特异地定位于多个器官 系统。例如，Cyr 61，而非Fisp 12，出现于骨骼和神经系统。如原位杂交 结果(O′Brien and Lau，1992)所预期，在体节的生骨节块中易于检测到Cyr 61 蛋白，并且在发育晚期的软骨和骨中也有。作为对比，在骨骼系统中未检测 到Fisp 12。由于与软骨细胞分化相关是Cyr 61表达的最显著特征，在骨骼 系统中缺乏Fisp 12可能强调了Cyr 61和Fisp 12生物学功能的重要区别。在 E14.5胚胎中，能在腹侧脊髓，背侧神经节，轴向肌肉和生骨节衍生软骨脊 椎中检测到Cyr 61。而在这些组织中未检测到Fisp 12。\n与此对比，Fisp 12特异地出现于多种分泌组织。从E16.5开始，能在胰 腺、肾和唾液腺中检测到Fisp 12。在胰腺中，Fisp 12严格定位于胰岛的周 围。在肾中，在集合小管和髓襻中看到强的Fisp 12染色，这些区域中未发现 Cyr 61。在分泌粘液型下颌下唾液腺，只有集合管(collecting ducts)有Fisp 12 染色，而在混合的粘液-浆液(mucous-serous)下颌下腺中，浆液腺泡(serous acini)和集合管均被染色。腺泡中的信号是周围的，提高了Fisp 12为囊(capsule) 相关的可能性。在简单的全质分泌皮脂腺中，检测到强的非细胞Fisp 12信 号。\n总的来说，Cyr 61和Fisp 12共定位于胎盘，心血管系统，肺和皮肤。 在消化系统或内分泌腺体中两种蛋白均未测到。Cyr 61的特异定位可在骨骼 和中枢神经系统中测定出，而Fisp 12发现于没有Cyr 61的分泌组织。\n与蛋白表达密切相关的一个问题涉及表达蛋白的代谢命运。定位了富半 胱氨酸蛋白家族的成员。如上所述，分泌的Cyr 61发现于ECM中和细胞表 面但不在培养基中(Yang and Lau，1991)，而分泌的Fisp 12易于在培养基中检 测到(Ryseck et al.，1991)。为了提出问题是否Fisp 12也是ECM-相关的，使 用脉冲追踪实验跟踪3Cyr 61和Fisp 12的命运。将血清刺激的，亚铺满的 NIH 3T3成纤维细胞代谢脉冲标记1小时并在冷培养基中不同时间进行追 踪。将样品分级为细胞，ECM，和培养基组分，随后通过免疫沉淀检测Cyr 61和Fisp 12。在细胞级分中，两种蛋白都有相似的大约30分钟的较短半衰 期，包括新合成的胞内蛋白以及与细胞表面相联的分泌蛋白(Yang and Lau， 1991)。应当注意到由于Cyr 61在合成后是定量分泌的并且只有少量级分与 ECM稳定相联，大量分泌的Cyr 61是细胞表面相联的(Yang and Lau，1991)。\n一部分Cyr 61追踪进入到ECM并保持稳定数小时。也追踪到新合成的 Fisp 12进入3ECM，但其半衰期只有大约1小时。追踪到大量Fisp 12进入 了条件培养基，而其中未测到Cyr 61。在条件培养基中的Fisp 12也有较短 的大约2小时的半衰期。因而，Cyr 61是与ECM强烈相关的，而Fisp 12则 更短暂的与ECM相关。这一结果暗示Fisp 12可能能在距其合成和分泌部位 较远处起作用，而Cyr 61可能更局部的起作用。\n由于许多ECM蛋白通过与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的相互作用与基质相 联，蛋白结合肝素的亲和性可能是其与ECM相互作用的一个因素。下面所 述的肝素结合测定的结果是与此假定一致的。\n                         实施例7\n                        蛋白质纯化\n裂解血清刺激的NIH 3T3成纤维细胞以提供天然鼠Cyr 61的来源。 Yang et al.类似的，人成纤维细胞是人Cyr 61的来源。\n从上述的携带包括全长Cyr 61编码序列的重组杆状病毒载体的Sf9细胞 纯化重组鼠Cyr 61。虽然Cyr 61在Sf9细胞裂解物中与在细菌细胞提取物中 一样形成不可溶聚集物，仍有大约10％合成的Cyr 61以可溶形式分泌到培 养基中。从而可将溶解的，分泌形式的Cyr 61用于纯化。\n起初，在补料Grace培养基中(GIBCO-BRL，Inc.，Grand Island，NY). Grace.Nature 195：788(1962)产生亚铺满的Sf9细胞单层培养。然后用每细 胞10个噬斑形成单位的重组杆状病毒载体感染Sf9细胞，培养16个小时， 并用无血清Grace培养基补料。细胞在无血清Grace培养基中扩展。虽然感 染24小时后即可在培养基中检测到Cyr 61的表达，但要在感染后48小时收 集条件培养物。随后，通过5000×g离心5分钟澄清条件培养物，冷至4 ℃，调整至50mM MES，pH6.0，2mM EDTA(乙二胺四乙酸)，1mM  PMSF(苯甲基磺酰氟)并在4℃下加样至琼脂糖凝胶S柱(Sigma Chemical Co.， St.，Louis，Mo)(每500毫升培养物5毫升外水体积)。用含150NaCl的缓冲液 (50mM MES，pH6.0，2mM EDTA，0.5mM PMSF)洗柱，并用同种缓冲液中NaCl线性梯度(0.2-1.0M)洗脱结合的蛋白。Cyr 61的混合级分作为一个明显的 宽峰在0.6-0.7M NaCl时洗脱。使用本技术领域标准技术，通过10％SDS -聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)继之以考马斯亮蓝染色或Western测定确定柱 组分有90％纯度。Yang et al.，亦可参看Sambrook et al.，Supra.对于Western 检测，如Yang et al.，Supra中所述用亲和纯化的抗-Cyr 61抗体探测印迹。 抗体探测后，用ECLTM(即增强化学发光)检测试剂(Amersham Corp.，Arlingt on Heights，IL)将Westem印迹染色。收集含Cyr 61的级分，用Tris-HCl调整 至pH7.5，pH7.5，并在将等分部分贮存于-70℃之前加入10％甘油。使用 BioRad蛋白检测试剂盒(BioRad Laboratories，Inc.，Hercules，CA)，通过改进的 Lowry方法确定了蛋白浓度。这一纯化过程至少重复了5次，具有类似结果。 典型的产量为每500毫升条件培养物中得到3-4毫克90％纯度的Cyr 61 蛋白。\nFisp 12的纯化使用改进了的Cyr 61纯化方案(Kireeva et al.，Experimental Cell Research，印刷中)。在感染后48小时收集以每细胞10噬斑形成单位(pfu) 感染的Sf9细胞无血清条件培养基(500毫升)，并加样到5毫升琼脂糖凝胶 S(Sigma Chemical Co.，to Louis，MO)柱。在0.2M和0.4M NaCl充分冲洗后， 通过使用含0.5MNaCl的50mM MES(pH6.0)洗脱的步骤回收结合的蛋白。收 集含纯度超过80％的Fisp 12级分，用NaCl调整至0.15M并在0.5毫升琼脂 糖S柱上用0.6M NaCl洗脱蛋白，将蛋白浓缩3-5倍。\n这一纯化方案可以从500毫升无血清条件培养物中分离1.5毫克纯度至 少为80％的重组Fisp 12。\n利用CTGF和PDGF之间的抗PDGF交叉反应性，通过亲和色谱纯化了 CTGF，描述于美国专利号5,408,040，第7栏第15行至第9栏，第63行， 以参考文献并于此处。\n                      实施例8\n                     多肽的表征\n鼠Cyr 61蛋白分子量为41,000，包括379个氨基酸残基，并包括N- 末端分泌信号。其氨基酸序列与人蛋白的381氨基酸序列有91％同源性。鼠 和人蛋白的使两种蛋白相类似的这些区域预期参与了两多肽共有的及此处公 布的生物学活性。然而，鼠和人蛋白确实在蛋白中间部分有显著区别，每种 蛋白的该区域都缺乏半胱氨酸。参看，O′Brien et al.，Cell Grouth & Diff. 3：645-654(1992)。鼠Cyr 61氨基酸序列的无半胱氨酸区发现在氨基酸残 基164到226之间(序列2)。在人Cyr 61氨基酸序列中相应的无半胱氨酸区 是在氨基酸残基163到229之间(序列4)。更特定地，鼠和人Cyr 61蛋白在 Cyr 61氨基酸170-185和210-225之间差别最大。富半胱氨酸蛋白ECM 信号分子家族的其它成员，例如Fisp 12(序列6)和CTGF(序列8)，表现出类 似结构，暗示分泌性蛋白含有由半胱氨酸残基支配的序列。\n因为鼠Cyr 61在355个氨基酸的分泌部分含有38个半胱氨酸，所以研 究了二硫键的形成对Cyr 61三级结构的贡献。将Cyr 61暴露于10mM二硫 苏糖醇(DTT)16个小时并不影响Cyr 61介导细胞粘着的能力(参看下面)。然 而，通过在75℃下加热5分钟，在100mM HCl中温育，或用胰凝乳蛋白酶 充分消化，可使Cyr 61失活。这些结果表鼠Cyr 61是一种热和酸不稳定蛋 白，其活性构象对还原性试剂不敏感。前面所述的鼠和人Cyr 61多肽的结构 相似性暗示人Cyr 61也可能对热或酸敏感，但对还原性试剂不敏感。此外， Cyr 61没有磷酸化或糖基化。\n为了确定上述纯化的重组鼠Cyr 61是否与天然鼠Cyr 61相同，测定了 鼠Cyr 61的两个另外的特征。首先，获取了重组的和天然的鼠Cyr 61的两 个独立的蛋白质指纹结构。将纯化的重组鼠Cyr 61和已知含有天然鼠Cyr 61 的血清刺激3T3细胞裂解物用胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶进行有限蛋白酶解， 并比较它们的消化产物。重组蛋白和细胞裂解物的部分胰蛋白酶消化均产生 两个大约21和19千道尔顿(kDa)的Cyr 61片段。类似地，通过部分胰凝乳 蛋白酶消化两种制备物指纹从重组鼠Cyr 61和天然鼠Cyr 61产生稳定的 23kDa片段。\n用于评价重组Cyr 61特性的另一个标准是其如下所述的结合肝素的能 力。在0.15M NaCl时纯化的重组鼠Cyr 61与肝素-琼脂糖凝胶定量结合并 且在0.8-1.0M NaCl时洗脱下来。这一肝素结合能力类似于从血清刺激的 鼠成纤维细胞中获得的天然鼠Cyr 61。因为鼠和人Cyr 61蛋白的类似性， 如鼠多肽那样，重组人Cyr 61应当显示类似天然人Cyr 61的特性。\n本发明的多肽也扩展到前述的诸如人和鼠Cyr 61的全长ECM信号分子 的片段，类似物，和衍生物。如上所述，本发明考虑到保留至少一种ECM 信号分子的生物学活性的ECM信号分子肽片段。保留至少一种ECM信号分 子活性的候选片段包括含有相应于已知ECM信号分子保守区的氨基酸序列 的片段。例如，保留ECM信号分子一个或多个保守的半胱氨酸残基的片段 很可能是保留至少一种生物学活性的ECM信号分子片段的候选物。除了天 然出现的ECM信号分子片段的氨基酸序列之外，本发明多肽还包括天然 ECM信号分子的氨基酸序列或亚序列的类似物。\n如上所述，ECM信号分子类似物是在氨基酸序列上与天然ECM信号分 子不同但保留至少一种天然ECM信号分子生物学活性的多肽。这些类似物 例如通过插入，缺失，或氨基酸的保守性替代而在氨基酸序列上与天然ECM 信号分子不同。一个氨基酸的保守性替代，即用一个有相似特性(例如亲水 性，带电区域的带电程度和分布)的不同氨基酸替代一个氨基酸，在本技术领 域认为是典型地进行了微小的变化。如本技术领域的理解，通过考虑氨基酸 的亲水性系数，可部分确定这些微小变化。Kyte et al.，J.Mol.Biol.157：105 -132(1982)。氨基酸的亲水性系数基于对其疏水性和电荷的考虑，包括下列 数值：丙氨酸(+1.8)，精氨酸(-4.5)，天冬酰氨(-3.5)，天冬氨酸(-3.5)， 半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)，甘氨酸(-0.4)，谷氨酸(-3.5)，谷氨酰氨(-3.5)， 组氨酸(-3.2)，异亮氨酸(+4.5)，亮氨酸(+3.8)，赖氨酸(-3.9)，甲硫氨 酸(+1.9)，苯丙氨酸(+2.8)，脯氨酸(-1.6)，丝氨酸(-0.8)，苏氨酸(-0.7)， 色氨酸(-0.9)，酪氨酸(-1.3)，和缬氨酸(+4.2)。本技术领域已知可以用有 相似亲水性系数的氨基酸替代并仍保持蛋白质功能。优选地，将具有±2亲 水性指数的氨基酸替代。\n氨基酸的亲水性也可用于揭示能产生保持生物学功能的蛋白质的替 换。考虑在多肽序列中氨基酸的亲水性可以计算多肽的最大局部平均亲水 性，一种报道的与抗原性和免疫原性良好相关的有用方法。美国专利号 4,554,101，以参考文献并与此处。如美国专利号4,554,101中报道，每种常 见氨基酸的亲水性值为：丙氨酸(-0.5)，精氨酸(+3.0)，天冬酰氨(+0.2)， 天冬氨酸(+3.0±1)，半胱氨酸(-1.0)，甘氨酸(0)，谷氨酸(+3.0±1)， 谷氨酰胺(+0.2)，组氨酸(-0.5)，异亮氨酸(-1.8)，亮氨酸(-1.8)，赖氨 酸(+3.0)，甲硫氨酸(-1.3)，苯丙氨酸(-2.5)，脯氨酸(-0.5±1)，丝氨 酸(+0.3)，苏氨酸(-0.4)，色氨酸(-3.4)，酪氨酸(-2.3)，和缬氨酸(-1.5)。 如本技术领域的理解，具有相似亲水性值的氨基酸的替代能产生保持生物学 活性，例如免疫原性的蛋白质。优选地，使用相互间亲水性值在±2内的氨 基酸进行替代。氨基酸的疏水系数和亲水值均受到氨基酸特定侧链的影响。 与观察相一致，认为与生物学功能相容的氨基酸替代依赖于氨基酸，并且特 别是由疏水性，亲水性，电荷，大小和其它特征揭示的那些氨基酸的侧链的 相关类似性。\n此外，存在计算机算法来帮助预测可能对水溶液有亲性(accessible)的氨 基酸序列结构域。本技术领域已知这些结构域常排列于朝向蛋白外部，从而 可能提供结合决定簇，包括抗原决定簇。有了DNA序列之后，通过本技术 领域熟知的(例如定点)诱变和其它技术可制备这种类似物。\n本发明亦考虑了ECM信号分子衍生物。ECM信号分子衍生物是与天然 ECM信号分子在一级结构(即氨基酸序列)以外的方式上不同的蛋白质或肽。 作为说明，ECM信号分子衍生物可能由于被糖基化，一种转录后修饰的形 式，而与天然ECM信号分子不同。例如，多肽可能由于在异源系统中表达 而显示糖基化模式。如果这些多肽保持天然ECM信号分子的至少一种生物\n学活性，则这些多肽为依据本发明的ECM信号分子衍生物。其它ECM 信号分子衍生物包括，但不限于，含共价修饰N或C末端的融合蛋白，聚乙 二醇化(PEGylated)多肽，与脂组分相连的多肽，烷基化多肽，通过一个氨基 酸侧链功能基团与其它多肽或化学品联结的多肽，以及本技术领域理解的其 它修饰。此外，本发明考虑了如下所述的与ECM信号分子受体结合的ECM 信号分子相关多肽。\n如上所述的本发明的多种多肽，可以以分离多肽或例如通过共价键等与 其它化合物相连的形式提供。例如，诸如钥孔蝛血蓝素的免疫原性载体可与 本发明的ECM信号分子结合。\n                          实施例9\n                        肝素结合测定\n改进了Yang等所述的天然鼠Cyr 61的肝素结合测定方法用于纯化的重 组鼠蛋白。首先，将纯化的重组Cyr 61悬浮于RIPA(放射免疫沉淀测定)缓冲 液(150mM NaCl，1.0％NP-40，0.5％脱氧胆酸盐，0.1％SDS，50mM Tris-HCl，pH8.0，1mM苯甲基磺酰氟)。接着，将200微升肝素-琼脂 糖凝胶CL 6B珠(Pharmacia-LKB Biotechnology，Inc.，Piscataway，NJ)的 50％(体积/体积)悬浮液加到100微升重组Cyr 61溶液中并温育1小时。在此 条件下，人Cyr 61与肝素-琼脂糖定量结合。在RIPA缓冲液中应用盐浓度 梯度，可在0.8-1.0M NaCl时洗脱重组鼠Cyr 61。重组蛋白的洗脱曲线类 似于天然鼠Cyr 61的洗脱曲线。\n由于Fisp 12与ECM的相互作用不如Cyr 61那么强，可预期它与肝素的 亲和性低于Cyr 61。为检验这种可能性，将代谢标记的[35S-半胱氨酸；每 100毫米平板100微居；ICN]细胞裂解物与肝素琼脂糖珠温育并随后洗去未 结合的蛋白质。用升高的盐浓度洗脱结合的蛋白质。来自细胞裂解物的Fisp  12保留在肝素琼脂糖但被0.2至0.6M NaCl洗脱，其峰值洗脱在0.4M NaCl。 这与Cyr 61相反，其洗脱在显著更高浓度的NaCl。肝素结合的区别与Cyr 61 和Fisp 12对ECM的不同亲和性是一致的，暗示与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的 结合可能是基本机理，两种蛋白据此与ECM相联系。\n                          实施例10\n                            受体\n人Cyr 61，类似于鼠Cyr 61，定位于细胞表面和胞外基质(ECM)。Cyr 61定位于细胞表面暗示一种结合Cyr 61的细胞表面受体。与此暗示一致， Cyr 61的生物学效应由αvβ3整联蛋白，或玻连蛋白受体介导。αvβ3整 联蛋白与其它整联蛋白一起形成蛋白质簇，提供细胞骨架粘着的焦点。Cyr 61诱导蛋白质簇的形成，包括含有αvβ3整联蛋白的蛋白质簇。此外，使 用体外检测，Cyr 61的生物学作用，包括Cyr 61诱导的细胞粘着和分裂， 可通过加入设计抗αvβ3整联蛋白的两种单克隆抗体-LM609(Cheresh， Proc.Natl.Acad.Sci.[USA]84：6471-6475[1987])或抗-VnR1(Chen et al.， Blood 86：2606-26)15[1995]中的一个进行去除。这些资料导致确定αv β3整联蛋白为Cyr 61的受体。\n在下面实施例13所述的Cyr 61对HUVE细胞粘着的诱导，导致了对由 HUVE细胞表达的二价阳离子敏感的细胞表面受体的研究。使用Cyr 61的细 胞粘着特性确定受体，它是一种二价阳离子敏感的细胞表面受体。Cyr 61能 够介导细胞粘着的能力，及在此过程中有对二价阳离子的严格需要，暗示Cyr 61与一种来自整联蛋白，选择蛋白，或钙粘着蛋白家族的二价阳离子依赖性 细胞粘着分子相互作用。Ruoslahti et al.，Exp.Cell Res.227：1-11(1996)。 使用良好表征的方法确定受体，进行了一系列抑制研究。使用了不同专一性 程度的抑制剂，或阻断剂(EDTA，类似于上述的EGTA；带有RGD整联蛋 白识别基序(单字母氨基酸密码)变体，诸如RGDS，SGDR，和RGDSPK的抑 制性肽(Ruoslahti，et al.，Science 238：491-497[1987]，Ruoslahti，E.，Ann， Rev.of Cell and Dev.Biol.R：698-715[1996]；以及已知的特异性抗受体抗 体)确定Cyr 61受体。受体是αvβ3整联蛋白，已知也起玻连蛋白受体功能。 通过显示一种特异性抗αvβ3整联蛋白抗体，抗体LM609能阻断Cyr 61对 细胞粘着的影响，获得了对这一确认的证实。整联蛋白形成一个异源二聚体 粘着受体的大家族，具有广谱的配体专一性范围，涉及细胞-细胞和细胞- 基质相互作用。它们除了需要二价阳离子和涉及细胞-基质粘着[Hnes，R.O.， Cell 69：11-25(1992)]之外，整联蛋白也涉及两种与Cyr 61活性有关的其 它两种过程，细胞迁移[Damsky et al.，Curr.Opin.Cell Biol.4：772- 781(1992)]；Doerr et al.，J.Biol.Chem.271：2443-447(1996)]和增殖[Juliano et al.，J.Cell Biol.，120：577-585(1993)；Plopper et al.，Mol.Biol.Cell 6： 1349-1365(1995)；and Clark et al.，Science 268：233-239(1995)]。已发 现αvβ3整联蛋白对Cyr 61-介导的细胞粘着是必需的。\n已报道CTGF结合细胞的表征通过一种亦与PDGF-BB(PDGF的BB 同I型)相互作用的细胞表面受体出现，如美国专利号5,408,040，第11栏， 10行，至第12栏，14行中所述，以参考文献并于此处。前述受体的确认使 得能能够设计和产生能与相应受体结合从而抑制ECM分子活性的分子。\n                     实施例11\n                 抗-ECM信号分子抗体\n本发明亦考虑了如下所述可任选地与标记或毒素结合的抗体。人Cyr 61 cDNA序列和Cyr 61推导的蛋白序列的存在促进了一种方法的实现，该方法 设计使用本技术领域的多种标准技术产生抗Cyr 61抗体。Harlow et al.\n在一个实施方案中，产生了抗Cyr 61的多克隆抗体。例如通过设计合适 的抗原优化对人Cyr 61专一的抗-Cyr 61抗体产生。人Cyr 61蛋白有381 个氨基酸长度，包括N端分泌信号。如上所述，人Cyr 61与379氨基酸序列 的鼠蛋白显示91％的氨基酸序列同源性。然而，鼠和人蛋白在蛋白的缺乏半 胱氨酸的中央部分差别最为显著(参看上述)。通过使用含有从人蛋白一个差 别区衍生序列的肽作为抗原，利用序列差别产生了对人Cyr 61专一的抗体， 尽管本发明亦考虑了对保守区的抗体。\n在本发明另一实施方案中，使用完整的重组人Cyr 61产生了单克隆抗 体，虽然也可使用一片段。将0.25毫升细菌或真核细胞产生的重组人Cyr 61(5 ～50微克)和0.25毫升完全福氏佐剂的混合物腹膜内接种到BALB/C母鼠。 14天后，用不完全福氏佐剂代替完全福氏佐剂重复注射。再过两星期后，再 次注射在不完全福氏佐剂中的人Cyr 61。第三次注射后两星期，进行尾部取 血并使用放射标记的重组人Cyr 61通过免疫沉淀筛查血清样品中的人抗Cyr  61抗体。初次注射两个月后，对血清产生最高抗体滴度的鼠进行Cyr 61的加 强注射(不完全福氏佐剂中5-50微克，0.1毫升静脉内注射，0.1毫升腹膜 内注射)。加强注射三天后，杀死小鼠。然后使用标准技术从每只鼠中分离脾 细胞，冲洗细胞并通过本技术领域已知技术使用聚乙二醇将它们分别与骨髓 瘤细胞系，例如X63Ag8.653细胞系(Harlow et al.)融合。其它用于与脾细胞 融合的合适细胞系描述于Harlow等，第144页，表6.2中，以参考文献并于 此处。从PEG溶液中取出融合细胞，稀释到反选择培养基(counter-selective) 中(例如次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷或HAT培养基)以杀死未融合的骨髓瘤细 胞，并接种到多孔组织培养板。\n1-2星期后，从含有生长的杂交瘤的孔取出组织培养上清样品，通过 与结合到硝酸纤维素的重组人Cyr 61的结合检测抗Cyr 61抗体的存在并在标 准的抗体捕捉测定中使用标记的抗免疫球蛋白筛选。培养来自阳性孔的细胞 并在脾细胞饲养层克隆单细胞。将克隆的细胞系冷冻保存。收集单克隆抗体 并使用标准技术，例如羟基磷灰石层析纯化。在另一种方法种，肽用作抗原 时Cyr 61，可结合到诸如钥孔血蓝素载体蛋白的免疫原性载体，来产生单 克隆抗Cyr 61抗体。\n另一个实施方案涉及产生抗融合蛋白的抗体产物，融合蛋白含有部分或 全部人Cyr 61，包括足够的蛋白序列从而在融合蛋白上表现有用的表位。已 使用了邻氨基苯甲酸合成酶(即TrpE)大亚基与鼠Cyr 61的融合以及谷胱甘肽 S-转移酶与鼠Cyr 61的融合，成功的提高了抗鼠Cyr 61的抗体。Yang et al. 此外，可使用本技术领域热练人员熟知的多种多肽形成依据本发明的Cyr 61 融合多肽。\n更特定地，Yang报道了从通过将含有核苷酸456至核苷酸951(编码Cyr 61氨基酸93-379)的鼠Cyr 61 cDNA片段克隆到pATH1载体SacI位点构 建的重组克隆中表达的一种TrpE-Cyr 61融合多肽。Dieckman et al.， J.Biol.Chem.260：1513-1520(1985)。将重组构建体转化到细菌宿主，例 如大肠杆菌K12，并通过向生长培养基中加入25微克/毫升的吲哚丙烯酸 (indoleacrylic acid)诱导融合蛋白的表达。随后裂解细胞并将总细胞裂解液通 过在7.5％聚丙烯酰胺凝胶上电泳分级。具有预期大小的融合蛋白是由吲哚 丙烯酸诱导的唯一条带；从凝胶上洗脱条带并使用本技术领域标准技术用作 抗原免疫新西兰白兔(Langshaw农场)。Harlow et al.除了多克隆抗体外，本发 明包括指向这类融合蛋白的单克隆抗体。\n在本发明另一实施方案中，使用了重组抗体产品。例如，嵌合抗体产品， “人源化”抗体产品，以及LDR-移植抗体产品均在本发明范围内。Kashmiri et al.，Hybridoma 14：461-473(1995)，以参考文献并于此处。本发明亦 考虑了抗体片段。将包括前面所这这类的抗体产品的抗体产品用作分离的抗 体或用作与标记连接的抗体。标记可以是产生信号的酶，抗原，其它抗体， 凝集素，碳水化合物，生物素，亲合素，放射性同位素，毒素，重金属，以 及本技术领域已知的组合物：结合技术也是本技术领域熟知的。\n如下面的实施例20中的更充份的说明，抗Cyr 61抗体可用于诊断血栓 形成的危险。此外，抗Cyr 61抗体可用于治疗，设计防止或减轻由于不正常 的Cyr 61水平造成的不期望的凝块。进一步，依据本发明的抗体可使用本技 术领域熟知的技术与诸如蓖麻毒蛋白的毒素结合。这些依据本发明的抗体产 物可用于向表达Cyr 61的细胞，例如参与实体肿瘤新血管形成的细胞中传递 靶专一的细胞毒素。如本技术领域熟练人员的理解，这些抗体以含有载体或 稀释剂的药物组合物形式可通过多种途径给药。\n亦使用融合蛋白产生了专一识别Fisp 12的抗体。用于产生抗Fisp 12抗 体的抗原是将谷胱甘肽-S-转移酶(GST)与同Cyr 61没有序列相似性的 Fisp 12的中心部分相联合(GST-Fisp 12)(O′Brien and Lan，1992)。将含有编 码Fisp 12氨基酸165至200的cDNA的构建体与谷胱甘肽-S-转移酶（GST) 编码序列融合。这是通过使用聚合酶链式反应(pCR)指导含有侧翼有5′BamHI 限制性位点和3′EcoRI限制性位点的fisp 12片段的DNA片段的合成完成的。 5′引物序列为5′-GGGGATCTGTGACGAGCCCAAGGAC-3′(序列9)，3′ 引物序列为5′-GGGAATTCGACCAGGCAGTTGGCTCG-3′(序列10)。对 于Cyr 61专一性血清，使用5′引物5′- GGGGATCCTGTGATGAAGACAGCATT  -3′(序列11)和3′引物5′- GGGAATTCAACGATGCATTTCTGGCC-3′(序列12)以相同的方式制备了将 不含对Fisp 12序列相似性的Cyr 61中心部分(氨基酸163到229)与GST融合 的构建体。将它们直接克隆到pGEX2T载体(Pharmacia-LKB，Inc.)并通过 序列测定证实该克隆。依据生产商的说明在谷胱甘肽琼脂糖凝胶 4B(Pharmacia-LKB，Inc.)上分离了GST融合蛋白，并用于免疫新西兰白兔。 对于亲合纯化，先将抗血清通过GST-蛋白亲合柱以除去产生的抗GST抗 体，然后通过GST-Fisp 12或GST-Cyr 61蛋白亲合柱以分离抗Fisp 12 或抗Cyr 61的抗体(Harlow et al.，1998)。\n这些抗体免疫沉淀正确大小的由fisp 12 mRNA指导体外合成的Fisp 12 蛋白产物。抗体对Fisp 12多肽具有专一性，不显示与Cyr 61的交叉反应性。\n亦已知识别CTGF的多克隆抗体。美国专利No.5,408,040，第7栏，41 行至第9栏，63行，以参考文献并于此处，它如上所述揭示了PDGF和CTGF 的免疫交叉反应性。\n                     实施例12\n                     抑制性肽\n本发明另一实施方案涉及将抑制性肽用于设计为抑制Cyr 61蛋白活性 的治疗策略中。一种方法是基于Cyr 61的蛋白序列合成一种抑制性肽。例如， 一种含有鼠Cyr 61(序列2)和人Cyr 61(序列4)是保守氨基酸序列的肽竞争天 然Cyr 61的结合位点。这一竞争从而抑制了天然Cyr 61的作用。例如，通 过熟知途径施用抑制性肽抑制了Cyr 61影响导致血液凝结，肿瘤血管形成， 或眼的不正常血管形成(例如，特征为视网膜或玻璃体液血管形成的眼疾)等 级联事件的能力。特别地，如下所述，一种抑制性肽防止了Cyr 61对组织因 子途径抑制剂或TFPI作用的抑制。\n在本发明一个实施方案中，设计抑制性肽与Cyr 61竞争。如此处公开的 对Cyr 61活性的多种测定中所述，这些抑制性肽，类似于前述实施例中的抗 体，例3Cyr 61活性的调节剂。通过鼠Cyr 61，Fisp 12和Nov(一种禽原癌 基因)之间序列的比较指导了肽的设计。这一家族多个成员的氨基酸序列比较 于图1。这种序列比较为合理设计多种抑制性肽提供了基础。一些设计肽， 例如跨越序列2的氨基酸48-68(序列13)，115-135(序列14)，227- 250(序列15)，245-270(序列16)和310-330(序列17)的肽，已经得到了 合成。鼠Cyr 61氨基酸序列和人Cyr 61氨基酸序列的比较揭示可使用人蛋 白中的类似结构域设计抑制人Cyr 61的肽。此外，序列比较可能涉及人Cyr 61 氨基酸序列；比较亦可包括人Fisp 12同系物，结缔组织生长因子，亦确认为 这一蛋白家族的成员，O′Brien et ol.(1992)。\n亦可设计抑制性肽与其它ECM信号分子，例如Fisp 12或CTGF竞争与 它们各自受体的结合。通过ECM信号分子间氨基酸序列的相似性促进了抑 制性肽的设计。此外，还可通过本技术领域已知的一种或几种用于确认氨基 酸序列中可能含有的功能性结构域(例如，作为外部/表面蛋白结构域的亲水 性氨基酸序列；作为跨膜结构域的与α-螺旋相一致的序列)的方法指导抑制 性肽的设计。如本技术领域普通人员所知，这些方法已经存在商品化软件。 参看例如，生物分子分析程序智能遗传组合(the Intelligenetics Suite of Analytical Program for Biomolecules).Intelligenetics，Inc.，Mountain View，CA. 使用这些方法可能设计出妨碍诸如Cyr 61，Fisp 12或CTGF等ECM信号分 子的生物学活性的抑制性肽。设计了抑制性肽的氨基酸序列后，可通过多种 熟知技术，包括但不限于重组产生和化学合成实现这种肽的产生。如上面实 施例10所述，对Cyr 61至少一种生物学活性显示专一抑制的例示肽包括呈 现“RGD”基序，或诸如“RGDS”，“RGESPK”，“GDR”或“SGDR” 的基序变体的肽(Ruoslahti，et a1.，Science 238：491-497[1987]，Ruoslahti，E.， Ann，Rev.of Cell and Dev.Biol.12：698-715[1996])。\n                            实施例13\n                            细胞粘着\n本发明另一实施方案涉及使用Cyr 61介导对胞外基质的细胞粘着。使用 鼠Cyr 61，纤连蛋白和牛血清白蛋白(BSA)研究了对细胞粘着的诱导。在4 ℃下，用50微升含0-30微克/毫升浓度的鼠Cyr 61或纤连蛋白的0.1％BSA 的PBS溶液包被免疫学96孔板(Falcon商标)。暴露于包被溶液两小时后，加 入未稀释的免疫或预防免疫抗血清(30微升/孔)，或亲合纯化的抗Cyr 61抗 体。将有些孔的包被混合液调节至10mM DTT或100mM HCl。温育16小时 后，除去包被液并在室温下用磷酸盐缓冲液(PBS)中1％BSA封闭孔表面1 小时。以5×103-104细胞/孔将HUVE细胞铺板于Ham完全F12K培养基 [GIBCO-BRL，Inc.；Ham，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)53：786(1965)]。 在铺平板前即刻将环己酰亚胺加至100微克/毫升并在铺板前14小时将莫能 菌素加至1μM。在37℃下温育2小时后，用BPS冲洗孔并用亚甲蓝将粘 着细胞固定和染色。通过定量染色抽提并在650纳米(nm)测量抽提物吸光度 确定了粘着效率。Oliver et al.，J.Cell.Sci.92：513-518(1989)。\nHUVE细胞对单独用BSA处理的平皿粘着很差，但对用纤连蛋白涂层 的平皿粘着良好。鼠Cyr 61涂层表面亦以剂量依赖方式支持HUVE细胞粘 着，类似于纤连蛋白。例如，在1微克/毫升，Cyr 61和纤连蛋白产生的A650 值为0.1。A650值为0.5对应6×103个细胞的粘着。在测试浓度范围的另 一端，30微克/毫升，Cyr 61产生的A650为0.8；纤连蛋白产生的A650为 0.9。Cyr 61亦促进NIH 3T3细胞的粘着，但不如纤连蛋白有效。通过光学 显微镜镜检，可在铺平板后早至30分钟时观察到Cyr 61介导的细胞粘着。\nHUVE细胞在鼠Cyr 61涂层表面的粘着可被抗Cyr 61抗血清和亲合纯 化的抗Cyr 61抗体专一性抑制，但不被预免疫血清抑制。与此相反，细胞对 纤连蛋白涂层平皿的粘着不受抗Cyr 61抗血清或亲合纯化的抗Cyr 61抗体 影响。这些结果表明细胞粘着的增强是Cyr 61蛋白的特异活性。此外，Cyr 61 介导的细胞粘着对环己酰亚胺或莫能菌素处理不敏感，表明Cyr 61并非通过 诱导ECM组分从头合成，刺激纤连蛋白或胶原分泌起作用。另外，这些数 据支持Cyr 61对细胞有效粘着直接作用。通过引入EGTA可完全去除Cyr 61 介导的HUVE细胞粘着；然而，可通过向培养基中添加CaCl2或MgSO4重新 恢复粘着。这些结果暗示Cyr 61和其细胞表面受体之间的4互作用需要二价 阳离子，与上面实施例10中所述的导致确认αvβ3整联蛋白是Cyr 61受体 的观察相一致。\n利用Cyr 61促进细胞粘着的能力和诸如抗Cyr 61抗体的分子抑制该过 程的能力进行细胞粘着调节剂的检测。该检测涉及细胞对表面，例如用cyr 61 包被和怀疑的细胞粘着调节剂包被的塑料组织培养孔的粘着的比较。作为对 照，将Cyr 61单独包被到类似表面。与合适的细胞接触后，检测粘着到表面 的细胞。根据在怀疑的调节剂存在下的细胞粘着相对于Cyr 61包被表面细胞 粘着的相对增加，确定细胞粘着的促进剂。根据在怀疑的调节剂存在下细胞 粘着的相对降低确认细胞粘着的抑制剂。\nCyr 61受体的确定导致形成了对Cyr 61的快速和专一的配体受体测定 (即整联蛋白结合测定)。已经叙述了单克隆抗体LM 609(抗αvβ3)。Cheresh， 1987。单克隆抗体JBS5(抗纤连蛋白抗体)购自Chemicon。抗人和抗牛玻连 蛋白抗血清来自Gibco BRL。HRP-缀合的羊抗兔抗体来自KPL. RGDSPK肽来自Gibco BRL；RGDS和SDGR肽来自美国肽公司(American Peptide Company)。将用于功能测定的肽以10毫克/毫升溶于PBS并用氢氧化 钠将pH值调至7.5-8.0。人血浆玻连蛋白来自Collaborative Biomedical Products。\n如Pytela et al.，Meth.Enzymol.，144：475-489(1987)中所述从HUVE 细胞裂解物中纯化了αvβ3整联蛋白。简要地说，将108细胞在含有1mM CaCl2，1mM MgCl2，0.5mM PMSF和100mM辛基葡糖苷(octylglucoside)的 1毫升PBS中裂解。将裂解液过含RGDSPK琼脂糖凝胶(如Lam，S.C.-T.， J.Biol.Chem.，267：5649-5655(1992)中所述从溴化氰活化的琼脂糖凝胶CL 4B制备)的0.5毫升柱四次。在室温下用10毫升裂解缓冲液冲洗柱并用2毫 升含1mM RGDS肽的相同缓冲液洗脱。将αvβ3整联蛋白对含有1mM CaCl2，1mM MgCl2，5mM辛基葡糖苷和0.1mM PMSF的PBS透析，更换 透析液三次以除去RGDS肽。将蛋白质等份贮存于-70℃。通过在非变性 条件下的SDS-PAGE及随后的银染确定了整联蛋白的纯度。与抗CD 47 抗体的Western印迹表明这种αvβ3整联蛋白制剂不含任何整联蛋白相关蛋 白。\n根据Brooks et al.，Cell 85：683-693(1996)和Lam，S.C.-T.(1992)中所 述发展了整联蛋白结合测定。在96孔免疫学Pro-Bind板(Falcon)的每孔中 加入总体积为50微升的大约50钠克整联蛋白并在4℃下培养过夜。在同种 缓冲液中用20毫克/毫升BSA封闭非专一性位点并用该缓冲液洗四次。将处 理的平板在室温下与1微克/毫升Cyr 61或0.1毫克/毫升玻连蛋白一起温育3 个小时。EDTA(5mM)，RGDS肽(0.5mM)和封闭抗体或在加入蛋白质配体前 与固定化整联蛋白预培养1小时或与配体同时加入。LM 609腹水的最终稀 释度为1∶200。通过专一性多克隆抗血清(在含有1mM CaCl2，1mM MgCl2，和5毫克/毫升BSA的PBS中将抗Cyr 61稀释1∶500，将抗玻连 蛋白抗血清稀释1∶1000)继之以次级抗体-辣根过氧化物酶缀合物(同种缓 冲液中1∶20000)。每次温育后用含有1mM CaCl2和1mM MgCl2的PBS洗 平板四次。用HRP免疫测定试剂盒(Bio-Rad Laboratories)检测辣根过氧化 物酶(HRP)。将比色反应在室温进行15-30分钟，通过加入H2SO4终止， 测定在450钠米的吸光度。本领域一般人员能够理解可使用多种测定方法代 替举例的酶联免疫学方法。例如，诸如放射性标记，荧光化合物和类似的可 例如以共价方式结合到抗体的标记或诸如Cyr 61的识别感兴趣肽的其它试 剂。\n整联蛋白结合测定表明玻连蛋白和Cyr 61结合到固定的整联蛋白。此 外，Cyr 61和玻连蛋白结合到αvβ3都是可饱和的。Cyr 61达到饱和的浓 度显著高于玻连蛋白饱和所需浓度。这一区别反映了αvβ3对Cyr 61比对 玻连蛋白亲合性低，这与细胞粘着测定的结果是一致的，该测定表明HUVE 细胞以浓度依赖方式粘着到玻连蛋白，并较弱的粘着到Cyr 61(参看下面)。 通过使用下列多种技术中的一种，包括除去二价阳离子，RGDS肽竞争，以 及LM 609抗体抑制等封闭整联蛋白的配体结合位点，论述了相互作用的专 一性。EDTA，RGDS肽，和LM 609抗体可抑制两种蛋白(Cyr 61和玻连蛋白) 与αvβ3的相互作用。Cyr 61与αvβ3相互作用的这些特征亦与细胞粘着 测定一致，表明HUVE对Cyr 61的粘着是由Cyr 61和αvβ3整联蛋白的直 接相互作用介导的。\n此外，Cyr 61诱导粘着斑，即细胞骨架吸附的细胞表面焦点。粘着斑受 细胞表面蛋白复合体或簇的影响。这些蛋白簇是复杂的，包括来自整联蛋白 家族的多种受体，以及多种蛋白激酶。Cyr 61诱导粘着斑反映了Cyr 61引 导这些细胞表面蛋白簇特定成员的能力。例如，Cyr 61引导粘着斑激酶，一 种125KDa多肽，以及桩蛋白，另一种已知属于粘着斑细胞表面蛋白复合体 的蛋白质的磷酸化。此外，间接免疫荧光研究表明Cyr 61结合的受体(参看 上面)在粘着斑中。粘着斑同样也是粘着斑复合体的特征。粘着斑激酶，桩蛋 白，和αvβ3整联蛋白共同位于由Cyr 61引导的通过粘着斑复合体形成产 生的粘着斑。这些粘着斑蛋白复合体在细胞表面结合Cyr 61；复合体亦在内 部粘着到细胞骨架。因而，鼠Cyr 61和人Cyr 61(参看下面)部分为粘着分子， 这一特征将Cyr 61与传统生长因子相区别。本技术领域熟练人同亦可认识到 可使用αvβ3整联蛋白，结合Cyr 61，来筛选Cyr 61结合到其受体的调节 剂。在一个实施例中，将整联蛋白固定并暴露于(a)Cyr 61和一种怀疑的受体 结合调节剂；或(b)单独的Cyr 61。随后，例如通过使用本技术领域已知技术 诸如放射性标记，荧光标记，或使用催化比色反应的酶标记的抗Cyr 61抗体， 检测结合的Cyr 61。相对于单独Cyr 61的结合，Cyr 61与其受体结合的促 进剂能增加Cyr 61的结合(抑制剂则降低Cyr 61的结合)。\n本发明另一实施方案中，通过细胞扩展测定评价了鼠Cyr 61对细胞形态 发生的影响。用2毫升含10微克/毫升Cyr 61或纤连蛋白的带有0.1％BSA 的PBS将聚苯乙烯培养皿包被并如上所述处理。第三个培养皿用BSA处理， 用作对照。每一平皿接受7×106细胞并培养2小时。通过显微镜100倍放 大测定细胞扩展。结果表明，鼠Cyr 61以对纤连蛋白大致相同的程度诱导 HUVE细胞的扩展。在鼠Cyr 61涂层基质上的有效粘着(参看上面)和细胞扩 展表明，Cyr 61可能与一种信号转导细胞表面受体相互作用，导致细胞骨架 重排和可能的粘着斑形成等级联反应。因而，有可能证明Cyr 61和Cyr 61 相关多肽在控制细胞粘着中是有用的，例如，下述的伴随癌细胞移动，器官 修复和再生，或假体的软骨移生的细胞粘着。\n与介导HUVE细胞粘着和迁移的鼠Cyr 61相对比，发现人Cyr 61(h Cyr 61)介导HUVE细胞粘着但不介导HUVE细胞的扩展。在4℃下使用在含有 0.1％无蛋白酶BSA(Sigma)的磷酸盐缓冲液(PBS)中的0.1-30微克/毫升 hCyr 61，纤连蛋白(Gibco BRL)或玻连蛋白(Gibco BRL)涂层免疫板(96孔 ProBind检测板，Falcon)16小时。在室温下用含有1％BSA的PBS封闭孔1 小时并用PBS冲洗。用含0.02％EDTA的PBS收获HUVE细胞，用无血清 F12培养基洗两次并重新悬浮于无血清F12。在一些实验中，将fbs加至5 -10％。在涉及玻连蛋白涂层平板的实验时，还通过使用牛多克隆抗玻连蛋 白抗体(Gibco)免疫亲合层析除去fbs中的玻连蛋白。Norris et al.，J.Cell Sci. 95：255-262(1990)。以每孔104细胞涂布细胞。2小时后，用4％低聚甲 醛(paraformaldehyde)固定细胞，用亚甲蓝染色并如所述定量，Oliver et al.，J. Cell Sci.92：513-518(1989)。\n在无血清条件下，h Cyr 61介导HUVE细胞粘着但不介导HUVE细胞 的扩展。在培养基中加入血清增强h Cyr 61涂层平板的HUVE细胞粘着。在 血清存在时，在h Cyr 61上看到类似于在纤连蛋白上的HUVE细胞的粘着和 扩展。在高血清(10％)和低血清(0.5％)条件下，人Cyr 61均以剂量依赖性方 式支持HUVE细胞粘着。然而，在10％fbs存在下，在较低浓度h Cyr 61 时有最大比例的细胞粘着，并且粘着细胞的比例较高。亦发现人Cyr 61协同 玻连蛋白促进HUVE细胞粘着和扩展。在哺乳动物血清中发现的两种主要细 胞粘着蛋白是纤连蛋白和玻连蛋白，亦称为“血清扩展因子(serum spreading factor)”。参看综述，Fdding-Habermann et al.，Curr.Dpin.Cell Biol.5：864 -868(1993)。在组织培养板上细胞粘着，扩展和生长与其说依赖于血清中的 纤连蛋白，不如说依赖于血清中的玻连蛋白，原因如下：(1)在4℃下fbs批 次中显著除去纤连蛋白导致“凝结”；以及(2)在过量其它血清蛋白存在下纤 连蛋白不能有效涂层培养板。与此相反，在相同条件下玻连蛋白可有效涂层 培养板表面。\n比较了在模拟的免疫耗竭fbs和用抗牛玻连蛋白抗体免疫耗竭的血清存 在下HUVE细胞粘着h Cyr 61-包被板的能力。在可溶性玻连蛋白或模拟免 疫耗竭fbs存在下HUVE细胞对h Cyr 61包被表面的粘着显著好于在无血清 培养基或补充有玻连蛋白免疫耗竭fbs培养基存在的情况。向玻连蛋白免疫 耗竭血清中加入玻连蛋白(30微克/毫升)可重建HUVE细胞在h Cyr 61涂层板 上粘着和扩展的能力，可达到在细胞粘着测定中使用全血清时观测的水平。 此外，单独的可溶性玻连蛋白，在浓度相当于它在10％血清(30微克/毫升) 中时，可重建细胞粘着和扩展的水平至在10％血清存在下观察到的水平。因 而，玻连蛋白是促使HUVE细胞在h Cyr 61涂层板表面粘着和扩展的必需和 充分血清成分。对照研究表明玻连蛋白的作用并非归因于它在h CYR 61存 在下的塑料培养板表面的优先保留。\n另外，检查了在提高量的玻连蛋白存在下HUVE细胞粘着和扩展。用于 涂层平板的溶液含有增强量的玻连蛋白(0-10微克/毫升)和固定量的h Cyr 61(10微克/毫升)。结果表明粘着到两种蛋白涂层板的细胞多于单独加入玻连 蛋白和h Cyr 61的粘着能力所预期。这种在玻连蛋白和h Cyr 61存在下的粘 着的非加性增加并非归因于培养板上吸附的较高量的玻连蛋白。用抗人玻连 蛋白抗体的ELISA测定显示暴露于玻连蛋白/h Cyr 61混合物的塑料平皿吸附 的玻连蛋白的量化单独使用玻连蛋白是多不超过20％。这一差别不足以解释 观察到的细胞粘着的差别(在不同实验中差3-5倍)。此外，粘着到涂层溶 液含稀释玻连蛋白(2.5微克/毫升)的蛋白混合物的HUVE细胞亦高于粘着到 用高浓度纯玻连蛋白(10微克/毫升)或纯h Cyr 61(10微克/毫升)涂层平皿的细 胞。因而，玻连蛋白和h Cyr 61在功能上协作并显示对HUVE细胞粘着的协 同效应。\n亦研究了Fisp 12影响细胞粘着的能力。基本上如(Oliver et al.，1989)所述 进行了Fisp 12粘着测定。在4℃下，用含0.1毫克/毫升BSA的PBS中20 微克/毫升Cyr 61，Fisp 12或纤连蛋白(Gibco BRL)包被96孔免疫培养板16 个小时，并在室温下用10毫克/毫升BSA阻断1个小时。将HUVE细胞以 104细胞/孔在含10％FBS的F12K培养基(Hyclone Laboratories，Inc.，Logan， Utah)上铺平板；将NIH 3T3成纤维细胞以3×104细胞/孔并将Mvl Lu细胞 以5×104细胞/孔在含10％FBS的极限必需培养基(MEM)上铺平板。培养1 小时后，如(Oliver et al.，1989)所述将细胞固定，用亚甲蓝染色并定量。测定 了用2.5毫升20微克/毫升Cyr 61，Fisp 12或纤连蛋白涂层的100毫米聚苯 乙烯平皿上涂布细胞的细胞扩展。在每一平皿涂布107细胞并在涂板90分钟 后通过显微镜100×放大测定细胞扩展。\n结果表明，当包被到塑料平皿时，Fisp 12和Cyr 61可促进三种不同细 胞类型的粘着：HUVE细胞，NIH 3T3成纤维细胞，以及mink肺上皮(MvlLu) 细胞。这些细胞对未包被塑料平皿或用牛血清白蛋白包被塑料平皿的粘着很 差，但对用纤连蛋白，Cyr 61或Fisp 12包被的平皿粘着显著良好。Cyr 61 或Fisp 12介导所有三种细胞类型细胞粘着的能力与纤连蛋白相当。由于先前 已证明了Cyr 61介导成纤维细胞和内皮细胞的细胞粘着(Kireeva et al.， 1996)，这些研究表明了Fisp 12和Cyr 61除了内皮细胞和成纤维细胞之外还 在上皮细胞中具有细胞粘着活性。\n与对纤连蛋白和Cyr 61的细胞粘着(Kireeva et al.，1996)类似，当向培养 基中加入EDTA时抑制了Fisp 12介导的细胞粘着。通过加入过量氯化镁可完 全消除这种抑制，表明Fisp 12介导的细胞粘着需要二价阳离子。除了细胞粘 着，Fisp 12亦促进细胞扩展。当将NIH 3T3细胞在包被了纤连蛋白，Cyr 61 或Fisp 12，但不含BSA的平皿上培养时发现类似的细胞扩展。当在纤连蛋 白，Cyr 61，或Fisp 12上铺平板上亦发现内皮细胞和上皮细胞的扩展\n                            实施例14\n                         成纤维细胞的迁移\nCyr 61亦可影响软骨细胞，例如与骨骼发育有关的成纤维细胞。特别 地，与仅仅影响骨骼发育和维持的多种生长相关蛋白相比，Cyr 61影响软骨 的发育以及可能影响其维持。使用改良的Boyden槽(Boyden chamber)测定了 NIH 3T3细胞对鼠Cyr 61的趋化反应(Neuroprobe Inc.，catalog no.AP48).Gro tendorst，Meth.Enzymol.147：144-152(1987)。将纯化的Cyr 61蛋白在含 有牛血清白蛋白(BSA；0.2毫克/毫升)的DMEM中系列稀释并加到槽的较低 孔。然后用胶原涂层的聚碳酸酯滤膜(8微米孔径；Nucleopore Corp.， Pleasanton，CA)覆盖较低的孔。然后将细胞(6×104)加样到较高的孔。培养5 小时后(10％二氧化碳，37℃)，除去滤膜，固定细胞，并使用瑞脱-吉姆萨 染液(Wright-Giemsa Stain)(Harleco formulation；EM Diagnostic Sy stems， Gibbstown，NJ)染色。然后用组织拭子(swab)从滤膜上层表面拭下细胞。通过 计数在滤膜下表面上十个随机选取的高分辨显微镜视野(400倍放大)中测到 的迁移细胞的总数，确定了趋化反应。每一实验尝试两次并重复实验三次， 以保证数据的重现性。\n在Boyden槽测定中，NIH 3T3对Cyr 61的反应为剂量依赖方式的趋化 因子。不含Cyr 61时，每一高分辨视野迁移大约4.8个细胞。存在0.5微克/ 毫升鼠Cyr 61时，每一视野发现大约5.2个细胞。当Cyr 61浓度增至1，5，10 微克/毫升时，每一视野检测到的平均迁移细胞数升至7.5，18.5，和18.7。因 而，鼠Cyr 61是成纤维细胞的趋化剂。在这一测定中，Cyr 61趋化活性最 适浓度为1-5微克/毫升；这一浓度范围与报道的其它ECM分子提供有效 趋化刺激的范围是一致的。例如，血小板反应素，在5-50微克/毫升，对 内皮细胞具有趋化效应(Taraboletti et al.，J.Cell Biol.111：765-772(1990)； 如使用相似的Boyden槽测定的，纤连蛋白在1-30微克/毫升亦具有趋化功 能(Carsons et a1.，Role of Fibron ectin in Rheumatic Diseases，in Fibronectin[Mosher，ed.，Academic Press 1989]；Carsons et al.，Arthritis.Rheum. 28：601-612[1985])。可将人Cyr 61多肽以类似于鼠Cyr 61的方式用于化 学引诱成纤维细胞。如美国专利No.3,408,040，第7栏，65行至第11栏第7 行所述，亦报道了人CTGF诱导非人哺乳动物细胞诸如NIH 3T3细胞(鼠成纤 维细胞)和BASM细胞(牛主动脉平滑肌细胞的)的迁移。\n在另一实施方案中，测定细胞迁移，诸如软骨细胞迁移的调节剂，涉及 将怀疑的细胞迁移调节剂和Cyr 61共同加到Boyden槽的下孔中。作为对照， 将Cyr 61单独加到另一Boyden槽的下孔。然后测量相对细胞迁移。有怀疑 的调节剂存在时的细胞迁移相对于对应单独的Cyr 61时的细胞迁移的增加， 确定了软骨细胞迁移的促进剂，而存在怀疑的调节剂的细胞迁移的相对减少 确定了抑制剂。\n                           实施例15\n                    内皮细胞的迁移-体外测定\n体外血管形成的终产物是类毛细管的管的精细网络(well-defined netuork)。当在例如胶原，血纤蛋白，或Matrigel凝胶等凝胶基质上培养时， 内皮细胞在形成成熟的管之前必须首先侵入基质。(Matrigel是包括层粘连蛋 白，IV型胶原，巢蛋白，和硫酸肝素蛋白聚糖的基底膜蛋白与其它生长因 子的复杂混合物，Kleinman et al.，Biochem.25：312-318(1986)。侵入结构 为索状并逐渐联合形成类管状结构。通过有或没有Cyr 61存在下将细胞接种 到三维胶原或血纤蛋白凝胶评价了人Cyr 61对铺满的单层人脐静脉内皮细胞 的血管形成效应。HUVE细胞不能自发侵入这类凝胶，但在诸如肿瘤促进剂 等试剂诱导下可侵染。\n胶原凝胶是这样制备的，首先将I型胶原(Collaborative Research，Inc.， Bedford，MA)无菌以1∶1000(v/v)稀释于冰醋酸(每克胶原300毫升)。将产生 的溶液用无菌的三层纱布过滤并在4℃下16,000×g离心1小时。将上清液 对O.1×Eagle极限必需培养基(MEM；GIBCO-BRL.Inc.)透析并贮存于4 ℃。通过快速增加胶原溶液的pH值和离子强度，制备了重建胶原纤维凝胶。 pH和离子强度的调节是通过在无菌烧瓶中将7体积冷胶原溶液与一体积10 ×MEM和2体积碳酸氢钠(11.76毫克/毫升)迅速混合完成的。将溶液置于冰 上，防止快速的胶凝。将冷混合液散布到18毫米组织培养孔并在37℃下使 其胶凝10分钟。\n血纤蛋白凝胶是通过在即将使用前将血纤蛋白原(Sigma Chemical Co.， St.Louis，MO)溶于无钙MEM达到终浓度2.5毫克蛋白/毫升制备的。通过在 塑料管中将1.35毫升血纤蛋白原溶液与15微升含25单位/毫升凝血酶的10 ×MEM(Sigma Chemical Co.)迅速混合起始凝结。将混合液迅速转移到18毫 米组织培养孔并在37℃下使其胶凝大约2分钟。\n在一些孔中，在胶凝前将Cyr 61混合到凝胶基质(终浓度10微克/毫升)， 而在另一些孔中，凝胶基质中不含Cyr 61而是在细胞达到铺满时将其作为营 养培养基的一部分加进去(类似于在基质中的浓度范围)。以每孔5×104细胞 将HUVE细胞接种到凝胶基质表面的含10％胎牛血清，100微克/毫升肝素 和30微克/毫升内皮细胞生长因子的Ham′s F12K培养基[GIBCO-BRL， Inc.]。当细胞长至铺满时，除去培养基，用PBS洗细胞，并补充不含内皮细 胞生长因子的新鲜培养基。一些培养物接受了纯化的重组Cyr 61，而其它的 接受了Cyr 61/和多克隆抗Cyr 61抗体。从而得到了多种铺满的培养物，包 括：a)天Cyr 61的培养物；b)在基质中含Cyr 61的培养物；c)使用Cyr 61 补充培养基的培养物；以及d)使用Cyr 61和多克隆抗Cyr 61抗体补充培养 基的培养物。\n在处理铺满的培养物大约4-7天后定量了凝胶基质的侵染。使用Zeiss Axiovert倒像显微照相机在相差显微镜下拍摄每一孔中随机选择的量度为1.0 毫米×1.4毫米的视野。在单层表面下的一个深度拍摄照片。通过测量穿透 单层表面的所有细胞索的总长度定量侵入。至少做了组单独的实验，每一实 验至少随机选取3个视野，以每一视野中以微米为单位的平均长度表示结 果。\n为了测定基质内索状网络的类毛细管的管状物的形成，使用含2.5％戊 二醛和1％鞣酸的pH值7.4的100mM二甲胂酸钠原位固定培养物。然后用 pH7.4的100mM二甲胂酸钠充分洗培养物。将凝胶切成2毫米×2毫米小块， 在含1％四氧化锇的乙酸佛罗那(Veronal acetate)缓冲液中(以降低组织膨胀； 参看Hayat，Principles and Techniques of Electron Microscopy：Biological Applications 1：38[Litton Educational Publishing，Inc.1970])后固定45分钟， 用含0.5％乙酸双氧铀的佛罗那缓冲液(veronal buffer)整体染色45分钟，用乙 醇系列梯度脱水，并包埋在扁平模子中的Epon(环氧类树脂商品名)中。用超 薄切片机垂直于培养物平面切下半薄(Semi-thin)切片，用1％甲苯胺蓝染 色，并使用Axiophot显微照相机(Zeiss)在透射光下拍照。\n在另一实施方案中，将一种怀疑的血管形成调节剂与Cyr 61联合并将联 合物在凝胶形成前或后加入。在这一实施方案中，单独使用Cyr 61建立了对 照。然后将对应于怀疑的调节剂和Cyr 61的细胞迁移与对应于单独的Cyr 61 的细胞迁移相比较。促进剂或正效应剂将会增加细胞迁移而抑制剂或效应剂 将降低细胞迁移。\n在另一个血管形成体外检测中，发展了对内皮细胞迁移的测定。这种趋 化测定表明在每毫升钠克数量级浓度测到Cyr 61的效应。将原代人微血管内 皮细胞(HMVEC PO51；Clonetics，San Diego，CA)保存于含10％供体牛血清 (Flow Laboratories，Mclean，VA)和100微克/毫升内皮细胞促细胞分裂剂 (Biomedical Technologies Inc.，Stoughton，MA)的DME中。使用传代10到15 次的细胞。为了测定迁移，在含0.1％BSA的DME使细胞饥锇24小时， 获取细胞，重悬于含0.1％BSA的DME中，并以每孔1.75×104细胞在翻 转的改进Boyden槽中胶凝的0.5微米粘膜(Nucleopore Corporation，Pleasanton， CA)的较低表面上铺平板。在37℃1-2小时后，在此时间内使其粘着到滤 膜，将槽翻转到其正常位置。以10纳克/毫升到10微克/毫升的浓度将碱性 成纤维细胞生长因子(阳性对照)，Cyr 61，或阴性对照溶液(已知缺少化学引 诱物的条件培养基或DME加BSA，参看下面)加到分开的槽的上孔。然后将 槽在37℃下培养3-4小时，使其迁移。卸下槽，将膜固定并染色，确定3 个高分辨视野中迁移到滤膜上面的细胞数。Tolsma et al.，J.Cell.Bil.122： 497-511(1993)(以参考文献并于此处)，及其引用的文献。将含0.1％BSA 的DME用作阴性对照并将bFGF(10纳克/毫升)或来自血管形成仓鼠细胞系的 条件培养物(20微克/毫升总蛋白)用作阳性对照。Rastinejad et al.，Cell 56： 345-355(1989)。在一次实验中每一样品测试四次(测试化合物包括诸如Cyr 61，阳性对照，作为阴性对照的条件培养基，以及作为阴性对照的DME加 BSA)；每一实验至少重复两次。\n为了能够比较在不同日期进行的实验，迁移的数据表示为减去DME加 BSA存在下观察到的背景迁移后计算的最大迁移率对阳性对照的百分数。降 低内皮细胞随机运动的测试化合物显示负的迁移百分数值。非常高浓度的血 小板反应蛋白(TSP)使内皮细胞从膜上解析。通过计数膜下表面的细胞测出解 析。当细胞丢失超过10％，要修正迁移细胞数的损失。结果表明0.01-10 微克/毫升bFGF诱导在每三个高分辨显微镜视野稳定的92个细胞的迁移。 在Cyr 61存在下的迁移揭示出对浓度的较高度依赖性。在10纳克/毫升时， Cyr 61诱导检测的每三个高分辨视野中平均64个细胞的迁移。在100纳克/ 毫升Cyr 61时，在三个视野中大致发现72个细胞；在1微克/毫升Cyr 61时， 迁移了峰值的87个细胞；在大约7微克/毫升Cyr 61时，观察到61个细胞； 在10微克/毫升Cyr 61时，大约发现57个细胞的迁移。阴性对照揭示，每三 个高分辨显微镜视野中有53个细胞的恒定基底水平的内皮细胞迁移。除了这 些结果之外，从这些体外测定得到的结果与如下所述从体内角膜测定中得到 的结果完全相关。\n为了监测毒性，使用一定浓度范围的每种测试化合物，在与迁移测定相 同条件下，处理内皮细胞。然后用台盼蓝将细胞染色并计数排斥台盼蓝的细 胞。结果显示细胞保持存活，抑制迁移并不赋予毒性。当其相关时，在迁移 测定前用含0.1％BSA的DME中的20μM肽预处理内皮细胞36-48小 时。亦测试了这些时间段的毒性并发现可以忽略。\nCyr 61诱导HUVE细胞的基质侵染和管状物形成的能力，以及Cyr 61 诱导人微血管内皮细胞迁移的能力，证明了这种蛋白的血管形成特性。预期 富半胱氨酸蛋白ECM信号分子家族的其它成员，诸如Fisp 12和CTGF，具 有类似的性质，可用于本发明的方法中来筛选和调节血管形成条件。特别地， 本技术领域普通技术人员可以理解一种涉及上述测定的体外检测血管形成抑 制剂的方法，包括有效量的Cyr 61，含或不含候选抑制剂。\n                             实施例16\n                     内皮细胞迁移-一种血管形成\n                        抑制剂的体外检测方法\n在前面实施例中所述的在体外迁移(即趋化性)测定中包括有效量的 ECM信号分子，诸如Cyr 61，提供了一种设计用于测定ECM信号分子和血 管形成抑制剂的检测方法。因为新血管形成在诸如实体肿瘤生长和转移等过 程中的重要作用，所以形成一种测定可能拮抗这些过程的化合物的测定方法 是有用的。\n修改上述的体外迁移测定方法，从而包括ECM信号分子，Cyr 61。包 括的Cyr 61为1微克/毫升，在滴度研究中发现为最佳剂量。如上面实施例， 使用了人微血管内皮细胞(Clonetics)。在一系列检测中，测定了多种糖类和糖 类衍生物。这些化合物包括10mM甘露糖，10mM甘露糖-6-磷酸，和 10mM半乳糖。这些测定显示，Cyr 61加甘露糖在每组三个高分辨显微镜视 野中产生大约73个细胞(参看上面)。Cyr 61加半乳糖在每组三个高分辨视野 中诱导大约74个细胞的迁移。但是，Cyr 61加甘露糖-6-磷酸在检测的 每组三个高分辨视野中产生大约2个迁移细胞。对照实验证明，甘露糖-6 -磷酸对Cyr 61活性的抑制是专一的。\n亦如上所述在含或不含甘露糖-6-磷酸的条件下测定了碱性FGF(10 纳克/毫升)的血管形成活性。存在10mM甘露糖-6-磷酸时，bFGF在每组 三个高分辨率视野中诱导51个细胞迁移；缺乏它时，bFGF诱导大约52个 细胞迁移。然而，当测试Cyr 61或胰岛素样生长因子II(IGF-II)时，甘露 糖-6-磷酸将迁移细胞数从大约分别为48或47个细胞减少到大约分别为 12或11个细胞。能够预期甘露糖-6-磷酸对IGF II活性的作用，因为已 知甘露糖-6-磷酸与IGF II竞争其共同受体(IGF II受体)。因而，甘露糖- 6-磷酸专一性抑制Cyr 61对人内皮细胞的趋化活性。并且，因为体外迁移 测定和下面所述的体内血管形成测定是一种基本完全的相关，基于此处公布 的测定结果，鉴定甘露糖-6-磷酸是血管形成的抑制剂。相应地，本发明 考虑了抑制血管形成的方法，包括施用抑制剂诸如甘露糖-6-磷酸抑制Cyr  61血管形成活性。亦可使用诸如上面所述的检测方法筛选其它血管形成抑制 剂，它们可能用于治疗与血管形成有关的疾病诸如癌症，以及伴有新血管形 成的眼部疾病。\n在本发明一个实施方案中，筛选血管形成调节剂的方法包括一种比较性 检测。一组条件涉及将细胞暴露于Cyr 61和一种怀疑的细胞迁移的调节剂的 联合。作为对照，将细胞暴露于单独的Cyr 61进行平行测定。细胞迁移的促 进剂与单独存在Cyr 61的迁移速率相比能提高体外细胞迁移速率；对一种 Cyr 61化学引诱能力的抑制剂来讲，反之亦然。\n                          实施例17\n                    内皮细胞迁移-体内测定\n亦设计了内皮细胞迁移的一种体内测定方法。概括来讲，测定方案与 Tolsma et al.，1993中的公开内容一致。为了评价与肉芽组织形成相关的血管 形成(即，在愈合过程中伤口周围新形成的增殖性成纤维细胞皮肤组织)，如 先前所述使用了海绵移植物(Fajardo et al.，Lab.Invest.58：718- 724[1988])。通过首先除去海绵的2毫米直径中心区制备了聚乙烯醇泡沫盘 (10毫米直径×1毫米厚度)。将PBS或100μM RGDS肽(其它可能的测试 组合物包括Cyr 61片段，RGDS肽，诸如甘露糖-6-磷酸的小分子)加到 海绵核心然后用5微升无菌海昌(Hydron)(Interferon Sciences，New Brunswick， NJ)涂层。固化后，将涂层的核心还原到海绵中心，然后用5微米滤膜覆盖在 两侧并用胶水固定(Millipore Corp.，Bedford，MA)。然后将一个对照和一个测 试盘移植到麻醉的Balb/c母鼠下腹部皮下，该处肉芽组织能侵染自由的盘的 周边。用自动小夹封闭伤口并在杀死动物前不再扰动它。\n如先前所述获得对原位掺入盘上内皮细胞中的胸苷的定量评估 (Polverini，et al.，J.Immunol.118：529-532[1977])。在移植后5，7，10和14 天评价海绵移植体。在杀死小鼠30分钟前，向其注射含[3H]-胞苷的盐溶液 (特异活性6.7居/mM；New England Nuclear/Du Pont，Wilmington，DE)至每克 体重1微居的水平。取小海绵并面向包埋以提供整个周长的标准切面。将组 织在10％中性缓冲液的福尔马林中固定，通过系列乙醇梯度脱水，并包埋在 异丁烯酸二醇中(glycol methacrylate)(Polysciences，Miles，IL)。通过将载于酸洗 玻璃载片的切片浸入NTB2型乳剂(Eastman Kodak)制备放射自显影。在4℃ 下曝光4周后，在半强度D-19显影液中冲洗放射自显影像，在Kodak Rapid Fixer中固定，并用苏木精和伊红染色。通过在油镜下(×1,000)直线扫描计数 排列成毛细血管和小静脉从海绵周围扩展到中心的所有内皮细胞进行了内皮 细胞标记的定量。在含有PBS，TSP，或肽片段(即，血小板反应蛋白片段)的 两块海绵中均计数到总计500-700的内皮细胞。在细胞核中测到5个或更 多颗粒时认为细胞是标记了的。计算了标记细胞的百分数并从对照和实验海 绵得到的数据进行X平方(chi-square)分析。\n上述测定的结果证实血小板反应蛋白可抑制血管形成过程。更普遍地， 本技术领域一般技术人员将会理解本发明的范围扩展到那些用于测定ECM 信号分子活性，诸如Cyr 61诱导细胞迁移趋化活性的怀疑的调节剂的体内检 测方法。与本发明的其它测定方法类似，一个比较的测定方法包括将细胞暴 露于在有或没有Cyr 61活性怀疑的调节剂存在下充满Cyr 61的海绵。在移 植，培养和取下后，测定细胞迁移的相对速率。与单独使用Cyr 61诱导的细 胞迁移相比，Cyr 61活性的促进剂将增加细胞迁移速率；相对于单独使用 Cyr 61的水平，抑制剂将降低细胞迁移速率。\n                        实施例18\n                    增强促细胞分裂剂\n本发明的另一方面，鼠Cyr 61增强生长因子对成纤维细胞和内皮细胞的 促细胞分裂效应。当使用非饱和剂量的碱性成纤维细胞生长因子(bGFG)或血 小板衍生生长因子(PDGF-BB)处理NIH 3T3成纤维细胞或HUVE细胞时， 与单独使用生长因子相比，加入鼠Cyr 61显著增加掺入的放射性标记的胸 苷。胸苷掺入测定是一种标准技术，通过评价细胞进入S期并合成DNA的 程度测定细胞是否活性生长。Cyr 61对bFGF或PDGF-BB诱导的胸苷掺 入的增强是剂量依赖的，对每种细胞类型所需重组蛋白最低浓度为0.5-1.0 微克/毫升。通过加入专一性抗Cyr 61抗血清可抑制Cyr 61对DNA合成的增 强。\n更特定地，将NIH 3T3成纤维细胞以3×104细胞/孔在24孔板上铺板 并在含10％胎牛血清的DMEM(Intergen Co.，Purchase，NY)中生长3-4天， 然后用含有0.2％FBS的培养基温育48小时。然后将下述组合物以插句中所 示终浓度加到含0.2％fbs和[-3H]-胞苷的新解培养基(终浓度)微居/毫升； ICN Biomedicals，Inc.，Costa Mesa，CA)中的铺板细胞；bFGF(15纳克/毫升)， PDGF-BB(30纳克/毫升)，和鼠Cyr 61(0.5-5微克/毫升)。依据下列模式 将这些组合物加入各板：1)无添加物；2)鼠Cyr 61；3)bFGF；4)鼠Cyr 61 和bFGF；5)PDGF-BB；以及6)鼠Cyr 61和PDGF。温育18-20小时 后，用PBS洗细胞并用10％三氯乙酸固定。将DNA溶解于0.1N氢氧化钠 并测定胸苷的掺入。结果表明，在缺少生长因子时鼠Cyr 61不刺激通过氚标 记胸苷掺入测量的DNA合成。存在或不存在Cyr 61时，没有添加物的3T3 细胞的掺入大约为18×104每分钟计数(cpm)的[3H]-胸苷。暴露于单独的 bFGF的细胞掺入大约1.2×105cpm；接触bFGF和鼠Cyr 61的细胞掺入为2 ×105cpm。接受PDGF-BB的细胞掺入大约为1.2×105cpm；暴露于PDGF -BB和鼠Cyr 61的细胞掺入大约为2.4×105cpm。因此，鼠Cyr 61本身 并不具有促细胞分裂功能，但确实能增强两种已知的生长因子，bFGF和 PDGF-BB的促细胞分裂活性。\n鼠Cyr 61增强不同水平bFGF的促细胞分裂效应的能力亦揭示对生长因 子的阈值需求。基本如上对3T3细胞所述将人脐静脉内皮细胞铺平板并暴露 于定量的鼠Cyr 61；对照不接受Cyr 61。然后将不同的板暴露于不同水平 的bFGF，包括从0到10钠克/毫升范围的系列bFGF浓度。在[3H]-胞苷存 在下培养生长72小时后，在Cyr 61存在或不存在情况下，暴露于0-0.1 纳克/毫升bFGF的细胞显示基线水平的胞苷掺入(大约4×1022cpm)。在1纳 克/毫升bFGF时，HUVE细胞在bFGF存在下将其胸苷掺入增殖6× 102cpm；在1纳克/毫升bFGF和鼠Cyr 61存在下，HUVE细胞掺入1.3× 103cpm。在10纳克/毫升bFGF时，暴露于bFGF的细胞掺入大约1.8×103cpm 胸苷；接受10纳克/毫升bFGF和Cyr 61的细胞掺入大约6.1×103cpm。\n通过涉及HUVE细胞和bFGF，Cyr 61，及抗Cyr 61抗体的多种组合 的胸苷掺入检测证实了鼠Cyr 61增强bFGF促细胞分裂活性的能力。如上所 述铺板和培养细胞。在加入到各平板之前，将下列补充物组合(最终平板浓度 在插句中说明)预培养1小时：1)预免疫抗血清(3％)；2)bFGF(15纳克/毫升) ×和预免疫抗血清(3％)；3)预免疫抗血清(3％)和Cyr 61(4微克/毫升)；4) 预免疫抗血清(3％)，Cyr 61(4微克/毫升)，和bFGF(15纳克/毫升)；5)抗 Cyr61抗血清(3％)；6)抗Cyr 61抗血清和bFGF(15纳克/毫升)；7)抗Cyr 61 抗血清(3％)和Cyr 61(4微克/毫升)；以及8)抗Cyr 61抗血清(3％)，Cyr 61(4 微克/毫升)，和bFGF(15纳克/毫升)。\n如上所述在[3H]胸苷存在下培养后，暴露于预免疫抗血清的细胞掺入大 约2×102cpm胸苷；接触预免疫抗血清和bFGF的细胞掺入13×103cpm； 接受预免疫抗血清和Cyr 61的细胞掺入1×102cpm；接受预免疫抗血清， Cyr 61，和bFGF的细胞掺入3.6×103cpm；暴露于抗Cyr 61抗血清的细胞 掺入2×102cpm；接受抗Cyr 61抗血清和bFGF的细胞掺入大约1.3× 103cpm；接触抗Cyr 61抗血清和Cyr 61的细胞掺入大约1×102；接受抗 Cyr 61抗血清，Cyr 61，和bFGF的细胞掺入1×103cpm。这些结果表明 预免疫抗血清对Cyr 61诱导的bFGF促细胞分裂活性增强没有作用。但是， 抗Cyr 61抗血清完全废止了Cyr 61对bFGF的增强。此外，因为抗Cyr 61 抗血清对bFGF本身的促细胞分裂活性无影响，所以抗Cyr 61抗血清的效应 对Cyr 61诱导的促细胞分裂增强是专一的。因而，Cyr 61可以用作筛选有 用的促细胞分裂剂的试剂。\n使用微小改进的先前所述的胸苷掺入(Kireeva et al.，Mol.Cell.Biol.16： 1326-1334[1996])测定了HUVE细胞和NIH 3T3成纤维细胞的DNA合成。 将HUVE细胞在24孔培养板生长至亚铺满状态，血清饥饿24小时并用含有 10％胎牛血清(FBS)，1微居/毫升[3H]-胸苷和10纳克/毫升碱性成纤维细胞 生长因子(bFGF)(Gibco-BRL，Inc.)及说明的不同浓度的Cyr 61和Fisp 12的 F12K培养基处理。将NIH 3T3成纤维细胞培养至亚铺满，血清饥饿48小时， 并用含有0.5％FBS，1微居/毫升[3H]-胸苷，bFGF和不同浓度的Cyr 61 或Fisp 12的极限必需培养基(MEM)处理。培养24小时后测定掺入到三氯乙 酸不溶的级分的胸苷。用不同浓度的TGF-β1(Gibco-BRL)和2微克/毫 升Cyr 61或Fisp 12处理对数生长的mink肺上皮细胞(MvlLu，CCL 64)18个 小时；然后将[3H]-胸苷加至1微居/毫升保持2小时。如上所述测定胸苷掺 入。\n在任何测定条件下，纯化的重组Fisp 12均不显示任何促细胞分裂活性。 但是，Fisp 12能够增强成纤维细胞生长因子诱导的NIH 3T3成纤维细胞或 HUVE细胞的DNA合成。这一活性几乎与Cyr 61的表现无法区分。\n在成纤维细胞和内皮细胞中，Cyr 61和Fisp 12增强生长因子诱导的 DNA合成，同时两种蛋白亦以其它方式增强生长因子介导的作用。已知TGF -β抑制上皮细胞中DNA合成(Satterwhite et al.，1994)。可观察到Cyr 61和 Fisp 12增强TGF-β抑制mink肺上皮细胞DNA合成的能力。数据表明从 无血清来源纯化的重组Cyr 61和Fisp 12本身不促细胞分裂，但具有协同多 肽生长因子的能力。Cyr 61和Fisp 12增强FGF诱导的DNA合成，并增强 TGF-β对DNA合成的抑制。\n本发明亦包括将CTGF用于增强真正生长因子的促细胞分裂效应或筛选 真正生长因子的方法。这些考虑的用途是与报道的将CTGF本身用作促细胞 分裂剂或生长因子相对照的。美国专利No.5,408,040，第7栏第65行至第 11栏第7行，以参考文献并于此处。\n此外，本发明包括筛选促细胞分裂增强的调节剂的方法。对照性测定中 将亚铺满的细胞暴露于诸如Cyr 61的ECM信号分子，一种生长因子，和一 种怀疑的ECM信号分子调节剂。作为对照，将类似的细胞暴露于ECM信号 分子和生长因子。进一步的对照将类似的细胞暴露于不含ECM信号分子条 件下的生长因子和怀疑的调节剂。基于通过例如[3H]-胸苷掺入测定的相对 细胞增殖速率，确定怀疑的调节剂是促细胞分裂剂增强的促进剂(在三种分子 共存在下提高细胞增殖)或是促细胞分裂剂增强的抑制剂(在三种分子存在下 降低细胞增殖。)\n                           实施例19\n                 血管形成因子和调节剂的角膜测定\n另一种血管形成调节剂的测定是一种体内测定，以评价怀疑的调节剂在 ECM信号分子相关生物材料诸如Cyr 61存在下对血管形成的效应，称为角 膜测定。角膜测定利用角膜中缺乏血管，在血管形成因子存在下时，导致从 巩膜延伸至角膜的可测的毛细血管发育。Friedlander et a1.，Science 270： 1500-1502(1995)。这种新血管从巩膜的向内长可通过显微镜监测。此外， 可使用迁移的可见测定速率评价血管形成速率的变化。可利用多种动物模型 进行这些角膜测定。优选地，使用大鼠进行角膜测定。作为实施例，公开了 使用这种测定方法进行的Cyr 61怀疑的调节剂的测定。为了进行这一测定， 首先使用原代毛细血管内皮细胞滴定以确定Cyr 61的有效浓度。随后，在怀 疑的调节剂存在或不存在下，将Cyr 61手术植入哺乳类实验动物例如兔子或 大鼠的角膜。在一优选实施例中，使用本技术领域标准的基质材料和技术将 Cyr 61(或Cyr 61和一种怀疑的调节剂)包埋到一种生物相容性基质。随后肉 眼观察含移植物的眼中易于看到的血管的生长。对照移植可能包括将生理平 衡缓冲液包埋于同种类型基质并将其移植到接受含Cyr 61移植体的同种实验 动物的眼中。\n对这些血管形成因子来讲，设计的检测这些因子的体内角膜测定方法优 于存在的体外测定方法。血管形成过程包括四个独立的时期：诱导血管中断， 内皮细胞运动，内皮细胞增殖，以及三维重建和出芽。体外测定只能评价其 中两个步骤：内皮细胞迁移和促细胞分裂。因而，为了提供对血管生成因子 全面检测，诸如角膜测定等体内测定方法是优选的。\n已使用角膜测定证实了诸如Cyr 61，Fisp 12，CTGF和Nov等的血管 生成因子对血管生成过程的作用。此外，通过包括任意这些血管生成因子和 一种怀疑的其活性调节剂改进的角膜测定，产生了测定血管生成调节剂的角 膜测定方法。例如，在本发明一个实施例中，在角膜测定中，使用的诸如Cyr  61的血管生成因子剂量是Cyr 61血管生成活性的正效应因子。首先通过滴定 Cyr 61与血管生成事件的剂量反应关系来确定Cyr 61的合适剂量。包括一种 缺少Cyr 61的对照测定将消除对血管生成有直接效应的组合物。在本发明另 一实施例中，可使用有效剂量的诸如Cyr 61的血管生成因子来测定一种血管 生成因子活性的负调节剂。在又一实施例中，一种角膜移植体含Cyr 61，另 一角膜移植体含Cyr 61和一种怀疑的血管生成调节剂。测量移植的角膜中的 血管发育为确认一种怀疑的调节剂是血管形成促进剂提供了基础(含有包括 怀疑的调节剂的移植体的角膜中增强的血管发育)。血管发育的相对降低鉴定 出血管生成的抑制剂。\n大鼠是角膜测定的优选动物模型。本技术领域的公开物已将大鼠模型建 立为测定血管形成的良好表征的系统。已经详细表征了诸如移植物大小，蛋 白释放动力学，及合适的手术技术等参数。虽然在角膜测定中可使用任何大 鼠品系，优选的品系是良好表征的实验室品系，诸如Sprague-Dawley品系。\n虽然在角膜测定中可使用多种大小的大鼠，优选的大鼠大小是150- 200克/每只动物。用甲氧氟烷诱导麻醉并用戊巴比妥钠(50毫克/公斤，腹膜 内给药)保持40-60分钟。轻轻拨开眼并通过使用非损伤性止血器夹住上眼 睑将其固定在该位置。然后将两滴无菌盐酸丙美卡因(0.5％)滴入每只眼以进 行局部麻醉。使用合适的手术刀，诸如11号Bard Parker刀，大约距角膜中 心1毫米切出大约1.5毫米切口。将切口延展至基质但并不穿过。然后将大 约1.5毫米宽和大约5毫米长的弯曲虹形铲插入到切口下缘并穿过基质钝解 剖至眼睛外眼角。在解剖中轻轻指压眼球有助于眼的稳定。铲穿入基质不超 过2.5毫米。一旦形成角膜袋，即除去铲并测量袋的边缘和底部距离，保证 分开至少大约1毫米。\n为了使蛋白在移植入角膜后缓慢释放，将蛋白与聚-2-羟乙基异丁烯 酸(poly-2-hydroxyethylmethacrylate)(Hydron*)或一种等价试剂混合，形 成大约5μl的丸。使用一滴无菌乳酸化Ringers溶液将这样制备的移植物重新 水化并如上所述进行移植。移植后，用红霉素软膏封上角膜袋。移植之后， 蛋白-Hydron丸应当保持在角膜边缘附近(角膜-巩膜边缘)并且伤口不应有 显著损伤。\n手术之后，借助立体显微镜每天检查动物共7天，检查其发炎和反应。 为了便于检查，在检查中用甲氧氟烷麻醉并通过鼻锥连续进行麻醉。在这7 天中，监测动物的移植位置和角膜渗出液。杀死显示角膜渗出液的动物。优 选的安乐死方法是放血。首先用戊巴比妥钠(50毫克/公斤)麻醉动物，然后如 上所述进行灌注。\n7天以后，用胶态碳(例India Ink)灌注动物。用甲氧氟烷诱导麻醉，并用 戊巴比妥钠(50毫克/公斤)，腹膜内给药)保持。以每150克体重100-200 毫升温热的(37℃)乳酸化Ringers溶液通过腹部主动脉灌注每只动物。当动物 口鼻部完全褪色后，将20-25毫升胶态碳以与Ringers溶液相同的方式进 行注射，直至头和胸部器官完全变黑。然后剜出眼睛并固定。切下角膜，展 平并照相。\n依据本技术领域的实践，通常以三种剂量测试每种蛋白。本技术领域普 通技术人员可知，每一剂量需要六个阳性角膜反应来支持对血管形成反应的 确认。一个角膜测定的实施例包括研究三个剂量的蛋白，每一剂量测试六只 大鼠。另外，将六只动物暴露于缓冲液-海昌(Hydron)移植体并用作阴性对 照。将至少三只动物暴露于已知的血管形成因子-海昌移植物，用作阳性对 照。最后，为了证明任何观察到的反应的专一性，将六只动物暴露于含有单 一剂量要研究的蛋白，过量的中和抗体和海昌的移植体。\n进行了如上所述的角膜测定来评价Cyr 61诱导血管形成的能力。向四只 动物移植了含有缓冲剂-海昌颗粒的阴性对照移植体(两眼均有)。7天后每 只动物在两眼中均未显示血管形成。向六只动物的一只眼中移植含有生物有 效量的成纤维细胞生长因子(0.15μM)并向另一只眼移植对照颗粒；所有六 只动物在接受FGF的眼中显示血管形成的发育，而在接受阴性对照的眼中不 表现新血管形成。七只动物接受了1微克/毫升的Cyr 61，在一只眼及所有 七只这些眼中显示血管生长；七只接受阴性对照的眼中有一只表现血管形 成。最后，四只动物接受局部释放1微克/毫升Cyr 61(用10微克/微升Cyr 61 溶液制备的海昌)的移植体以及对Cyr 61三倍过量的专一性抗Cyr 61抗体： 这一组中没有显示血管形成的发育的眼睛。因而，血管形成的体内测定确认 了诸如FGF和Cyr 61的血管形成因子。测定亦可揭示血管形成诱导的ECM 信号分子诸如Cyr 61的抑制。\n                         实施例20\n                         血液凝固\nECM信号分子亦可用于修正止血，或不正常血液凝固。由例如Cyr 61 低水平表达从而使组织因子途径抑制剂(TFPI)未经抑止即起作用造成的血液 凝结缺陷可通过表达或使用重组Cyr 61蛋白进行修正。\nCyr 61可与TFPI，一种抑制体外血液凝结的蛋白相互作用。TFPI以两 个步骤的过程抑制血液凝结。首先，TFPI结合到因子Xa，然后TFPI：Xa 复合体与组织因子(TF)：因子VIIa复合体相互作用，从而抑制了后一复合体。 TF：因子VIIa复合体是激活因子IX和X的复合体。通过抑制TF：VIIa， TFPI通过防止血液凝结所需的IX和X的激活调节凝结。Cyr 61和TFPI的 相互作用抑制了TFPI的活性，从而促进血液凝结，因而，Cyr 61是组织因 子激动剂(agonist)。\n由于Cyr 61和TFPI的相互作用，Cyr 61能控制TFPI抑制血液凝结的 能力，从而调节止血。Cyr 61的缺陷可能导致在合适的时间不能抑制TFPI， 产生组织因子的过度抑制，从而防止了凝块形成。Cyr 61的去调节(dergulated) 的表达反过来将本质地(constitutively)抑制TFPI活性，运样组织因子一直具活 性，导致过度血液凝结。当内皮细胞中Cyr 61的表达去调节时，一种可能的 结果是血栓形成。\n除了Cyr 61，其它ECM信号分子，诸如Fisp 12和CTGF，已表明对参 与血管形成的细胞有作用。随之可预期，可将单独的或联合的多种ECM信 号分子相关生物材料用于本发明的涉及调节止血的方法。\n                        实施例21\n               来自体内的造血干细胞培养物\n为了研究Cyr 61对原代多能干细胞生长的作用，使用了在血细胞生成培 养物中将这些细胞与更成熟的祖细胞相区别的多种测定方法。这些测定利用 了未成熟和成熟细胞的物理化学(纤连蛋白结合的)或生长以及发育相关的(产 生祖细胞克隆)区别。\n将两种需要条件培养基来生长的细胞系用作红细胞生成干细胞(HSC)的 来源。这些克隆的，因子依赖性鼠品系是B6Sut(从长期骨髓培养物中克隆， 能在液体培养基上生长而不分化，但在琼脂上具多能性，描述于Greenberger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.[USA]80：2931[193])，以及FDCR混合体(从长期 骨髓培养物细胞充隆，该细胞用重组病毒Src-MoMuLV感染，并在琼脂培 养基上有多能性，描述于Spooncer et al.，Nature 310：2288[1984])。在含10 ％胎牛血清(FCS)和10％6X-浓度WEHI条件培养基的Kincaid培养基中 繁殖B6Sut细胞。Greenberger et al.在含20％马血清和10％6X-浓度WEHI 条件培养基的Fischer培养基中繁殖FDCP-混合物细胞。细胞系在37℃下， 5％二氧化碳中繁殖。\n测定了多种来自体内的或体外的培养物在外源提供的Cyr 61或多克隆 抗Cyr 61抗体存在或不存在下的种群生长。在有限稀释条件下，使用卵石区 形成细胞(Cobblestone area forming cell)(CAFC)测定鉴别具长期重生种群 (repopulating)能力的细胞。Ploemacher et al.，Blood 74：2755(1989)； Ploemacher et al.，Blood 78：2527(1991)，然后通过测量三个参数检测通过 CAFC测定确认的具有长期重生种群能力的细胞：种群倍增速率，有丝分裂 指数，以及DNA合成速率。\n测定了补充或不补充Cyr 61的长期培养物在CAFC测定中的原代HSC 水平。van der Sluijs et al.，Exp，Hematol，22：1236(1994)。例如，以下列描 述M2-10B4细胞系的方式，将M2-10B4基质细胞，B6Sut，和FDCP -混合体分别进行CAFC测定。通过将5×105M2-10B4基质细胞(从骨髓 基质克隆的细胞系，Sutherland et al.，Blood 78：666[1991])接种到96孔培养 板上每孔中的含10％FCS的DMEM中制备了基质细胞层。当细胞至铺满 时，用PBS洗并照射(20Gy的gamma照射，1.02-1.04Gy/分钟)以防止基质 内任何造血细胞的复制，而不影响基质支持血细胞生成的能力。\n在Cyr 61存在或不存在(10微克/毫升的终浓度)情况下，将造血干细胞 加入含10％FCS的DMEM中的照射过的基质细胞。例如通过细胞形态学显 微镜镜检确定在不同实验的长期培养物中长期重生种群细胞(以及更成熟的 短期祖细胞)数量来确定种群倍增速率。随后利用对潜在的长期HSC培养物 扩展和分化能力的研究，证实合适的候选细胞系。\n依据本技术领域标准方法确定有丝分裂指数。Keram et al.，Cancer Genet.Cytogenet.55：235(1991)。在甲醇∶乙酸(3∶1，体积∶体积)中固定 收获的细胞，计数，并在固定剂中以106细胞/毫升重新悬浮。将10微升这种 悬液置于载片上，干燥，并用吉姆萨染液处理。在光学显微镜下计数中期细 胞，并通过将中期细胞数除以载片上的总细胞数计算有丝分裂指数。使用2 边成对(2-sided paired)t-测验进行了有丝分裂指数比较的统计测定。\n使用胸苷掺入测定测量了DNA合成速率。将多种培养物在1微居/毫升 [3H]胸苷(ICN Bio Medicals，Inc.，Costa Mesa，CA)中繁殖24-72小时。然后 用PBS洗收获的细胞并用10％三氯乙酸固定。将DNA溶于0.1N氢氧化钠， 并通过例如液体闪光分光光度法确定掺入的胸苷。\nECM信号分子相关生物材料诸如Cyr 61的用途，可用于造血干细胞培 养物的来自体内的扩展。另外，可使用一种以上ECM信号分子相关生物材 料扩展这些培养物。例如，局部定向表达的Cyr 61，可以与Fisp 12联用， 它已通过培养基中存在Fisp 12证实表现出更广泛的导向作用。作为替代，可 使用CTGF置换其鼠同源物Fisp 12。本技术领域熟练人员能够在本发明精神 内设计ECM信号分子相关生物分子的其它组合。\n本技术领域普通技术人员能够认识到造血干细胞在ECM信号分子诸如 Cyr 61存在下的成功扩展为筛选该扩展过程怀疑的调节剂的方法提供了基 础。如本发明的另一种方法中，将怀疑的调节剂与ECM信号分子诸如Cyr 61 联合并暴露于原代细胞。作为平行对照，将ECM信号分子暴露于类似的细 胞。可使用扩展的相对速率确认ECM信号分子扩展多能红细胞生成干细胞 培养物能力的促进剂或抑制剂。\n亦可使用单独的或与其它造血生长因子联合的Cyr 61扩展取自病人的 干细胞种群，在扩展后可将其返回到在例如化疗或其它治疗方式后导致病人 血细胞减少的病人或其它合适的受体病人。亦可将依据本发明扩展的干细胞 种群用于需要它的病人的骨髓移植体。\n                          实施例22\n                          器官再生\nCyr 61在由细胞生长状态变化引起的多种细胞过程中的作用表明，这种 蛋白将可有效促进器官再生。为此目的，进行了研究以确认鼠Cyr 61在部分 肝切除后的残留肝中的表达分布图。(部分肝切除后的残留肝组织的反应是一 种肝对多种损伤，包括例如暴露于毒性水平的四氯化碳的化学损伤的反应模 型。)\n将BALB/C 3T3(Charles River)鼠进行部分肝切除，除去大约67％的肝组 织。Higgins et al.，Arehs.Path.12：186-202(1931)。在手术后不同时间 从残留肝组织取出20微克等份RNA，肝RNA是通过组织匀浆继之以异硫 氰酸胍，氯化铯沉淀分离的。Sambrook等。然后将RNA固定于硝酸纤维膜 并用放射标记的含鼠Cyr 61 cDNA不同区域的克隆进行探测。通过放射自显 影观察结果，结果表明除去肝组织诱导Cyr 61 mRNA的表达，特别是在损伤 部位附近的细胞中。因而，例如通过重组技术诱导Cyr 61表达可能促进诸如 肝组织的器官再生。举例说明，例如通过引入重组Cyr 61构建体可控制Cyr 61 的表达，该构建体已经基因工程化，通过使用组织专一性启动子，例如用于 在皮肤中表达的K14启动子，提供了基因控制表达的能力。可通过基因治疗 技术，使用促进同源重组的载体(例如从疱疹病毒，腺病毒，腺相关病毒，巨 细胞病毒，杆状病毒，逆转录病毒，痘苗病毒及其它衍生的载体)，将重组 Cyr 61引入相关器官的细胞。将异源基因引入真核细胞的技术，以及通过同 源重组将异源基因整合到宿主染色体的技术，已经为本技术领域所熟知。\n另一种器官皮肤的发育亦受到Cyr 61的影响。在临近皮肤损伤的细胞中 诱导Cyr 61的表达。如上所述，Cyr 61亦对内皮细胞和成纤维细胞有趋化 效应(即Cyr 61诱导细胞迁移)。进一步，Cyr61诱导内皮细胞和成纤维细胞 的增殖。两个过程均涉及皮肤伤口的愈合。相应地，例如通过局部或表面递 药施用Cyr 61将促进皮肤再生。\nCyr 61在肺上皮中亦有高度表达。这些细胞由于暴露于环境污染物而常 受到损伤。特别地，肺上皮常受到大气中氧化剂的损伤。例如利用雾化器或 吸入器施用Cyr 61可促使例如由环境污染造成的肺上皮损伤的愈合。\n                           实施例23\n                     软骨形成-ECM信号分子\n                        在间充质中表达\n一些ECM信号分子亦在诸如最终成为骨骼系统一部分的间充质细胞中 表达。在此实施例中，确认Cyr 61为一种在间充质细胞中表达的ECM信号 分子。如上所述在玻璃盖片(Coverslip)上将肢间充质细胞在微量培养基中生长 3天。在PBS中的4％多聚甲醛中固定培养物，在室温下与含蛋白酶抑制剂 苯甲基磺酰氟(PMSF，1mM)，胃蛋白酶抑制剂(1微克/毫升)，亮抑蛋白酶肽(1 微克/毫升)，抑蛋白酶肽(1微克/毫升)，氨基乙酸(50mM)，苄脒(5mM)和 EDTA(1mM)的0.1N乙酸钠(pH5.5)中的1毫克/毫升牛睾丸透明质酸酶(IV 型，Sigma)共同温育30分钟，用PBS中10％羊血清封阻并与抗Cyr 61一 级抗体(Yang et al，1991)，纤连蛋白(Gibco)和肌腱蛋白(Gibco)在4℃下温育过 夜。对照是与用1微克/毫升纯化Cyr 61中和的抗Cyr 61抗体一起温育。随 后将培养物在室温下与FITC缀合的羊抗兔次级抗体(Zymed)温育1小时。\n对于全载片免疫组织化学染色，在PBS中4％多聚甲醛中固定妊娠10.5 至12.5天的鼠胚，在甲醇/PBS中脱水并在全甲醇中贮藏于-20℃。重新水 化后，将胚与抗Cyr 61抗体温育，如Hogan et al.，Development 120：53- 60(1994)所述，以参考文献并于此处。对照是与用1微克/毫升纯化Cyr 61中 和的抗Cyr 61抗体温育。将免疫染色胚固定，清洁并照相。\n与分化至软骨细胞的体节间充质细胞中Cyr 61 mRNA的瞬时表达一致 (O′Brien et a1.，1992)，在发育的胚骨骼系统中发现了Cyr 61蛋白。通过全载 片免疫组织化学染色，将Cyr 61定位到妊娠10.5至12.5天的胚胎中接近肢 芽间充质处。Cyr 61定位于发育的脊柱，顿盖额骨和初级鳃弓，以及心脏和 脐血管，形成一种与Cyr 61mRNA表达模式一致的表达模式(O′Brien et al.， 1992)。\n通过在全肢芽(limb bud)和肢芽间充质细胞微量培养物中的免疫印迹检 测可测出Cyr 61蛋白。在发生软骨形成的4天培养时期中，Cyr 61蛋白水平 保持在相对恒定的水平。应用定量免疫印迹测定，估计Cyr 61大约占间充质 细胞培养物总细胞和胞外蛋白的0.03％。通过在间充质细胞培养物中的免疫 荧光染色将Cyr 61，肌腱蛋白(Gibco)和纤连蛋白定位于软骨小结。Cyr 61 和肌腱蛋白基本定位于小结内细胞，而使用抗纤连蛋白抗体亦在软骨小结周 围和之间观察到原纤维染色模式。对所有三种抗体亦在微量培养物横切片中 观察到类似的免疫荧光染色模式。总的来说，这些结果表明，内源性Cyr 61 定位于发育的肢芽间充质，无论是体内还是体外(both in vivo and in vivo)。\n                         实施例24\n                   软骨形成-ECM信号分子\n                       促进细胞粘着\nCyr 61是一种介导成纤维细胞和内皮细胞对未组织培养处理的塑料表 面粘着的分泌蛋白。(Kireeva et al.，Mol.Cell.Biol.16：1326-1334[1996])。 比较了肢芽间充质细胞在用BSA，Cyr 61，肌腱蛋白和纤连蛋白包被的非 组织培养平皿上的粘着。\n将Cyr 61，纤连蛋白(Gibco)或肌腱蛋白(Gibco)稀释于含0.5mM PMSF 的0.1％无蛋白酶牛血清白蛋白(BSA)的PBS中，终浓度为10或50微克/毫 升。向未组织培养处理的24孔板(Corning)上每孔滴入10微升，并在室温下 温育2小时。在室温下用含1％BSA的PBS将每孔阻断1小时，并用无血 清MEM洗(改进的Eagle培养基)。以每毫升5×105细胞将肢间充质细胞悬 浮于无血清MEM，并向每一孔中加入400微升的体积，并在37℃下，5％ 二氧化碳中培养1或3个小时。在每一时间点，除去细胞悬液，用MEM洗 孔并拍照残留的粘着细胞。\n细胞对BSA包被的平皿粘附很差，但在铺板1小时内以圆形细胞簇粘 着于Cyr 61和肌腱蛋白包被的平皿。作为对照，在纤连蛋白涂层平皿上铺板 的细胞均匀粘附并开始扩展。当允许细胞粘着3个小时时，观察到更多的粘 着细胞。此外，在Cyr 61和肌腱蛋白上铺板的细胞保持细胞间聚集和圆形细 胞形态，而在纤连蛋白上铺板的细胞扩展形成单层。这些观察表明，与先前 对肌腱蛋白的报道类似(Mackie et al.，J，Cell Biol.105：2569-2579[1987])， Cyr 61介导圆形细胞形态的粘着和保持，促进间充质细胞软骨形成(Zanetti et al.，Dev，Biol.139：383-395[1990])；Solursh et al.，Dev.Biol.94：259- 264[1982]。\n如前面所提及，可将诸如Cyr 61的ECM信号分子用于筛选细胞粘着， 包括但不限于软骨细胞的调节剂的方法。如上所述，对照的测定，测量暴露 于ECM信号分子和怀疑的细胞粘着调节剂组合的细胞与暴露于单独的ECM 信号分子的细胞的相对粘着水平，从而相对水平为确定细胞粘着的促进剂或 抑制剂提供了基础。\n                          实施例25\n                   软骨形成-ECM信号分子\n                        促进细胞聚集\n由于聚集(aggregation)是软骨形成分化的关键步骤(Solursh，M.，胞外基质 在发育中的作用( The role of extracellular matrixin development)，PP.277- 303(Trelstad，R.，ed.)(Alan R.Liss，New York 1984))，评价了Cyr 61介导间充 质细胞悬浮培养物中细胞间聚集的能力。计数了不同时间分离后残留的细胞 数量。在悬液中未处理的间充质细胞分离后立刻开始聚集，因为在2小时培 养时间内单细胞数下降到初始数量的30％。在用亲合纯化的抗Cyr 61抗体 处理的培养物中显著抑制了细胞聚集，表明内源性Cyr 61对间充质细胞聚集 是重要的。为了排除亲合纯化的抗Cyr 61抗体可含有干涉聚集的不确定成分 的可能性，在加入到细胞前将上述抗Cyr 61抗体与纯化的Cyr 61蛋白一起 预培养。这些预培养的抗体不比IgG和Cyr 61缓冲液对照更能影响细胞聚 集，表明抗Cyr 61抗体是通过中和间充质细胞的内源性Cyr 61蛋白来抑制 细胞聚集。\n除了上述在悬浮培养物中的细胞聚集之外，亦在微量(micromass)培养物 中检测到Cyr 61对间充质细胞聚集的作用。当将纯化的Cyr 61蛋白(0.3微克 /毫升)加到肢间充质细胞时，在24小时内观察到早熟的细胞凝集，与未接受 Cyr 61的对照细胞不同。此时Cyr 61处理的和对照培养物均未分化到软骨小 结(cartilage nodule)。在培养3天时，在Cyr 61处理的培养物中，明显的软骨 小结间的结间细胞缩聚的发育比较强。如在培养第4天Alcian蓝染色的 (Alcian blue-staning)软骨基质的观察，这些小结间缩聚(condensation)随后发 生软骨形成。总的来说，这些结果表明Cyr 61能够促进细胞-细胞聚集，这 是微量培养物中间充质细胞软骨形成的必需步骤。\n                          实施例26\n                    软骨形成-ECM信号分子\n                        促进细胞增殖\n一些ECM信号分子，诸如Cyr 61，如上述通过在微量培养物中对肢芽 间充质细胞的作用所揭示，可影响软骨形成。Ahrens et al.，Dev.Biol.60： 69-82(1997)已报道这些细胞在微量培养物中以类似于体内过程的方式进行 软骨形成。通过胰蛋白酶消化(1毫克/毫升，猪胰腺胰蛋白酶的1∶250稀释， Sigma Che mical Co.)从鼠胚肢芽获得间充质细胞。将细胞外移植到塑料组织 培养孔并使其在37℃下，5％二氧化碳中粘着2小时。然后将细胞在37℃ 下，5％二氧化碳，含10％FBS，青霉素(50单位(U)/毫升，和链霉素(50 微克/毫升)的MEM中培养24小时。此时，通过用4％NuSerum(Collaborative Biomedical Products，Inc.)代替10％FBS改变培养基的组分。然后向各培养物 加入Cyr 61，纤连蛋白，肝素，(各大约1微克/毫升)或缓冲液用作对照。通 过加入1∶100稀释的亲和纯化的抗Cyr 61抗体(大约13微克/毫升的贮液) 提供了另一种对照，它是使用标准技术得到和纯化的。Harlow et al.\n通过上述的胸苷测定和显微镜细胞计数评价了细胞增殖。通过定量[35S] -硫酸盐(ICN Biomedicals，Inc.)向硫酸化糖胺聚糖的掺入，以及通过用Alcian 蓝进行细胞染色定性确定软骨形成的程度，评价了软骨的形成。将上述培养 物用2.5微居/毫升[35S]-硫酸盐标记18小时，在PBS中洗两次，用Kahle 固定液固定(Pepper et al.，J.Cell Sci.109：73-83[1995])并在0.5％pH1.0 Alcian蓝中染色18小时。软骨形成的程度与Alcian蓝染色强度相关。San Antonio et al.，Dev.Biol.115：313-324(1986)。结果表明Cyr 61特异性增 强肢芽间充质细胞增殖和聚集，引起增强的软骨形成。\n除了证明纯化的Cyr 61增强生长因子诱导的成纤维细胞和内皮细胞中 的DNA合成之外，亦直接测定了Cyr 61对细胞增殖的影响。通过计数细胞 数和[3H]-胸苷的掺入，确定了4天培养期的细胞增殖。为了确定细胞数， 通过胰蛋白酶/EDTA(Sigma)获取细胞并用Coulter计数器计数。在对照培养物 中，将[3H]-胸苷(1微居/毫升；I(N)加入培养物中18个小时并通过液体闪烁 计数确定了在TCA-不可溶层中的掺入。虽然在4天后Cyr 61处理的和未 Cyr 61处理的培养物的总细胞数调整至同等水平，向肢间充质细胞加入纯化 的Cyr 61蛋白在培养2和3天后均增加细胞数和增强DNA合成。\nCyr 61在软骨形成中的功用亦可改进假体装置(prosthetic devices)的整 合。例如，常常可通过引入假体，诸如髋假体，膝假体等治疗骨骼损伤和疾 病。除了组织相容性的问题外，假体装置的成功移植还需要外源成分整合到 有机体骨骼结构中。Cyr 61多肽影响细胞粘着，迁移，和增殖的能力，以及 Cyr 61多肽诱导间充质细胞分化成软骨细胞的能力，证明它在通过假体移植 治疗骨骼疾病中是有价值的。例如，通过涉及使用Cyr 61的医疗处理可促进 通过软骨细胞克隆化的假体装置的整合，可使用本技术领域所知的任何途径 将Cyr 61在医学可接受佐剂，载体或稀释剂中给药，或通过用合适载体中的 Cyr 61多肽涂层假体装置给药。载体也可是一种缓释型载体，以使多肽缓慢 释放。\n如先前所述，本发明的方法中亦包括一种筛选细胞增殖，包括软骨细胞 的调节剂的方法。通过比较在只有ECM信号分子(例Cyr 61)存在下的对照中 和在ECM信号分子与一种细胞增殖怀疑的调节剂的组合物存在下的细胞增 殖的相比速率，为确定怀疑的调节剂是软骨细胞增殖的促进剂或抑制剂提供 了基础。\n                          实施例27\n                    软骨形成-ECM信号分子\n                        促进软骨形成\n软骨分化通过[35S]-硫酸盐(ICN)向硫酸糖胺聚糖的掺入进行了定量并 通过Alcian蓝染色进行了定性评价。将培养物用2.5微居/毫升[35S]-硫酸盐 放射标记18小时，用Kahle固定液固定并用pH1.0的0.5％ Alcian蓝染色(Lev et al.，1964)。软骨形成的程度与Alcian蓝染色的强度相关(San Antonio et al.， 1986)。通过液体闪烁计数定量了固定细胞层中的[35S]-硫酸盐掺入。\n外源纯化的Cyr 61蛋白促进肢间充质细胞聚集并在微量培养物中产生 更大的Alcian蓝染色的软骨区，暗示出促进软骨形成的效应。这一效应通过 在Cyr 61处理的微量培养物中[35S]-硫酸盐向硫酸糖胺聚糖的掺入进行定量 (San Antonio et al.，1986)。外源Cyr 61以剂量依赖方式增强[35S]-硫酸盐掺 入，对0.3和5微克/毫升Cyr 61分别产生1.5倍和3.5倍增加，并通过增强 的Alcian蓝染色定性相关。在5微克/毫升Cyr 61剂量(120nm)观察的增加低 估了软骨形成的真实程度，因为在此剂量下形成的一些大软骨小结从平皿上 分离。用10微克/毫升Cyr 61处理的培养物形成更大块的软骨。\n对文献的查阅表明在肢间充质细胞微量培养物中的软骨形成在加入10 微克/毫升肝素时增加2倍(San Antonio et al.，1987；Resh et al.，1985)，在加 入50微克/毫升肌腱蛋白1200nm)时增加3倍(Mackie et al.，1987)。结果证明 纯化的Cyr 61在类似或低于已知促进这种细胞系统软骨形成的其它分子的 (10-100nm)浓度是有效的。\n由于初始聚集的发生必须达到特定的阈值细胞密度(Umansky，1966； Ahrens et al.，1977)，虽然已证明向在下面情况下铺板的细胞中加入诸如肝素 或多聚-L-赖氨酸的外源因子(San Antonio et al.，1986：San Antonio et al.， 1987)可支持软骨形成，在低密度铺板的胚间充质细胞通常不能分化成软骨细 胞。因而，评价了Cyr 61促进高于和低于阈值密度铺板的间充质细胞分化的 能力。以2.5×106细胞/毫升铺板的细胞掺入了较少的[35S]-硫酸盐。然而， 当加入Cyr 61时，这些阈值下密度培养物形成小结并掺入硫酸盐，其水平类 似于以3×106细胞/毫升铺板的，支持软骨形成的培养物。从而，Cyr 61可 促进以非软骨形成的，阈值下密度铺板的间充质细胞的软骨形成。\n可以想象，在间充质细胞以高密度微量(high density micromass)铺板时， 软骨形成的程度可达到最大从而不被外源因子进一步增强，外源因子亦可能 不再为所有细胞接近。然而，在3到10×106细胞/毫升密度范围铺板的培养 物中加入外源Cyr 61可产生[35S]-硫酸盐掺入的2倍增强。从而，Cyr 61可 进一步增强显然未达到最大分化程度的高密度微量培养物的软骨形成。\n由于Cyr 61亦促进细胞增殖，在Cyr 61处理的培养物中[35S]-硫酸盐 掺入的增加至少部分可能归因于细胞数目的增加。如果这是事实，那么校准 关于细胞数的硫酸盐掺入将会消除对照和Cyr 61处理的培养物的区别。发现 事实并非如此。Cyr 61处理的培养物的校正的硫酸盐掺入仍显示大约2倍于 对照的增强，表明Cyr 61促进软骨形成的净增强。在培养第2天，由于在这 种早期阶段培养物中大多数间充质细胞增殖而不是分化(Ede，1983)，在Cyr 61处理的培养物的硫酸盐/细胞数比率低于对照，反映出相对于细胞数的低 水平[35S]-硫酸盐掺入。\n体内或体外这些细胞中内源性Cyr 61的存在，表明Cyr 61可能确实具 有调节软骨分化的功能。外源性加入的纯化Cyr 61促进细胞间聚集以及增强 肢间充质细胞中[35S]-硫酸盐掺入和Alcian蓝染色的能力证明Cyr 61能用作 软骨形成增强因子。如上述实施例11中所述，抗Cyr 61抗体能中和Cyr 61 的增强细胞粘着和DNA合成的能力。抗Cyr 61抗体是加到间充质细胞培养 物中或在铺板前与细胞悬液混合。当抗体分别是加入到培养物和与细胞混合 时，与对照相比，[35S]-硫酸盐掺入降低至50％和30％，证明了用抗Cyr 61 抗体处理的培养物中抑制了软骨形成。这些观察与降低的Alcian蓝染色相 关。但是，在铺板前将抗Cyr 61抗体与间充质细胞混合，在一些处理培养物 中24上时内导致完全的脱附。\n为了消除在抗体制剂中含有导致细胞脱附的未确定组分的可能性，在与 细胞混合前将抗Cyr 61抗体与1微克/毫升纯化的Cyr 61蛋白预培养。除去 与中和的抗Cyr 61抗体混合的间充质细胞中软骨形成的抑制。\n一般地，本发明考虑了一种筛选软骨形成调节剂的方法。一个比较测定 涉及将软骨细胞暴露于(a)一种怀疑的软骨形成调节剂与一种诸如Cyr 61的 ECM信号分子的组合物，或(b)单独的ECM信号分子。其后软骨形成相对速 率的测量为确定怀疑的软骨形成调节剂是该过程的促进剂或抑制剂提供了基 础。\n这一实施例中所述的结果证明在间充质细胞中存在内源性Cyr 61且它 对软骨形成是重要的。相应地，本发明考虑了使用诸如Cyr 61的ECM信号 分子诱导骨愈合。例如，如上所述将生物学有效量的Cyr 61引入到诸如海绵 的基质，然后将这种材料用于固定骨折或用于将粉碎性骨折聚在一起。可以 使用生物可降解基质，或可在其后合适的时间除去基质。另外，可将Cyr 61 直接用于骨。此外，如实施例26中所述，可将Cyr 61用于诸如生物相容性 假体等的无生命对象。\n                       实施例28\n                        遗传学\n控制ECM信号分子相关生物材料的效应的另一种方法是通过在活性生 长和分裂细胞的相关基因产生显性失活突变使其灭活。一种方法涉及使用重 组技术，例如在诸如HSC培养物等的来自体内培养物中产生纯合突变基因 型。将这些细胞引入到生物体，例如病人体中，将会提供一种可能性，即引 入的突变细胞在体内扩展和改变ECM信号分子的表达。对这种突变纯合的 突变体能影响内源性野生型ECM信号分子在其它细胞中的表达。杂合突变 体可能产生能与野生型ECM信号分子相互作用的改变的ECM信号分子，其 也以这种方式表达从而该ECM信号分子活性已经被改变或消除。\n另外，由于诸如Cyr 61的ECM信号分子在调节软骨形成(即骨骼发育) 中的作用，可证明改变人Cyr 61表达的基因操作对涉及除血管形成病症外的 骨骼疾病的出生前筛查方法和基因治疗有医学重要性。例如，当外胚层和中 胚层来源的间充质细胞分化形成软骨细胞时Cyr 61基因得到表达。因而， Cyr 61可能的作用是调节涉及骨骼发育的间充质细胞至软骨细胞系。与此观 点相一致，异位过量表达Cyr 61的转基因鼠出生时有骨骼畸形。在所有检测 实例中，骨骼变形的存在均与转基因的表达有关。这些结果暗示人型Cyr 61 亦可能调节软骨形成和骨骼发育。亦有可能是人Cyr 61基因对应于已知影响 涉及骨形态发生的骨骼发育或出生缺陷的基因座。序列4中关于人Cyr 61蛋 白序列的知识，以及序列3中cDNA的编码序列，为设计多种基因治疗方法 提供了基础。\n这种信息亦为设计在基因型测定例如限制性片段长度多态性测定中有 用的探针提供了基础。这种测定在遗传咨询领域是有用的，例如在诊断疾病 或健康状况及它们发生的可能性，以及法医学测定。\n作为实施例，本发明的材料可用于出生前筛查多种健康状况或疾病，包 括血液疾病，骨骼畸形，及癌病。获得胎细胞的熟知方法，例如氨基穿刺法 (aminocentesis)，为诊断提供了所需的材料。在本发明一个实施例中，将胎细 胞扩增并分离了DNA。在另一实施例中，裂解胎细胞并使用依据本发明的 寡核苷酸引物进行聚合酶链式反应。然后将使用任一方法得到的DNA用于 检测。一种检测方法涉及对Cyr 61部分区域或整个基因进行核苷酸序列测 定。序列3中存在的人Cyr 61编码序列促进了测序引物的设计，使核苷酸序 列测定成为现实。一种替代核苷酸序列测定的方法是检测胎儿核酸的表达特 征。要表达的胎儿核酸的容量(capacity)在诊断Cyr 61相关的血管形成，软骨 形成或癌症中可能是一种素因。\n本发明还包括一种含Cyr 61的试剂盒。依据本发明的试剂盒以可用于完 成本发明前面所述方法的形式提供Cyr 61。依据本发明的试剂盒在合适的缓 冲液中含有分离和纯化的重组人Cyr 61，可任选地通过加入甘油稳定以贮存 于-20℃。试剂盒除了提供Cyr 61之外，本发明亦考虑包括任一种缓冲试 剂，不同类型和浓度的盐，以及诸如DTT的其它蛋白稳定试剂，这些都为本 技术领域熟知。依据本发明的其它试剂盒包括分离和纯化的鼠Cyr 61。亦考 虑了含有如上所述Cyr 61多肽和一种抑制肽或一种抗Cyr 61抗体的试剂盒。\n本申请以1996年3月15日提交的系列号60/013,958的美国临时专利申 请的提交日为优先权。\n                         序列表\n(1)一般资料\n(i)申请人：Lau，Lester F.\n(ii)发明名称：胞外基质信号分子\n(iii)序列数：17\n(iv)通讯地址：\n(A)收件人：Marshall，O′Toole，Gerstein，Murray & Borun\n(B)街道：6300 Sears Tower，233 South Wacker Drive\n(C)城市：芝加哥(Chicago)\n(E)国家：美国(United States of America)\n(F)邮编(Zip)：60606-6402\n(v)计算机可读形式：\n(A)媒介类型：软盘\n(B)计算机：IBM兼容PC\n(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS\n(D)软件：PatentIn Release#1.0，#1.30版本\n(vi)现在申请数据\n(A)申请号：\n(B)填表日期：\n(C)分类：\n(viii)律师/代理人资料：\n(A)姓名：Clough，David W.\n(B)注册号：36,107\n(C)参考/摘要号：28758/33766\n(ix)电讯资料：\n(A)电话：312/474-6300\n(B)传真：312/474-0488\n(C)电报：25-3856\n(2)系列资料1：\n(i)序列特征：\n(A)长度：1480碱基对\n(B)类型：核酸\n(C)链型：单链\n(D)拓扑结构：线性\n(ii)分子类型：蛋白质\n(ix)特征：\n(A)名称/关键词：CDS\n(B)位置：180..1316\n(ix)特征：\n(A)名称/关键词：混合特征(misc_feure)\n(D)其它资料：“鼠Cyr 61 cDNA编码序列”\n(xi)序列描述：序列1：\nCGAGAGCGCC CCAGAGAAGC GCCTGCAATC TCTGCGCCTC CTCCGCCAGC ACCTCGAGAG   60\nAAGGACACCC GCCGCCTCGG CCCTCGCCTC ACCGCACTCC GGGCGCATTT GATCCCGCTG  120\nCTCGCCGGCT TGTTGGTTCT GTGTCGCCGC GCTCGCCCCG GTTCCTCCTG CGCGCCACA   179\nATG AGC TCC AGC ACC TTC AGG ACG CTC GCT GTC GCC GTC ACC CTT CTC    227\nMet Ser Ser Ser Thr Phe Arg Thr Leu Ala Val Ala Val Thr Leu Leu\n  1               5                  10                  15\nCAC TTG ACC AGA CTG GCG CTC TCC ACC TGC CCC GCC GCC TGC CAC TGC    275\nHis Leu Thr Arg Leu Ala Leu Ser Thr Cys Pro Ala Ala Cys His Cys\n             20                  25                  30\nCCT CTG GAG GCA CCC AAG TGC GCC CCG GGA GTC GGG TTG GTC CGG GAC    323\nPro Leu Glu Ala Pro Lys Cys Ala Pro Gly Val Gly Leu Val Arg Asp\n         35                  40                  45\nGGC TGC GGC TGC TGT AAG GTC TGC GCT AAA CAA CTC AAC GAG GAC TGC    371\nGly Cys Gly Cys Cys Lys Val Cys Ala Lys Gln Leu Asn Glu Asp Cys\n     50                  55                  60\nAGC AAA ACT CAG CCC TGC GAC CAC ACC AAG GGG TTG GAA TGC AAT TTC    419\nSer Lys Thr Gln Pro Cys Asp His Thr Lys Gly Leu Glu Cys Asn Phe\n 65                  70                  75                  80\nGGC GCC AGC TCC ACC GCT CTG AAA GGG ATC TGC AGA GCT CAG TCA GAA    467\nGly Ala Ser Ser Thr Ala Leu Lys Gly Ile Cys Arg Ala Gln Ser Glu\n                 85                  90                  95\nGGC AGA CCC TGT GAA TAT AAC TCC AGA ATC TAC CAA AAC GGG GAA AGC    515\nGly Arg Pro Cys Glu Tyr Asn Ser Arg Ile Tyr Gln Asn Gly Glu Ser\n            100                 105                 110\nTTC CAG CCC AAC TGT AAA CAC CAG TGC ACA TGT ATT GAT GGC GCC GTG    563\nPhe Gln Pro Asn Cys Lys His Gln Cys Thr Cys Ile Asp Gly Ala Val\n        115                 120                 125\nGGC TGC ATT CCT CTG TGT CCC CAA GAA CTG TCT CTC CCC AAT CTG GGC    611\nGly Cys Ile Prc Leu Cys Pro Gln Glu Leu Ser Leu Pro Asn Leu Gly\n    130                 135                 140\nTGT CCC AAC CCC CGG CTG GTG AAA GTC AGC GGG CAG TGC TGT GAA GAG    659\nCys Pro Asn Pro Arg Leu Val Lys Val Ser Gly Gln Cys Cys Glu Glu\n145                 150                 155                 160\nTGG GTT TGT GAT GAA GAC AGC ATT AAG GAC TCC CTG GAC GAC CAG GAT     707\nTrp Val Cys Asp Glu Asp Ser Ile Lys Asp Ser Leu Asp Asp Gln Asp\n                165                 170                 175\nGAC CTC CTC GGA CTC GAT GCC TCG GAG GTG GAG TTA ACG AGA AAC AAT     755\nAsp Leu Leu Gly Leu Asp Ala Ser Glu Val Glu Leu Thr Arg Asn Asn\n            180                 185                 190\nGAG TTA ATC GCA ATT GGA AAA GGC AGC TCA CTG AAG AGG CTT CCT GTC     803\nGlu Leu Ile Ala Ile Gly Lys Gly Ser Ser Leu Lys Arg Leu Pro Val\n        195                 200                 205\nTTT GGC ACC GAA CCG CGA GTT CTT TTC AAC CCT CTG CAC GCC CAT GGC     851\nPhe Gly Thr Glu Pro Arg val Leu Phe Asn Pro Leu His Ala His Gly\n    210                 215                 220\nCAG AAA TGC ATC GTT CAG ACC ACG TCT TGG TCC CAG TGC TCC AAG AGC     899\nGln Lys Cys Ile Val Gln Thr Thr Ser Trp Ser Gln Cys Ser Lys Ser\n225                 230                 235                 240\nTGC GGA ACT GGC ATC TCC ACA CGA GTT ACC AAT GAC AAC CCA GAG TGC     947\nCys Gly Thr Gly Ile Ser Thr Arg Val Thr Asn Asp Asr Pro Glu Cys\n                245                 250                 255\nCGC CTG GTG AAA GAG ACC CGG ATC TGT GAA GTG CGT CCT TGT GGA CAA     995\nArg Leu Val Lys Glu Thr Arg Ile Cys Glu Val Arg Pro Cys Gly Gln\n            260                 265                 270\nCCA GTG TAC AGC AGC CTA AAA AAG GGC AAG AAA TGC AGC AAG ACC AAG    1043\nPro Val Tyr Ser Ser Leu Lys Lys Gly Lys Lys Cys Ser Lys Thr Lys\n        275                 280                 285\nAAA TCC CCA GAA CCA GTC AGA TTT ACT TAT GCA GGA TGC TCC AGT GTC    1091\nLys Ser Pro Glu Pro Val Arg Phe Thr Tyr Ala Gly Cys Ser Ser Val\n    290                 295                 300\nAAG AAA TAC CGG CCC AAA TAC TGC GGC TCC TGC GTA GAT GGC CGG TGC    1139\nLys Lys Tyr Arg Pro Lys Tyr Cys Gly Ser Cys Val Asp Gly Arg Cys\n305                 310                 315                 320\nTGC ACA CCT CTG CAG ACC AGA ACT GTG AAG ATG CGG TTC CGA TGC GAA    1137\nCys Thr Pro Leu Gln Thr Arg Thr Val Lys Met Arg Phe Arg Cys Glu\n                325                 330                 335\nGAT GGA GAG ATG TTT TCC AAG AAT GTC ATG ATG ATC CAG TCC TGC AAA    1235\nAsp Gly Glu Met Phe Ser Lys Asn Val Met Met Ile Gln Ser Cys Lys\n            340                 345                 350\nTGT AAC TAC AAC TGC CCG CAT CCC AAC GAG GCA TCG TTC CGA CTG TAC    1283\nCys Asn Tyr Asn Cys Pro His Pro Asn Glu Ala Ser Phe Arg Leu Tyr\n        355                 360                 365\nAGC CTA TTC AAT GAC ATC CAC AAG TTC AGG GAC TAAGTGCCTC CAGGGTTCCT  1336\nSer Leu Phe Asn Asp Ile His Lys Phe Arg Asp\n    370                 375\nAGTGTGGGCT GGACAGAGGA GAAGCGCAAG CATCATGGAG ACGTGGGTGG GCGGAGGATG  1396\nAATGGTGCCT TGCTCATTCT TGAGTAGCAT TAGGGTATTT CAAAACTGCC AAGGGGCTGA  1456\nTGTGGACGGA CAGCAGCGCA GCCG                                         1480\n(2)系列资料2：\n(i)序列特征：\n(A)长度：379氨基酸\n(B)类型：氨基酸\n(D)拓扑结构：线性\n(ii)分子类型：蛋白质\n(ix)特征：\n(A)名称/关键词：混合特征(misc_feature)\n(D)其它资料：“鼠Cyr 61氨基酸序列”\n(xi)序列描述：序列2：\nMet Ser Ser Ser Thr Phe Arg Thr Leu Ala Val Ala Val Thr Leu Leu\n  1               5                  10                  15\nHis Leu Thr Arg Leu Ala Leu Ser Thr Cys Pro Ala Ala Cys His Cys\n             20                  25                  30\nPro Leu Glu Ala Pro Lys Cys Ala Pro Gly Val Gly Leu Val Arg Asp\n         35                  40                  45\nGly Cys Gly Cys Cys Lys Val Cys Ala Lys Gln Leu Asn Glu Asp Cys\n     50                  55                  60\nSer Lys Thr Gln Pro Cys Asp His Thr Lys Gly Leu Glu Cys Asn Phe\n 65                  70                  75                  80\nGly Ala Ser Ser Thr Ala Leu Lys Gly Ile Cys Arg Ala Gln Ser Glu\n                 85                  90                  95\nGly Arg Pro Cys Glu Tyr Asn Ser Arg Ile Tyr Gln Asn Gly Glu Ser\n            100                 105                 110\nPhe Gln Pro Asn Cys Lys His Gln Cys Thr Cys Ile Asp Gly Ala Val\n        115                 120                 125\nGly Cys Ile Pro Leu Cys Pro Gln Glu Leu Ser Leu Pro Asn Leu Gly\n    130                 135                 140\nCys Pro Asn Pro Arg Leu Val Lys Val Ser Gly Gln Cys Cys Glu Glu\n145                 150                 155                 160\nTrp Val Cys Asp Glu Asp Ser Ile Lys Asp Ser Leu Asp Asp Gln Asp\n                165                 170                 175\nAsp Leu Leu Gly Leu Asp Ala Ser Glu Val Glu Leu Thr Arg Asn Asn\n            180                 185                 190\nGlu Leu Ile Ala Ile Gly Lys Gly Ser Ser Leu Lys Arg Leu Pro Val\n        195                 200                 205\nPhe Gly Thr Glu Pro Arg Val Leu Phe Asn Pro Leu His Ala His Gly\n    210                 215                 220\nGln Lys Cys Ile Val Gln Thr Thr Ser Trp Ser Gln Cys Ser Lys Ser\n225                 230                 235                 240\nCys Gly Thr Gly Ile Ser Thr Arg Val Thr Asn Asp Asn Pro Glu Cys\n                245                 250                 255\nArg Leu Val Lys Glu Thr Arg Ile Cys Glu Val Arg Pro Cys Gly Gln\n            260                 265                 270\nPro Val Tyr Ser Ser Leu Lys Lys Gly Lys Lys Cys Ser Lys Thr Lys\n        275                 280                 285\nLys Ser Pro Glu Pro Val Arg Phe Thr Tyr Ala Gly Cys Ser Ser Val\n    290                 295                 300\nLys Lys Tyr Arg Pro Lys Tyr Cys Gly Ser Cys Val Asp Gly Arg Cys\n305                 310                 315                 320\nCys Thr Pro Leu Gln Thr Arg Thr Val Lys Met Arg  Phe Arg Cys Glu\n                325                 330                 335\nAsp Gly Glu Met Phe Ser Lys Asn Val Met Met Ile Gln Ser Cys Lys\n            340                 345                 350\nCys Asn Tyr Asn Cys Pro His Pro Asn Glu Ala Ser Phe Arg Leu Tyr\n        355                 360                 365\nSer Leu Phe Asn Asp Ile His Lys Phe Arg Asp\n    370                 375\n(2)系列资料3：\n(i)序列特征：\n(A)长度：1418碱基对\n(B)类型：核酸\n(C)链型：单链\n(D)拓扑结构：线性\n(ii)分子类型：蛋白质\n(ix)特征：\n(A)名称/关键词：CDS\n(B)位置：124..1266\n(ix)特征：\n(A)名称/关键词：混合特征(misc_feature)\n(D)其它资料：“人Cyr 61 cDNA编码序列”\n(xi)序列描述：序列3：\nGGGCGGGCCC ACCGCGACAC CGCGCCGCCA CCCCGACCCC GCTGCGCACG GCCTGTCCGC   60\nTGCACACCAG CTTGTTGGCG TCTTCGTCGC CGCGCTCGCC CCGGGCTACT CCTGCGCGCC  120\nACA ATG AGC TCC CGC ATC GCC AGG GCG CTC GCC TTA GTC GTC ACC CTT    168\n    Met Ser Ser Arg Ile Ala Arg Ala Leu Ala Leu Val Val Thr Leu\n      1               5                  10                  15\nCTC CAC TTG ACC AGG CTG GCG CTC TCC ACC TGC CCC GCT GCC TGC CAC    216\nLeu His Leu Thr Arg Leu Ala Leu Ser Thr Cys Pro Ala Ala Cys His\n                 20                  25                  30\nTGC CCC CTG GAG GCG CCC AAG TGC GCG CCG GGA GTC GGG CTG GTC CGG    264\nCys Pro Leu Glu Ala Pro Lys Cys Ala Pro Gly Val Gly Leu Val Arg\n             35                  40                  45\nGAC GGC TGC GGC TGC TGT AAG GTC TGC GCC AAG CAG CTC AAC GAG GAC    312\nAsp Gly Cys Gly Cys Cys Lys Val Cys Ala Lys Gln Leu Asn Glu Asp\n         50                  55                  60\nTGC AGC AAA ACG CAG CCC TGC GAC CAC ACC AAG GGG CTG GAA TGC AAC    360\nCys Ser Lys Thr Gln Pro Cys Asp His Thr Lys Gly Leu Glu Cys Asn\n     65                  70                  75\nTTC GGC GCC AGC TCC ACC GCT CTG AAG GGG ATC TGC AGA GCT CAG TCA    408\nPhe Gly Ala Ser Ser Thr Ala Leu Lys Gly Ile Cys Arg Ala Gln Ser\n 80                  85                  90                  95\nGAG GGC AGA CCC TGT GAA TAT AAC TCC AGA ATC TAC CAA AAC GGG GAA    456\nGlu Gly Arg Pro Cys Glu Tyr Asn Ser Arg Ile Tyr Gln Asn Gly Glu\n                100                 105                 110\nAGT TTC CAG CCC AAC TGT CAA CAT CAG TGC ACA TGT ATT GAT GGC GCC    504\nSer Phe Gln Pro Asn Cys Gln His Gln Cys Thr Cys Ile Asp Gly Ala\n            115                 120                 125\nGTG GGC TGC ATT CCT CTG TGT CCC CAA GAA CTA TCT CTC CCC AAC TTG       552\nVal Gly Cys Ile Pro Leu Cys Pro Gln Glu Leu Ser Leu Pro Asn Leu\n        130                 135                 140\nGGC TGT CCC AAC CCT CGG CTG GTC AAA GTT ACC GGG CAG TGC TGC GAG       600\nGly Cys Pro Asn Pro Arg Leu Val Lys Val Thr Gly Gln Cys Cys Glu\n    145                 150                 155\nGAG TGG GTC TGT GAC GAG GAT AGT ATC AAG GAC CCC ATG GAG GAC CAG       648\nGlu Trp Val Cys Asp Glu Asp Ser Ile Lys Asp Pro Met Glu Asp Gln\n160                 165                 170                 175\nGAC GGC CTC CTT GGC AAG GAG CTG GGA TTC GAT GCC TCC GAG GTG GAG       696\nAsp Gly Leu Leu Gly Lys Glu Leu Gly Phe Asp Ala Ser Glu Val Glu\n                180                 185                 190\nTTG ACG AGA AAC AAT GAA TTG ATT GCA GTT GGA AAA GGC AGA TCA CTG       744\nLeu Thr Arg Asn Asn Glu Leu Ile Ala Val Gly Lys Gly Arg Ser Leu\n            195                 200                 205\nAAG CGG CTC CCT GTT TTT GGA ATG GAG CCT CGC ATC CTA TAC AAC CCT       792\nLys Arg Leu Pro Val Phe Gly Met Glu Pro Arg Ile Leu Tyr Asn Pro\n        210                 215                 220\nTTA CAA GGC CAG AAA TGT ATT GTT CAA ACA ACT TCA TGG TCC CAG TGC       840\nLeu Gln Gly Gln Lys Cys Ile Val Gln Thr Thr Ser Trp Ser Gln Cys\n    225                 230                 235\nTCA AAG ACC TGT GGA ACT GGT ATC TCC ACA CGA GTT ACC AAT GAC AAC       888\nSer Lys Thr Cys Gly Thr Gly Ile Ser Thr Arg Val Thr Asn Asp Asn\n240                 245                 250                 255\nCCT GAG TGC CGC CTT GTG AAA GAA ACC CGG ATT TGT GAG GTG CGG CCT       936\nPro Glu Cys Arg Leu Val Lys Glu Thr Arg Ile Cys Glu Val Arg Pro\n                260                 265                 270\nTGT GGA CAG CCA GTG TAC AGC AGC CTG AAA AAG GGC AAG AAA TGC AGC       984\nCys Gly Gln Pro Val Tyr Ser Ser Leu Lys Lys Gly Lys Lys Cys Ser\n            275                 280                 285\nAAG ACC AAG AAA TCC CCC GAA CCA GTC AGG TTT ACT TAC GCT GGA TGT      1032\nLys Thr Lys Lys Ser Pro Glu Pro Val Arg Phe Thr Tyr Ala Gly Cys\n        290                 295                 300\nTTG AGT GTG AAG AAA TAC CGG CCC AAG TAC TGC GGT TCC TGC GTG GAC      1080\nLeu Ser Val Lys Lys Tyr Arg Pro Lys Tyr Cys Gly Ser Cys Val Asp\n    305                 310                 315\nGGC CGA TGC TGC ACG CCC CAG CTG ACC AGG ACT GTG AAG ATG CGG TTC      1128\nGly Arg Cys Cys Thr Pro Gln Leu Thr Arg Thr Val Lys Met Arg Phe\n320                 325                 330                 335\nCGC TGC GAA GAT GGG GAG ACA TTT TCC AAG AAC GTC ATG ATG ATC CAG      1176\nArg Cys Glu Asp Gly Glu Thr Phe Ser Lys Asn Val MetMet  Ile Gln\n                340                 345                 350\nTCC TGC AAA TGC AAC TAC AAC TGC CCG CAT GCC AAT GAA GCA GCG TTT      1224\nSer Cys Lys Cys Asn Tyr Asn Cys Pro His Ala Asn Glu Ala Ala Phe\n            355                 360                 365\nCCC TTC TAC AGG CTG TTC AAT GAC ATT CAC AAA TTT AGG GAC              1266\nPro Phe Tyr Arg Leu Phe Asn Asp Ile His Lys Phe Arg Asp\n        370                 375                 380\nTAAATGCTAC CTGGGTTTCC AGGGCACACC TAGACAAACA AGGGAGAAGA GTGTCAGAAT    1326\nCAGAATCATG GAGAAAATGG GCGGGGGTGG TGTGGGTGAT GGGACTCATT GTAGAAAGGA    1386\nAGCCTTCTCA TTCTTGAGGA GCATTAAGGT AT                                      1418\n(2)系列资料4：\n(i)序列特征：\n(A)长度：381氨基酸\n(B)类型：氨基酸\n(D)拓扑结构：线性\n(ii)分子类型：蛋白质\n(ix)特征：\n(A)名称/关键词：混合特征(misc_feature)\n(D)其它资料：“人Cyr 61氨基酸序列”\n(xi)序列描述：序列4：\nMet Ser Ser Arg Ile Ala Arg Ala Leu Ala Leu Val Val Thr Leu Leu\n  1               5                  10                  15\nHis Leu Thr Arg Leu Ala Leu Ser Thr Cys Pro Ala Ala Cys His Cys\n             20                  25                  30\nPro Leu Glu Ala Pro Lys Cys Ala Pro Gly Val Gly Leu Val Arg Asp\n         35                  40                  45\nGly Cys Gly Cys Cys Lys Val Cys Ala Lys Gln Leu Asn Glu Asp Cys\n     50                  55                  60\nSer Lys Thr Gln Pro Cys Asp His Thr Lys Gly Leu Glu Cys Asn Phe\n 65                  70                  75                  80\nGly Ala Ser Ser Thr Ala Leu Lys Gly Ile Cys Arg Ala Gln Ser Glu\n                 85                  90                  95\nGly Arg Pro Cys Glu Tyr Asn Ser Arg Ile Tyr Gln Asn Gly Glu Ser\n            100                 105                 110\nPhe Gln Pro Asn Cys Gln His Gln Cys Thr Cys Ile Asp Gly Ala Val\n        115                 120                 125\nGly Cys Ile Pro Leu Cys Pro Gln Glu Leu Ser Leu Pro Asn Leu Gly\n    130                 135                 140\nCys Pro Asn Pro Arg Leu Val Lys Val Thr Gly Gln Cys Cys Glu Glu\n145                 150                 155                 160\nTrp Val Cys Asp Glu Asp Ser Ile Lys Asp Pro Met Glu Asp Gln Asp\n                165                 170                 175\nGly Leu Leu Gly Lys Glu Leu Gly Phe Asp Ala Ser Glu Val Glu Leu\n            180                 185                 190\nThr Arg Asn Asn Glu Leu Ile Ala Val Gly Lys Gly Arg Ser Leu Lys\n        195                 200                 205\nArg Leu Pro Val Phe Gly Met Glu Pro Arg Ile Leu Tyr Asn Pro Leu\n    210                 215                 220\nGln Gly Gln Lys Cys Ile Val Gln Thr Thr Ser Trp Ser Gln Cys Ser\n225                 230                 235                 240\nLys Thr Cys Gly Thr Gly Ile Ser Thr Arg Val Thr Asn Asp Asn Pro\n                245                 250                 255\nGlu Cys Arg Leu Val Lys Glu Thr Arg Ile Cys Glu Val Arg Pro Cys\n            260                 265                 270\nGly Gln Pro Val Tyr Ser Ser Leu Lys Lys Gly Lys Lys Cys Ser Lys\n        275                 280                 285\nThr Lys Lys Ser Pro Glu Pro Val Arg Phe Thr Tyr Ala Gly Cys Leu\n    290                 295                 300\nSer Val Lys Lys Tyr Arg Pro Lys Tyr Cys Gly Ser Cys Val Asp Gly\n305                 310                 315                 320\nArg Cys Cys Thr Pro Gln Leu Thr Arg Thr Val Lys Met Arg Phe Arg\n                325                 330                 335\nCys Glu Asp Gly Glu Thr Phe Ser Lys Asn Val Met Met Ile Gln Ser\n            340                 345                 350\nCys Lys Cys Asn Tyr Asn Cys Pro His Ala Asn Glu Ala Ala Phe Pro\n        355                 360                 365\nPhe Tyr Arg Leu Phe Asn Asp Ile His Lys Phe Arg Asp\n    370                 375                 380\n(2)系列资料5：\n(i)序列特征：\n(A)长度：2267碱基对\n(B)类型：核酸\n(C)链型：单链\n(D)拓扑结构：线性\n(ii)分子类型：DNA\n(ix)特征：\n(A)名称/关键词：混合特征(misc_feature)\n(D)其它资料：“Fisp 12 cDNA编码序列”\n(xi)序列描述：序列5：\nGAATTCCGCC GACAACCCCA GACGCCACCG CCTGGAGCGT CCAGACACCA ACCTCCGCCC      60\nCTGTCCGAAT CCAGGCTCCA GCCGCGCCTC TCGTCGCCTC TGCACCCTGC TGTGCATCCT     120\nCCTACCGCGT CCCGATCATG CTCGCCTCCG TCGCAGGTCC CATCAGCCTC GCCTTGGTGC     180\nTCCTCGCCCT CTGCACCCGG CCTGCTACGG GCCAGGACTG CAGCGCGCAA TGTCAGTGCG     240\nCAGCCGAAGC AGCGCCGCAC TGCCCCGCCG GCGTGAGCCT GGTGCTGGAC GGCTGCGGCT     300\nGCTGCCGCGT CTGCGCCAAG CAGCTGGGAG AACTGTGTAC GGAGCGTGAC CCCTGCGACC     360\nCACACAAGGG CCTCTTCTGC GATTTCGGCT CCCCCGCCAA CCGCAAGATT GGAGTGTGCA     420\nCTGCCAAAGA TGGTGCACCC TGTGTCTTCG GTGGGTCGGT GTACCGCAGC GGTGAGTCCT     480\nTCCAAAGCAG CTGCAAATAC CAATGCACTT GCCTGGATGG GGCCGTGGGC TGCGTGCCCC     540\nTATGCAGCAT GGACGTGCGC CTGCCCAGCC CTGACTGCCC CTTCCCGAGA AGGGTCAAGC     600\nTGCCTGGGAA ATGCTGCAAG GAGTGGGTGT GTGACGAGCC CAAGGACCGC ACAGCAGTTG     660\nGCCCTGCCCT AGCTGCCTAC CGACTGGAAG ACACATTTGG CCCAGACCCA ACTATGATGC     720\nGAGCCAACTG CCTGGTCCAG ACCACAGAGT GGAGCGCCTG TTCTAAGACC TGTGGAATGG     780\nGCATCTCCAC CCGAGTTACC AATGACAATA CCTTCTGCAG ACTGGAGAAG CAGAGCCGCC     840\nTCTGCATGGT CAGGCCCTGC GAAGCTGACC TGGAGGAAAA CATTAAGAAG GGCAAAAAGT     900\nGCATCCGGAC ACCTAAAATC GCCAAGCCTG TCAAGTTTGA GCTTTCTGGC TGCACCAGTG     960\nTGAAGACATA CAGGGCTAAG TTCTGCGGGG TGTGCACAGA CGGCCGCTGC TGCACACCGC    1020\nACAGAACCAC CACTCTGCCA GTGGAGTTCA AATGCCCCGA TGGCGAGATC ATGAAAAAGA    1080\nATATGATGTT CATCAAGACC TGTGCCTGCC ATTACAACTG TCCTGGGGAC AATGACATCT    1140\nTTGAGTCCCT GTACTACAGG AAGATGTACG GAGACATGGC GTAAAGCCAG GAAGTAAGGG    1200\nACACGAACTC ATTAGACTAT AACTTGAACT GAGTTGCATC TCATTTTCTT CTGTAAAAAC    1260\nAATTACAGTA GCACATTAAT TTAAATCTGT GTTTTTAACT ACCGTGGGAG GAACTATCCC    1320\nACCAAAGTGA GAACGTTATG TCATGGCCAT ACAAGTAGTC TGTCAACCTC AGACACTGGT    1380\nTTCGAGACAG TTTACACTTG ACAGTTGTTC ATTAGCGCAC AGTGCCAGAA CGCACACTGA    1440\nGGTGAGTCTC CTGGAACAGT GGAGATGCCA GGAGAAAGAA AGACAGGTAC TAGCTGAGGT    1500\nTATTTTAAAA GCAGCAGTGT GCCTACTTTT TGGAGTGTAA CCGGGGAGGG AAATTATAGC    1560\nATGCTTGCAG ACAGACCTGC TCTAGCGAGA GCTGAGCATG TGTCCTCCAC TAGATGAGGC    1620\nTGAGTCCAGC TGTTCTTAAA GAACAGCAGT TTCAGCCTCT GACCATTCTG ATTCCAGTGA    1680\nCACTTGTCAG GAGTCAGAGC CTTGTCTGTT AGACTGGACA GCTTGTGGCA AGTAAGTTTG    1740\nCCTGTAACAA GCCAGATTTT TATTGATATT GTAAATATTG TGGATATATA TATATATATA    1800\nTATATTTGTA CAGTTATCTA AGTTAATTTA AAGTCATTTG TTTTTGTTTT AAGTGCTTTT    1860\nGGGATTTTAA ACTGATAGCC TCAAACTCCA AACACCATAG GTAGGACACG AAGCTTATCT    1920\nGTGATTCAAA ACAAAGGAGA TACTGCAGTG GGAATTGTGA CCTGAGTGAC TCTCTGTCAG    1980\nAACAAACAAA TGCTGTGCAG GTGATAAAGC TATGTATTGG AAGTCAGATT TCTAGTAGGA    2040\nAATGTGGTCA AATCCCTGTT GGTGAACAAA TGGCCTTTAT TAAGAAATGG CTGGCTCAGG    2100\nGTAAGGTCCG ATTCCTACCA GGAAGTGCTT GCTGCTTCTT TGATTATGAC TGGTTTGGGG    2160\nTGGGGGGCAG TTTATTTGTT GAGAGTGTGA CCAAAAGTTA CATGTTTGCA CCTTTCTAGT    2220\nTGAAAATAAA GTATATATAT ATTTTTTATA TGAAAAAAAA GGAATTC                  2267\n(2)系列资料6：\n(i)序列特征：\n(A)长度：348氨基酸\n(B)类型：氨基酸\n(C)链型：单链\n(D)拓扑结构：线性\n(ii)分子类型：蛋白质\n(ix)特征：\n(A)名称/关键词：混合特征(misc_feature)\n(D)其它资料：“Fisp 12氨基酸序列”\n(xi)序列描述：序列6：\nMet Leu Ala Ser Val Ala Gly Pro Ile Ser Leu Ala Leu Val Leu Leu\n1               5                   10                  15\nAla Leu Cys Thr Arg Pro Ala Thr Gly Gln Asp Cys Ser Ala Gln Cys\n            20                  25                  30\nGln Cys Ala Ala Glu Ala Ala Pro His Cys Pro Ala Gly Val Ser Leu\n        35                  40                  45\nVal Leu Asp Gly Cys Gly Cys Cys Arg Val Cys Ala Lys Gln Leu Gly\n    50                  55                  60\nGlu Leu Cys Thr Glu Arg Asp Pro Cys Asp Pro His Lys Gly Leu Phe\n65                  70                  75                  80\nCys Asp Phe Gly Ser Pro Ala Asn Arg Lys Ile Gly Val Cys Thr Ala\n                85                  90                  95\nLys Asp Gly Ala Pro Cys Val Phe Gly Gly Ser Val Tyr Arg Ser Gly\n            100                 105                 110\nGlu Ser Phe Gln Ser Ser Cys Lys Tyr Gln Cys Thr Cys Leu Asp Gly\n        115                 120                 125\nAla Val Gly Cys Val Pro Leu Cys Ser Met Asp Val Arg Leu Pro Ser\n    130                 135                 140\nPro Asp Cys Pro Phe Pro Arg Arg ValLys Leu Pro Gly Lys Cys Cys\n145                 150                 155                 160\nLys Glu Trp Val Cys Asp Glu Pro Lys Asp Arg Thr Ala Val Gly Pro\n                165                 170                 175\nAla Leu Ala Ala Tyr Arg Leu Glu Asp Thr Phe Gly Pro Asp Pro Thr\n            180                 185                 190\nMet Met Arg Ala Asn Cys Leu Val Gln Thr Thr Glu Trp Ser Ala Cys\n        195                 200                 205\nSer Lys Thr Cys Gly Met Gly Ile Ser Thr Arg Val Thr Asn Asp Asn\n    210                 215                 220\nThr Phe Cys Arg Leu Glu Lys Gln Ser Arg Leu Cys Met Val Arg Pro\n225                 230                 235                 240\nCys Glu Ala Asp Leu Glu Glu Asn Ile Lys Lys Gly Lys Lys Cys Ile\n                245                 250                 255\nArg Thr Pro Lys Ile Ala Lys Pro Val Lys Phe Glu Leu Ser Gly Cys\n            260                 265                 270\nThr Ser Val Lys Thr Tyr Arg Ala Lys Phe Cys Gly Val Cys Thr Asp\n        275                 280                 285\nGly Arg Cys Cys Thr Pro His Arg Thr Thr Thr Leu Pro Val Glu Phe\n    290                 295                 300             \nLys Cys Pro Asp Gly Glu Ile Met Lys Lys Asn Met Met Phe Ile Lys\n305                 310                 315                 320\nThr Cys Ala Cys His Tyr Asn Cys Pro Gly Asp Asn Asp Ile Phe Glu\n                325                 330                 335\nSer Leu Tyr Tyr Arg Lys Met Tyr Gly Asp Met Ala\n            340                 345\n(2)系列资料7：\n(i)序列特征：\n(A)长度：2075碱基对\n(B)类型：核酸\n(C)链型：单链\n(D)拓扑结构：线性\n(ii)分子类型：DNA\n(ix)特征：\n(A)名称/关键词：混合特征(misc_feature)\n(D)其它资料：“CTGF cDNA编码序列”\n(xi)序列描述：序列7：\nCCCGGCCGAC AGCCCCGAGA CGACAGCCCG GCGCGTCCCG GTCCCCACCT CCGACCACCG      60\nCCAGCGCTCC AGGCCCCGCG CTCCCCGCTC GCCGCCACCG CGCCCTCCGC TCCGCCCGCA     120\nGTGCCAACCA TGACCGCCGC CAGTATGGGC CCCGTCCGCG TCGCCTTCGT GGTCCTCCTC     180\nGCCCTCTGCA GCCGGCCGGC CGTCGGCCAG AACTGCAGCG GGCCGTGCCG GTGCCCGGAC     240\nGAGCCGGCGC CGCGCTGCCC GGCGGGCGTG AGCCTCGTGC TGGACGGCTG CGGCTGCTGC     300\nCGCGTCTGCG CCAAGCAGCT GGGCGAGCTG TGCACCGAGC GCGACCCCTG CGACCCGCAC     360\nAAGGGCCTCT TCTGTGACTT CGGCTCCCCG GCCAACCGCA AGATCGGCGT GTGCACCGCC     420\nAAAGATGGTG CTCCCTGCAT CTTCGGTGGT ACGGTGTACC GCAGCGGAGA GTCCTTCCAG     480\nAGCAGCTGCA AGTACCAGTG CACGTGCCTG GACGGGGCGG TGGGCTGCAT GCCCCTGTGC     540\nAGCATGGACG TTCGTCTGCC CAGCCCTGAC TGCCCCTTCC CGAGGAGGGT CAAGCTGCCC     600\nGGGAAATGCT GCGAGGAGTG GGTGTGTGAC GAGCCCAAGG ACCAAACCGT GGTTGGGCCT     660\nGCCCTCGCGG CTTACCGACT GGAAGACACG TTTGGCCCAG ACCCAACTAT GATTAGAGCC     720\nAACTGCCTGG TCCAGACCAC AGAGTGGAGC GCCTGTTCCA AGACCTGTGG GATGGGCATC     780\nTCCACCCGGG TTACCAATGA CAACGCCTCC TGCAGGCTAG AGAAGCAGAG CCGCCTGTGC     840\nATGGTCAGGC CTTGCGAAGC TGACCTGGAA GAGAACATTA AGAAGGGCAA AAAGTGCATC     900\nCGTACTCCCA AAATCTCCAA GCCTATCAAG TTTGAGCTTT CTGGCTGCAC CAGCATGAAG     960\nACATACCGAG CTAAATTCTG TGGAGTATGT ACCGACGGCC GATGCTGCAC CCCCCACAGA    1020\nACCACCACCC TGCCGGTGGA GTTCAAGTGC CCTGACGGCG AGGTCATGAA GAAGAACATG    1080\nATGTTCATCA AGACCTGTGC CTGCCATTAC AACTGTCCCG GAGACAATGA CATCTTTGAA    1140\nTCGCTGTACT ACAGGAAGAT GTACGGAGAC ATGGCATGAA GCCAGAGAGT GAGAGACATT    1200\nAACTCATTAG ACTGGAACTT GAACTGATTC ACATCTCATT TTTCCGTAAA AATGATTTCA    1260\nGTAGCACAAG TTATTTAAAT CTGTTTTTCT AACTGGGGGA AAAGATTCCC ACCCAATTCA    1320\nAAACATTGTG CCATGTCAAA CAAATAGTCT ATCTTCCCCA GACACTGGTT TGAAGAATGT    1380\nTAAGACTTGA CAGTGGAACT ACATTAGTAC ACAGCACCAG AATGTATATT AAGGTGTGGC    1440\nTTTAGGAGCA GTGGGAGGGT ACCGGCCCGG TTAGTATCAT CAGATCGACT CTTATACGAG    1500\nTAATATGCCT GCTATTTGAA GTGTAATTGA GAAGGAAAAT TTTAGCGTGC TCACTGACCT    1560\nGCCTGTAGCC CCAGTGACAG CTAGGATGTG CATTCTCCAG CCATCAAGAG ACTGAGTCAA    1620\nGTTGTTCCTT AAGTCAGAAC AGCAGACTCA GCTCTGACAT TCTGATTCGA ATGACACTGT    1680\nTCAGGAATCG GAATCCTGTC GATTAGACTG GACAGCTTGT GGCAAGTGAA TTTGCCTGTA    1740\nACAAGCCAGA TTTTTTAAAA TTTATATTGT AAATATTGTG TGTGTGTGTG TGTGTGTATA    1800\nTATATATATA TATGTACAGT TATCTAAGTT AATTTAAAGT TGTTTGTGCC TTTTTATTTT    1860\nTGTTTTTAAT GCTTTGATAT TTCAATGTTA GCCTCAATTT CTGAACACCA TAGGTAGAAT    1920\nGTAAAGCTTG TCTGATCGTT CAAAGCATGA AATGGATACT TATATGGAAA TTCTGCTCAG    1980\nATAGAATGAC AGTCCGTCAA AACAGATTGT TTGCAAAGGG GAGGCATCAG TGTCTTGGCA    2040\nGGCTGATTTC TAGGTAGGAA ATGTGGTAGC TCACG                               2075\n(2)系列资料8：\n(i)序列特征：\n(A)长度：349氨基酸\n(B)类型：氨基酸\n(C)链型：单链\n(D)拓扑结构：线性\n(ii)分子类型：蛋白质\n(ix)特征：\n(A)名称/关键词：混合特征(misc_feature)\n(D)其它资料：“CTGF氨基酸序列”\n(xi)序列描述：序列8：\nMet Thr Ala Ala Ser Met Gly Pro Val Arg Val Ala Phe Val Val Leu\n1               5                   10                  15\nLeu Ala Leu Cys Ser Arg Pro Ala Val Gly Gln Asn Cys Ser Gly Pro\n            20                  25                  30\nCys Arg Cys Pro Asp Glu Pro Ala Pro Arg Cys Pro Ala Gly Val Ser\n        35                  40                  45\nLeu Val Leu Asp Gly Cys Gly Cys Cys Arg Val Cys Ala Lys Gln Leu\n    50                  55                  60\nGly Glu Leu Cys Thr Glu Arg Asp Pro Cys Asp Pro His Lys Gly Leu\n65                  70                  75                  80\nPhe Cys Asp Phe Gly Ser Pro Ala Asn Arg Lys Ile Gly Val Cys Thr\n                85                  90                  95\nAla Lys Asp Gly Ala Pro Cys Ile Phe Gly Gly Thr Val Tyr Arg Ser\n            100                 105                 110\nGly Glu Ser Phe Gln Ser Ser Cys Lys Tyr Gln Cys Thr Cys Leu Asp\n        115                 120                 125\nGly Ala Val Gly Cys Met Pro Leu Cys Ser Met Asp Val Arg Leu Prc\n    130                 135                 140\nSer Pro Asp Cys Pro Phe Pro Arg Arg Val Lys Leu Pro Gly Lys Cys\n145                 150                 155                 160\nCys Glu Glu Trp Val Cys Asp Glu Pro Lys Asp Gln Thr Val Val Gly\n                165                 170                 175\nPro Ala Leu Ala Ala Tyr Arg Leu Glu Asp Thr Phe Gly Pro Asp Pro\n            180                 185                 190\nThr Met Ile Arg Ala Asn Cys Leu Val Gln Thr Thr Glu Trp Ser Ala\n        195                 200                 205\nCys Ser Lys Thr Cys Gly Met Gly Ile Ser Thr Arg Val Thr Asn Asp\n    210                 215                 220\nAsn Ala Ser Cys Arg Leu Glu Lys Gln Ser Arg Leu Cys Met Val Arg\n225                 230                 235                 240\nPro Cys Glu Ala Asp Leu Glu Glu Asn Ile Lys Lys Gly Lys Lys Cys\n                245                 250                 255\nIle Arg Thr Pro Lys Ile Ser Lys Pro Ile Lys Phe Glu Leu Ser Gly\n            260                 265                 270\nCys Thr Ser Met Lys Thr Tyr Arg Ala Lys Phe Cys Gly Val Cys Thr\n        275                 280                 285\nAsp Gly Arg Cys Cys Thr Pro His Arg Thr Thr Thr Leu Pro Val Glu\n    290                 295                 300\nPhe Lys Cys Pro Asp Gly Glu Val Met Lys Lys Asn Met Met Phe Ile\n305                 310                 315                 320\nLys Thr Cys Ala Cys His Tyr Asn Cys Pro Gly Asp Asn Asp Ile Phe\n                325                 330                 335\nGlu Ser Leu Tyr Tyr Arg Lys Met Tyr Gly Asp Met Ala\n            340                 345\n(2)系列资料9：\n(i)序列特征：\n(A)长度：25碱基对\n(B)类型：核酸\n(C)链型：单链\n(D)拓扑结构：线性\n(ii)分子类型：cDNA\n(xi)序列描述：序列9：\nGGGGATCTGT GACGAGCCCA AGGAC\n(2)系列资料10：\n(i)序列特征：\n(A)长度：26碱基对\n(B)类型：核酸\n(C)链型：单链\n(D)拓扑结构：线性\n(ii)分子类型：cDNA\n(xi)序列描述：序列10：\nGGGAATTCGA CCAGGCAGTT GGCTCG\n(2)系列资料11：\n(i)序列特征：\n(A)长度：26碱基对\n(B)类型：核酸\n(C)链型：单链\n(D)拓扑结构：线性\n(ii)分子类型：cDNA\n(xi)序列描述：序列11：\nGGGGATCCTG TGATGAAGAC AGCATT\n(2)系列资料12：\n(i)序列特征：\n(A)长度：26碱基对\n(B)类型：核酸\n(C)链型：单链\n(D)拓扑结构：线性\n(ii)分子类型：cDNA\n(xi)序列描述：序列12：\nGGGAATTCAA CGATGCATTT CTGGCC\n(2)系列资料13：\n(i)序列特征：\n(A)长度：21氨基酸\n(B)类型：氨基酸\n(C)链型：非相关\n(D)拓扑结构：非相关\n(ii)分子类型：肽\n(xi)序列描述：序列13：\n(2)系列资料14：\n(i)序列特征：\n(A)长度：21氨基酸\n(B)类型：氨基酸\n(C)链型：非相关\n(D)拓扑结构：非相关\n(ii)分子类型：肽\n(xi)序列描述：序列14：\n(2)系列资料15：\n(i)序列特征：\n(A)长度：24氨基酸\n(B)类型：氨基酸\n(C)链型：非相关\n(D)拓扑结构：非相关\n(ii)分子类型：肽\n(xi)序列描述：序列15：\n(2)系列资料16：\n(i)序列特征：\n(A)长度：26氨基酸\n(B)类型：氨基酸\n(C)链型：非相关\n(D)拓扑结构：非相关\n(ii)分子类型：肽\n(xi)序列描述：序列16：\nIle Ser Thr Arg Val Thr Asn Asp Asn Pro Glu Cys Arg Leu Val Lys\n1               5                   10                  15\nGlu Thr Arg Ile Cys Glu Val Arg Pro Cys\n            20                  25\n(2)系列资料17：\n(i)序列特征：\n(A)长度：21氨基酸\n(B)类型：氨基酸\n(C)链型：非相关\n(D)拓扑结构：非相关\n(ii)分子类型：肽\n(xi)序列描述：序列17：\nLys Tyr Cys Gly Ser Cys Val Asp Gly Arg Cys Cys Thr Pro Leu Gln\n1               5                   10                  15\nThr Arg Thr Val Lys\n            20