能抑制早老素和β－淀粉样肽或其前体间相互作用的肽

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本发明涉及新的多肽序列和核苷酸序列。更具体地讲，本发明涉 及能至少部分抑制早老素1或早老素2和β-淀粉样肽前体和/或β- 淀粉样肽间相互作用的新多肽。本发明还涉及揭示能抑制这种相互作 用的分子特别是小分子的体外试验的设计。\n有37-42个氨基酸的淀粉样肽Aβ是阿尔茨海默氏症特征性老年 斑的主要蛋白成分。此肽是其前体-淀粉样肽前体蛋白(APP)-的切割 产物。APP基因的一些突变对阿尔茨海默氏症的某些家族性早发形式 负责。但这些形式的大部分与两个基因的突变相关：通过定位克隆最 近鉴定(Hardy，1997)的早老素(presenilin)PS1(原称为S182)和 PS2(原称为STM2)。这些形式都是显性的，并相应于错义突变，一个 例外是突变导致缺失一个外显子。早老素是分子量为约45-50kDa的 疏水性膜蛋白，它们之间有67％的相同性。它们与C.elegans的两种 蛋白SPE4和Sel-12同源，后两者分别间接地参与分子内转运和Notch 受体的信号传导。但早老素的生理功能仍未知。如此相近的两种蛋白 与阿尔茨海默氏症相关让人想到早老素对该疾病病因中的必需生理途 径有贡献。\n蛋白PS1含467个氨基酸，PS2含448个。两种蛋白都具有膜蛋 白的结构，含6-8个潜在的跨膜结构域。每种早老素在体内易受一种 精确的蛋白降解性切割，产生一般称作N(氨基)末端片段和C(羧基) 末端片段的两个片段(Th inakaran等，1996)。这种切割已被绘制于PS1 的291和292残基之间(Podlisny等，1997)和PS2的一个同源区域中。 因此N-末端片段(N-ter)代表PS1的1至约291位的片段，C-末端片 段指其余部分。显然早老素在脂质膜中的确切形态结构尚未清楚确 定，但已提出它们的N-末端和C-末端[RC1]及亲水性大环处于胞质腔 中(Doan等，1996，见示意图1)。\n现已证明早老素的突变形式导致蛋白携带者中(Scheuner等， 1996)、转染的细胞中(Borchelt等，1996)或转基因小鼠中(Duff等， 1996)长淀粉样蛋白Aβ1-42的产量相对于Aβ1-40增高。构成老年斑 (该病的特征性损伤)的淀粉样肽Aβ和其不同形式源自淀粉样肽前体 蛋白APP的代谢。更具体地讲，已报道了淀粉样肽的两种主要形式， 一种具有40个残基，Aβ40，另一个在其羧基端有2个额外残基，称 为Aβ42。Aβ肽在体外具有强聚积性能，这种性能可被Aβ42形式所 增强，后者看来首先有效地形成在该病中可检测到的聚积。另外，在 人颅脑创伤后特异性地产生Aβ42形式，这种创伤构成阿尔茨海默氏 病的了解最清楚的环境危险因素之一。而且，与APP突变(有6种)及 早老素1和2的突变相关的该病的早发性遗传形式都促使Aβ42/Aβ 40比率的提高。所有这些因素似乎指出Aβ42是该病病因学的关键因 子，无论对该病的遗传形式还是偶发形式均如此，因而对其形成机制 的阐明变成了一个根本问题。\n对此，已报道了β-淀粉样肽和PS1或PS2间复合物在相同细胞包 膜中的形成(Weidemann等，1997，Xia等，1997)，但不了解β-淀粉 样肽的产生所负责事件的确切性质，还未能在这些复合物的可能作用 和β-淀粉样肽Aβ42的产生间建立任何联系。但值得重视的一点是， 肽Aβ42而非Aβ40看来位于神经细胞的内质网中(Hartmann等， 1997)。\n本发明的基础是，申请人找到并鉴定了参与形成复合物APP/PS1 和APP/PS2的早老素(PS1)和早老素(PS2)的特别区域、以及β-淀粉样 肽前体(APP)的特别区域。\n本发明特别是基于，揭示了PS2的N-亲水末端区(氨基酸1-87) 识别APP不同结构域的能力。本发明还基于，揭示了PS1 N-末端区域 (1-213片段)的相似特性。本发明还源自，证明了衍生自上述定义早 老素区域之多肽抑制APP和早老素间形成复合物的能力。本申请的早 老素主要为早老素1(PS1)和/或早老素2(PS2)。\n本发明还得益于，揭示了相互作用区域的意想不到的具体细胞位 置(相对于脂质膜)。特别是，这些相互作用不单可发生在膜水平，也 可发生在内质网腔水平和细胞外腔室中。考虑到一般认为PS的N-末 端区(参与相互作用)在标准条件下位于胞浆中，上述发现是出人意料 的。\n借助于APP和早老素相互作用区域的鉴定以及这些相互作用不同 细胞位置的揭示，可考虑制备可药用的新多肽。\n因此本发明的第一个主题涉及能至少部分抑制早老素和β-淀粉 样肽前体和/或β-淀粉样肽间相互作用的多肽。\n“能抑制相互作用”指本发明多肽和/或借助于本发明的方法揭示 的配体和/或分子的存在足以至少部分抑制早老素和/或其N-末端区与 β-淀粉样肽前体和/或β-淀粉样肽(优选肽Aβ1-42)间的所述相互作 用。\n在本申请的实施例中证明了，用本发明的多肽对这种相互作用的 抑制导致细胞内淀粉样肽Aβ1-42产量的降低。因此可预期本发明的任 何多肽和/或用本发明方法揭示的配体和/或分子都具有这种功能效 果。抑制这种相互作用从而抑制Aβ1-42的产生从而代表了涉及该淀粉 样肽形式之疾病的可选择的治疗靶点。\n按照一种具体实施方式，本发明的多肽包含允许与β-淀粉样肽前 体和/或β-淀粉样肽相互作用的早老素2(PS2)的至少一部分。优选 地，本发明多肽的特征在于所述PS2部分相应于PS2的亲水N-末端片 段。更优选地，本发明的多肽含有SEQ ID No.1相应序列或其衍生序 列的全部或部分。\n根据另一实施方式，本发明的多肽含有允许与β-淀粉样肽前体和 /或β-淀粉样肽相互作用的PS1的至少一部分。优选地，本发明的多 肽含有SEQ ID No.2相应序列或其衍生序列的全部或部分。\n根据另一实施方式，本发明的多肽至少包含序列SEQ ID No.1和 SEQ ID No.2相应的共有同源区域。\n根据另一实施方式，本发明的多肽含有β-淀粉样肽前体(APP)的 至少一部分。优选地，本发明的多肽含有β-淀粉样肽相应区域以外 APP的一部分。更优选地，这些多肽的特征在于所述β-淀粉样肽前体 的部分包含1-596片段的全部或部分。更优选地，本发明的多肽包含 选自SEQ ID No.3序列1-596片段相应序列或其衍生序列之序列的全 部或部分。\n在本发明中，术语“衍生多肽序列”指任何这样的多肽序列，它 与SEQ ID No.1或SEQ ID No.2的相应序列或SEQ ID No.3的所述片 段不同，通过一种或多种遗传和/或化学修饰获得的，具有至少部分抑 制早老素1或早老素2与β-淀粉样前体肽和/或β-淀粉样肽间相互作 用的能力。对于遗传和/或化学修饰应理解为一个或多个残基的任何突 变、替代、缺失、添加和/或修饰。这种衍生物的制备可能出于不同的 目的，如特别是为了提高该肽与其作用位点的亲和力，改进其生产水 平，提高其对蛋白酶的抗性，提高其治疗效力或减小其副作用，或带 来新的药动学和/或生物学性质。\n本发明还提供可药用的非肽化合物或非完全肽化合物。实际上， 以本申请中描述的多肽基元出发，可能获得至少部分抑制早老素1或 早老素2与β-淀粉样肽前体和/或β-淀粉样肽间相互作用的分子，它 们为非完全肽并适用于某种药物用途。对此，本发明涉及上述多肽在 制备药理活性非肽或非完全肽分子中的应用，其中确定这些多肽中对 其活性重要的结构元件并用非肽或非完全肽结构再现这些元件。本发 明还涉及含有一种或多种如此制备的分子的药物组合物。\n本发明的多肽应含有允许进行精确细胞定位的序列，以抑制早老 素与β-淀粉样肽前体和/或β-淀粉样肽间的相互作用。优选地，它们 是衍生自SEQ ID No.1和SEQ ID No.2并含有外源细胞定位序列的多 肽，更优选含有PS1或PS2的N-末端区的多肽。在这些序列中，可举 出信号肽序列，如IgkB的信号肽序列、APP的信号肽、肌肉和中枢烟 碱性乙酰胆碱受体亚基的信号肽等。\n特别有意义的多肽有含PS2N-末端头87个残基和IgkB信号肽的 多肽。\n本发明还涉及编码能至少部分抑制早老素1或早老素2与β- 淀粉样肽前体和/或β-淀粉样肽间相互作用的肽的核苷酸序列。根据 一种具体实施方式，涉及含有核苷酸序列SEQ ID No.1或其衍生序列 之全部或部分的核苷酸序列。根据另一实施方式，涉及含有核苷酸序 列SEQ ID No.2或其衍生序列之全部或部分的核苷酸序列。优选地， 涉及含有核苷酸序列SEQ ID No.1和SEQ ID No.2共有同源区域的核 苷酸序列。根据另一实施方式，涉及相应于序列SEQ ID No.3之1- 596片段(1-1788核苷酸)的核苷酸序列或一种衍生序列。\n在本发明中，衍生的核苷酸序列指因遗传密码子的简并性而与母 序列不同、通过一个或多个遗传和/或化学修饰而获得的任何序列，以 及与这些序列或其片段杂交并编码本发明多肽的任何序列。对于遗传 和/或化学修饰，可以理解为一个或多个残基的任何突变、替代、缺失、 添加和/或修饰。衍生序列还可以理解为来自其他细胞来源、尤其是人 源细胞或其他生物细胞的与母序列同源的序列。这种同源序列可以通 过杂交实验获得。可以用原序列或其片段作为探针在杂交的可变条件 下对核酸文库进行杂交(Maniatis等，1989)。\n本发明的核苷酸序列可以是或不是人工来源的，可以是基因组序 列、cDNA、RNA序列、杂合序列或合成或半合成序列。这些序列通过 例如用以上述序列为基础设计的探针筛选DNA文库(cDNA文库、基因 组DNA文库)而获得。这种文库可以按本领域技术人员已知的分子生物 学常规方法从各种细胞制得。本发明的核苷酸序列还可以通过化学合 成或通过包括对文库筛选所得序列进行化学或酶修饰的混合方法获 得。一般而言，本发明的核酸可按本领域技术人员已知的任何方法制 备。\n本发明的另一主题涉及本发明多肽的制备方法，其中将含有本发 明多核苷酸序列的细胞在所述序列的表达条件下培养并回收多肽产 物。对此，一般将编码所述多肽的部分置于允许其在细胞宿主中表达 的信号控制之下。这些信号(启动子、终止子、分泌前导序列等)的选 择可根据所用的细胞宿主而不同。另外，本发明的核苷酸序列可构成 可自主性或整合性复制的载体的一部分。具体地讲，可利用在所选择 的宿主中自主复制的序列制备自主复制性载体。对于整合性载体，例 如可利用与宿主基因组某些区域同源的区域(允许通过同源重组整合 在载体中)来制备。\n本发明还涉及用含本发明核苷酸序列的核酸转化的细胞宿主。可 用于通过重组方法产生本发明肽的细胞宿主可以是真核宿主也可以是 原核宿主。在适用的真核宿主中，可以举出动物细胞、酵母细胞或真 菌细胞。具体对酵母而言，可以举出酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵 母属、许旺酵母属或汉逊酵母属的酵母。对于动物细胞，可以举出COS、 CHO、C127、人成神经细胞瘤的细胞。在真菌中，尤其可以举出曲霉属 或木霉菌属的种类。作为原核宿主，优选使用下列细菌：大肠杆菌、 芽孢杆菌或链霉菌。\n根据一种优选方案，这些细胞宿主有利的代表为用于表达本发明 核酸并产生由其衍生的蛋白的重组酵母菌株。\n优选地，细胞宿主含有选自序列SEQ ID No.1或SEQ ID No.2或 SEQ ID No.3指定片段的序列的至少一种序列或序列片段，以产生本 发明的蛋白质。\n本发明的序列可用于基因治疗领域，特别是对SEQ ID No.1和SEQ ID No.2的衍生序列添加了信号肽，用于在体内产生并转移能够至少 部分抑制早老素1或早老素2与β-淀粉样肽前体和/或β-淀粉样肽间 相互作用的多肽。实际上，在本申请中出人意料地证明，将本发明的 多肽投送至内质网腔中并因此使衍生自序列SEQ ID No.1和SEQ ID No.2的多肽序列具有抑制早老素与β-淀粉样肽前体和/或β-淀粉样 肽间相互作用的生物活性，需要信号肽。\n根据本发明的另一实施方案，本发明的核苷酸序列用于构建可用 于表达载体的表达盒。更具体地，该表达盒用于生产本发明的多肽。\n利用本领域技术人员已知的技术或通过这些技术的组合，通过如 上所述的核苷酸序列(含于重组DNA中或否)在细胞宿主中的表达，可 以获得本发明的多肽。\n优选地，本发明的核酸序列构成可用于在体内、离体和/或体外诱 导本发明多肽表达之载体的一部分。所用的载体可以是各种来源的， 只要它能够转化动物细胞，优选人神经细胞。这可以是病毒载体、非 病毒载体或质粒载体。在本发明的一个优选实施方案中，使用病毒载 体，它可以来自腺病毒、逆转录病毒、腺相关病毒(AAV)、疱疹病毒、 巨细胞病毒(CMV)、痘苗病毒等。文献中已报道了含有外源核酸序列的 来自腺病毒、逆转录病毒或AAV的载体[Akli等，自然遗传学(Nature Genetics)3(1993)224；Stratford-Perricaudet等，人类基因治 疗(Human Gene Therapy)1(1990)241；EP 185 573，Levrero等， 基因(Gene)101(1991)195；Le Gal la Salle等，科学(Science)259 (1993)988；Roemer和Friedmann，欧洲生物化学杂志(Eur.J. Biochem.)208(1992)211；Dobson等，神经元(Neuron)5(1990)353； Chiocca等，新生物学(New Biol.)2(1990)739；Miyanohara等， 新生物学4(1992)238；WO91/18088].\n本发明因此还涉及含有插入在其基因组中的如上所定义并编码本 发明多肽的核酸序列的任何重组病毒。\n本发明的重组病毒最好是缺陷病毒。“缺陷病毒”指不能在靶细 胞中复制的病毒。一般而言，用于本发明中的缺陷病毒的基因组缺少 所述病毒在被感染细胞中复制所需的至少一个序列。这些区域可以被 消除(全部或部分)，或被致无功能，或被其他序列尤其是本发明的核 酸所替代。但优选地，缺陷病毒保留其基因组中病毒颗粒包壳作用所 需序列。\n特别有利的是使用掺入在缺陷性重组腺病毒、AAV或逆转录病毒 中的本发明的核酸序列。根据一种优选的实施方案，使用腺病毒。\n存在不同血清型的腺病毒，其结构和特性相差无几。在这些血清 型中，本发明优选使用2或5型人腺病毒(Ad2或Ad5)或源自动物的腺 病毒(见WO94/26914)。在可用于本发明的源自动物的腺病毒中，可举 出源自狗、牛、鼠(例如Mavl，Beard等，病毒学(Virology 75(1990) 81)、羊、猪、禽或猴(如SAV)的腺病毒。优选，源自动物的腺病毒是 狗腺病毒，更优选腺病毒CAV2[例如manhattan株或A26/61株(ATCC VR-800)]。优选，在本发明中使用源自人或狗的腺病毒或其混合物。 优选地，在本发明腺病毒的基因组中，至少E1区是非功能化的。目标 病毒基因可通过本领域技术人员已知的任何技术致非功能化，特别是 在目标基因中全部删除、取代、部分缺失或加入一个或多个碱基。其 他区域也可以被修饰，特别是E3区(WO95/02697)、E2区 (WO94/28938)、E4区(WO94/28152、WO94/12649、WO95/02697)和L5 区(WO95/02697)。根据一个优选的实施方案，本发明的腺病毒包含在 E1和E4区中的缺失。根据另一优选的实施方案，在E1区中有缺失， 在缺失处插入E4区和编码序列。在本发明的病毒中，E1区中的缺失 优选在腺病毒Ad5序列上从455核苷酸延伸至3329核苷酸。根据另一 优选实施方案，外源核酸序列被插入在E1区的缺失处。\n本发明的重组缺陷病毒可通过缺陷病毒和带有上述所定义核苷酸 序列的质粒之间的同源重组制备(Levrero等，基因，101(1991)195， Graham，EMBO J.3(12)(1984)2917)。这种同源重组是在所述病毒 和质粒共转染在适当的细胞系中后发生的。所用的细胞系优选应(i) 可用所述元件转化，及(ii)带有能补充缺陷病毒基因组缺陷部分的序 列，优选呈能避免重组危险的整合形式。作为可用于制备缺陷重组腺 病毒的细胞系的例子，可举出人胚肾细胞系293(Graham等，普通病毒 学杂志(J.Gen.Virol.)36(1977)59)，在其基因组中特别含有腺 病毒Ad5基因组的左侧部分(12％)。可用于制备重组缺陷逆转录病毒的 细胞系的一个实例是细胞系CRIP(Danos和Mulligan，PNAS 85(1988) 6460)，然后按分子生物学的常规技术回收和纯化经复制的病毒。\n本申请还涉及含有编码本发明肽的外源核酸序列的缺陷重组病 毒。\n本发明的另一主题是多克隆或单克隆抗体或抗体片段。这种抗体 可通过本领域技术人员已知的方法产生。具体讲，这些抗体可通过用 其序列选自SEQ ID No.1或SEQ ID No.2或SEQ ID No.3指定片段的 多肽免疫动物，然后采血并分离抗体而制备。这些抗体还可以按本领 域已知的技术通过制备杂交瘤而产生。本发明的抗体或抗体片段可特 别用于至少部分抑制早老素1或早老素2与β-淀粉样肽前体和/或β- 淀粉样肽间的相互作用。\n本发明的另一主题涉及鉴定能够调节或至少部分抑制早老素1或 早老素2与β-淀粉样肽前体和/或β-淀粉样肽间相互作用的化合物 的方法。具体地讲，该方法可用作鉴定这种抑制性化合物的分子筛选 试验。\n这种试验特别依赖于对早老素(1或2)与APP或Aβ肽间、特别是 Aβ1-42肽与PS2N-末端区间相互作用抑制的检测。实际上，借助于结 合于早老素或其片段上的标记蛋白和适当的揭示系统，特别是免疫沉 淀、发色团或荧光团的使用，完全可能检测对上述蛋白或其片段的相 互作用的抑制。一种这样的方法因而至少包括标记早老素和/或APP或 其片段的步骤，和检测对Aβ1-42肽与早老素(优选PS2)N-末端区或全 长蛋白APP和早老素间相互作用的抑制的步骤。\n该方法的第一种实施方案中，按以下步骤实现这种化合物的揭示 和/或鉴定：\n-将Aβ1-42肽预先保温吸附在硝酸纤维素膜上，\n-然后加入含早老素(PS1或PS2)全部或部分(最好是N-末端区) 的细菌提取物并与待测分子或含不同分子的混合物保温，\n-洗涤后，借助于早老素的标记蛋白在硝酸纤维素膜上显示早老 素与Aβ1-42肽间的相互作用。所寻求的分子抑制该相互作用，从而降 低了标记蛋白的信号强度。\n所用的标记蛋白最好是a)偶联有碱性磷酸酶或荧光发色团的S- tag结合蛋白，或b)抗PSNT抗体，即抗早老素N-末端区的抗体。\n按照该方法的另一实施方案，按如下方式进行新化合物的寻找：\n-Aβ1-42肽预先与孔板(96孔或以上)保温，\n-然后加入纯化的重组早老素N-末端区和待测分子或含不同分子 的混合物并保温，\n-洗涤后，借助于早老素的标记化合物在孔板中显示早老素与A β1-42肽间的相互作用。通过分光光度法检测早老素与β-淀粉样肽前 体和/或β-淀粉样肽间相互作用的缺失。\n在使用与碱性磷酸酶偶联的S-tag结合蛋白作为标记蛋白的具体 情况下，用比色底物显色后在450nm处测定信号。\n按照该方法的一种有利的和优选的实施方案，按如下步骤揭示和/ 或分离能够调节或至少部分抑制早老素1或早老素2与β-淀粉样肽前 体和/或β-淀粉样肽间、特别是Aβ1-42肽与PS2N-末端区间相互作用 的化合物：\n-将分子或含不同分子的混合物与在其N-末端(1位的上游)带有 生物素和3个β-丙氨酸(或3个赖氨酸)臂的合成Aβ1-42肽接触，\n-将上述反应混合物与用第一荧光团标记的纯化早老素N-末端区 一起保温，优选的荧光团是铕穴合物，\n-加入与第二荧光团偶联的链霉抗生物素(与肽biot-Aβ1-42的生 物素结合)，该第二荧光团能够在第一荧光团的发射波长下被激发，以 在两荧光团位置很近时便于荧光转移。\n-在第一荧光团的发射波长处经荧光测定法或通过测定第二荧光 团发射波长处信号的减弱来检测抑制相互作用的新化合物。\n按照一种具体方案，该第二荧光团为XL665，化学交联的别藻蓝 蛋白，以增强其665nm处的荧光(CisBiointernational)。因而相互 作用的缺失在第一荧光团的发射波长下通过荧光测定法或通过测定发 射波长为665nm的XL665信号的减弱来检测相互作用的丧失。\n该方法是特别有利的，因为它可以直接揭示早老素和APP和/或A β肽在均质液相中的相互作用，从而可以显示抑制所述相互作用的分 子。实际上，该方法依赖于两发色团物理位置相邻时(因而在Aβ1-42 与重组蛋白相互作用时)两荧光团间的荧光转移。根据该方法的一个优 选方案，第一个荧光团为铕穴合物(在337nm激发)，由标记的重组蛋 白携带，后者可与固定在肽biot-Aβ(特别是肽biot-Aβ1-42)上的链 霉抗生物素-XL665反应。优选地，标记的蛋白为早老素之一的N-末端 区(PSNT-K)。665nm荧光的丧失和铕穴合物特征性620nm荧光的增强 表示早老素或其N-末端区和APP和/或Aβ肽间相互作用被所研究的分 子抑制。\n根据该方法的一个方案，分子或含不同分子的混合物可首先与用 铕穴合物标记的纯化早老素N-末端接触，然后与在N-端带有生物素和 3个β丙氨酸(或3个赖氨酸)臂的肽Aβ1-40或Aβ1-42接触。在加入XL665 标记的链霉抗生物素之后，也可以通过上述方法、特别是665nm的荧 光读数来显示能调节或至少部分抑制早老素1或早老素2与β-淀粉样 肽前体和/或β-淀粉样肽间相互作用的新分子。\n根据揭示抑制早老素(1或2)与APP或Aβ肽、特别是Aβ1-42肽与 PS2 N-末端间相互作用之化合物方法的一个实施方案，其包括以下步 骤：\n-将a)含有早老素(PS1或PS2)全部或部分、优选N-末端区的细 胞溶解物，b)含有APP的细胞溶解物，被病毒、特别是杆状病毒感染 细胞的溶解物，和c)待测分子或含不同分子的混合物接触，\n-利用本领域熟知的适当抗体、相应于早老素或APP或Aβ肽的 溶解蛋白进行共免疫沉淀，\n-用标记抗体进行Western印迹揭示早老素与APP共免疫沉淀的 缺失，这表明所测分子具有所寻求的抑制特性。\n在一具体方案中，上述本发明的这些方法被用于揭示和/或分离早 老素与β-淀粉样肽前体和/或β-淀粉样肽间相互作用的配体、激动剂 或拮抗剂。\n本发明还涉及上文定义的多肽在揭示下列物质中的应用：这些多 肽的配体，尤其是早老素、β-淀粉样肽前体和/或β-淀粉样肽的配 体，优选Aβ1-42肽和/或PS2N-本端区的配体，以及能至少部分抑制 早老素与β-淀粉样肽前体和/或β-淀粉样肽间相互作用的化合物。\n本发明的另一主题涉及按上述方法鉴定和/或获得的配体或调节 剂作为药物的应用。这种配体或调节剂由于其干扰早老素与β-淀粉样 肽前体和/或β-淀粉样肽相互作用的能力，因而可以调节淀粉样肽A β1-42的产生，可治疗一些神经疾病，特别是阿尔茨海默氏症。\n本发明的另一主题涉及提供一种检测早老素与β-淀粉样肽前体 和/或β-淀粉样肽间、优选肽Aβ1-42与PS2N-末端区间相互作用的试 验，其特征在于它至少包括固定于上述分子上的两荧光团间荧光转移 的步骤，和经分光荧光测定法揭示该相互作用的步骤。如上文已提到 的，该试验还用于揭示抑制所述相互作用的分子，按本申请中描述的 检测对该相互作用之抑制作用的方法进行。\n本发明还涉及含有至少一种上文定义的多肽作为活性成分的任何 药物组合物。\n本发明还涉及含有至少一种上文定义的抗体和/或抗体片段、和/ 或反义寡核苷酸、和/或上文定义的配体作为活性成分的任何药物组合 物，以及含有至少一种上文定义的核苷酸序列作为活性成分的任何药 物组合物。\n另外，本发明还涉及这样的药物组合物，其中如上定义的肽、抗 体、配体和核苷酸序列之间联合或与其他活性成分联合。\n本发明还涉及这样的组合物，其中本发明的核苷酸序列整合在病 毒或非病毒性重组载体中。\n本发明的药物组合物可用于至少部分抑制早老素与β-淀粉样肽 前体和/或β-淀粉样肽间的相互作用。更优选这些药物组合物用于治 疗神经变性疾病，例如阿尔茨海默氏病。\n本发明的另一主题是上述多肽至少部分抑制早老素与β-淀粉样 肽前体和/或β-淀粉样肽间相互作用的应用，优选为这些肽在制备用 于治疗神经变性、特别是阿尔茨海默氏病的药物中的应用。\n对于本发明的应用，本发明的多肽或任何能至少部分抑制早老素 与β-淀粉样肽前体和/或β-淀粉样肽相互作用的分子，或相应的核酸 序列或上述载体，优选与药用赋形剂结合，以配制成适于局部、口服、 胃肠外、鼻内、静脉内、肌内、皮下、眼内、经皮等途径给药的形式。 它们优选呈口服形式。但可以设想注射形式，这特别可用无菌等渗盐 水溶液(磷酸单钠盐、二钠盐，氯化钠、钾、钙或镁等，或这些盐的混 合物)，或干组合物、特别是冻干品，根据情况加入无菌水或生理血清 可构建注射液。\n载体、特别是病毒的给药剂量可根据不同的参数变化，特别是根 据考虑的给药部位(神经器官、组织或肌肉)、注射次数、待表达的基 因、或寻求的治疗时间。一般而言，本发明的重组腺病毒可以以104 -104pfu、优选106-1010pfu的剂量形式配制和给药。pfu(噬斑形成 单位)相应于病毒溶液的感染能力，通过感染适当的细胞培养物并于一 般15天后测定被感染细胞空斑的数目来测定。病毒溶液pfu滴度的测 定技术在文献中有详细记载。\n本发明提供了一种治疗涉及早老素与β-淀粉样肽前体和/或β- 淀粉样肽相互作用之疾病、优选治疗神经变性疾病(特别是阿尔茨海默 氏病)的有效方法。\n下列说明性而非限制性实施例中将更详细地展示本发明。\n附图说明\n图1：A)截短PS2的构建示意图\nB)COS1细胞中的表达。\n图2：PS2的截短形式与APP的相互作用。\n图3：A)PS2的分泌性N-端(SecPS2NT)而非其胞浆形式(myc-PS2NT) 与APP的胞外相互作用。\nB)显示在胞外介质中SecPS2NT/APP而非myc-PS2NT/APP 的相互作用。\n图4：PS2与APP截短形式间的相互作用：\nA)PS2与APP的SPA4CT形式而非与APP的胞浆结构域(MC45F) 间的相互作用。\nB)PS2与APP的C100形式的相互作用。\n图5：PS1和PS1DC2与APP及其短形式间的相互作用：\nA)PS1与APP的全长形式及截短形式SPA4CT间的相互作用。\nB)PS1的截短形式(PS1 ΔC2)与APP的相互作用。\n图6：PS1和APP在昆虫细胞中的相互作用\nA)抗组氨酸(PS1上的标签)免疫沉淀，检测APP，\nB)抗PS1的免疫沉淀，检测APP，\nC)抗APP的反向免疫沉淀，检测PS1。\n图7：PS2NT的分泌形式与Aβ肽在细胞外介质中的相互作用。\n图8：Aβ/PS2Nt相互作用在硝酸纤维素滤膜上的体外再现。\nA)对PS2Nt浓度的剂量依赖性，\nB)对Aβ浓度的剂量依赖性。\n图9：PS1和APP全长形式的体外相互作用\nA)抗组氨酸的免疫沉淀，\nB)抗PS1的免疫沉淀。\n图10：PS1与片段SPA4CT相互作用在前边有信号肽的PS2N-末 端区存在下的转变。\n图11：PS2NT与Aβ1-42肽的体外相互作用：由96孔板试验(EL1SA) 揭示。\n图12：PS2NT与Aβ1-42肽的相互作用：由HTRF荧光转移试验(均 质性时间分辨荧光)揭示。\n图13：SecPS2NT对APP/PS1相互作用的阻断导致细胞内淀粉样肽 Aβ1-42产生的抑制。\nA)显示SecPS2NT对APP/PS1相互作用的阻断导致细胞内淀粉样 肽Aβ1-42产生的抑制。\nB)检查SecPS2NT的表达不影响不同转基因的表达。\n图14：通过用lactacystine的药物处理检测PS2与COS细胞内 源性APP的相互作用。\n图15：PS2和PS2NT与APP的第二区(不同于Aβ肽)的相互作用。\n材料的方法\nA.材料\n1.表达早老素的构建体\n以前已报道了用于在哺乳动物细胞中表达人蛋白PS1和PS2的表 达载体的构建(基础载体，pcDNA3，InVitrogen)(Pradier等，1996)。 制造了从PS2C-末端的多个连续缺失(见图1A)。以PS2的起始密码子 作为1位进行编号。\n纯化PS2的HindIII限制片段(从5′末编码区-55位到1080位的 内部位点)，与用HindIII线性化并用碱性磷酸酶处理的载体pcDNA3连 接。如此产生的截短PS2(PS2ΔC1)从N-末端延伸至361残基，加上 由3′末端带来的7个残基，因而相应于前6个跨膜结构域和亲水环 的大部分(图1A)。\n通过质粒PS2用PstI(679位的内部位点)消化并与相应于载体 PS23′-非编码部分的PstI片段连接构建了PS2ΔC2。截短的蛋白 PS2ΔC2为从PS2的1位到228位，加上3′末端带来的额外18个残 基。它包括PS2的头四个跨膜结构域。\n对带有突变N141I的PS2进行了相似构建，得到PS2ΔC2*。\n然后将构建体PS2ΔC2的HindIII(-55)/Msc I(590)限制片段克隆 在用HindIII处理过且Apa I末端处理成游离端的载体pcDNA3中。该构 建体PS2ΔC3从N-末端延伸至198位残基，加上2个额外残基，因而 含有PS2的头3个跨膜结构域。\nPS2ΔC2的限制片段HindIII(-55)/Nco I(504)用DNA聚合酶 Klenow片段处理使其Nco I末端为游离端，将其再克隆在相同载体 pcDNA3HindIII/(Apa I游离端)中，构建了PS2ΔC4，其延伸至PS2的 168位残基加上3个额外残基。\n通过PS2序列用寡核苷酸ext5′和ext3′扩增获得了PS2的亲水 N-末端片段：ext5′：\n5’-CGGAATTC ATCGATTCCACCCTCACATTCATGGCC-3’(SEQ ID4) (包括起始ATG(黑体)并引入EcoRI限制位点(下划线))，ext3′：\n 5’-CCGCTCGAGTTGTCGACCATGCTTCGCTCCGTATTTGAGG-3’ (SEQ ID5)(在PS2第90位残基后引入终止密码子及Xho I限制位点， 下划线)。\n用TA克隆法(InVitrogen)克隆到载体pCRII中后，测序验证了PCR 片段的正确性。然后将该片段(EcoR I/Xho I)与N-末端myc表位相应 序列同框引入在载体pcDNA3中：mycPS2Nter。\n为了不预言PS2的拓扑结构，将相同的Nter片段再克隆在载体 pSectagB中，与IgkB的信号肽序列同框，以便引导蛋白pS2Nter的 分泌：SecPS2-Nter。\n以相似方式用限制片段HindIII(1080)/Pst I(3′-非编码区中) 构建了PS2的C-末端片段，再克隆在载体pSecTagB HindIII/Pst I中， SecPS2Cter从第361残基延伸到C-末端，或克隆在载体pcDNA3myc 中，与myc表位同框。\n同样，获得了PS1的截短构建体。截体pcDNA3-PS1用Pflm I(PS1 的编码序列的636位的位点)和PS1序列3′-非编码区中的Xho I消 化。用T4DNA聚合酶处理将这些位点转变为游离末端。在琼脂糖凝胶 上纯化后，载体片段自身再连接，形成截短PS1的表达载体，其从PS1 的N-ter延伸至Ile213残基(第5个跨膜结构域之后)，加上12个额 外残基。该构建体相当于嵌合体ΔC2，被称为PS1ΔC2。\n2.表达APP的构建体\n2.1APP构建体\n以前已报道过(Dyrks等，1993)全长APP(695型)和SPA4CT(前面 带用于插入膜的信号肽的APP最后100个残基(597-695氨基酸))的 不同构建体。以下述方式获得了用于表达C100和APP胞浆结构域的载 体：利用下列寡核苷酸作为合成引物通过DNA的酶扩增(PCR(聚合酶链 式反应))获得了相应的cDNA：\n对于C100，使用寡核苷酸8172和8181；对于APP的胞浆结构域： 使用寡核苷酸8171和8181。\nOligo 81725’CAAAGATCT 3’(SEQ ID6)\n其含有：\n-限制酶Bgl II识别位点(下划线)，\n-编码APP的597-602氨基酸(695氨基酸的APP编号)的序列(黑 体)。\nOligo 8181 5’CAAGCGGCCGCTCATCCCTTGTCATCGTCGTCCT\nTGTAGTCTCC 3’(SEQID7)\n其含有：\n-限制酶Nat I的识别位点(下划线)，\n-编码APP 691-695氨基酸[695氨基酸的APP编号]序列的互补 序列(黑体)，\n-表位FLAG相应序列Asp-Tyr-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys的互补序 列(斜体)。\nOligo 8171 5’CAAAGATCT 3’(SEQ ID8)，\n其含有：\n-限制酶Bgl II的识别位点(下划线)，\n-编码APP 650-655氨基酸[695氨基酸的APP编号]的序列(黑 体)。\nDNA酶扩增的产物被克隆在载体pCRII中。通过DNA特异性终止子 法验证了核苷酸序列。\n然后将cDNA通过连接引入衍生自pSV2并在相同读框中含有表位 MYC的表达质粒中。\n2.2APP可溶形式的构建体：α-sAPP和β-sAPP\n以α-和β-切割位点终止的APP分泌形式的相应cDNA通过PCR获 得。\n寡核苷酸1：\n5’-ccatcgatggcta-3’(SEQ ID 9)\n引入了：\n-相当于β切割位点的APP 1788位之后的终止密码子(下划线的 反向互补序列)，\n-Cla I限制位点。\n寡核苷酸2：\n5’-ccatcgatggcta-3’(SEQ ID 10)\n引入了：\n-相当于α切割位点的APP 1836位之后的终止密码子(下划线的 反向互补序列)，\n-Cla I限制位点。\n寡核苷酸3：\n5’- -3’(SEQ ID 11)，\n用于两种形式，相应于APP的1583-1600区，包括APP的内部限制位 点Sac I(下划线)。\n对β-sAPP和α-sAPP分别使用引物对oligo3-oligo1和 aligo3-oligo2经PCR扩增了APP的cDNA。如前述将扩增产物亚克隆 在pCRII中，经测序验证了这些序列。纯化Sac I-Cla I限制片段并再 克隆在APP表达载体(见上文)中，后者本身用Sac I-Cla I消化以将 APP的C-末端部分分别用β-sAPP和α-sAPP的C-末端片段代替，建 新组建全长蛋白。\n3.杆状病毒构建体\n编码人PS1蛋白的杆状病毒转移载体的制备是从哺乳动物细胞表 达载体(Pradier等，1996)开始的。用限制酶Xho I和Not I消化提取 编码蛋白PS1的cDNA，然后克隆在转移质粒pAcHTCB(与6组氨酸的 融合蛋白)和pAcsG2(天然蛋白)中。重组杆状病毒的制备按供应商 (Pharmingen)的操作方法进行，即用1μg含目的基因的转移质粒和 0.5μg病毒DNA(Baculogold)共转染2×106个昆虫细胞(sf9)，27℃ 下5天后，刮下细胞并离心，上清液用作扩增和病毒滴度测定的病毒 储液，在细胞沉淀中用Western印迹显示蛋白的表达。\n表达人APP(695)的杆状病毒的制备以前已有报道(Essalmani 等，1996)。\n为了研究PS1和APP的表达，sf9细胞以M.O.I为2用表达人 APP(695)、人早老素1蛋白(PS1)、或N-末端有6组氨酸标签的PS1 (6HisPS1)、或N-末端有6组氨酸标签的对照蛋白恶臭假单胞菌XylE (6HisXylE)的杆状病毒共感染，然后用缓冲液10mM Tris、130mM NaCl、1％Triton×100、1％NP40、pH7.5溶解。\n溶解的蛋白用抗组氨酸(A)、抗PS1(1805)(B)、或抗APP(22C11) (C)的抗体进行免疫沉淀。用抗APP aCT43抗体(A)、22C11抗体(B)或 抗PS1 95/23抗体(C)进行Western印迹检测APP或PS1的存在。\n混合含APP、PS1或6HisPS1的溶解部分，然后在抗组氨酸或抗 PS1抗体存在下4℃免疫沉淀过夜。用抗体αCT49或22C11进行 Western印迹后显示APP的共免疫沉淀。\n4.质粒\n本发明所用的质粒如下：\n-pcDNA为一商业质粒(InVitrogen)，用于序列PS1和PS2及其 截短形式的克隆和哺乳动物细胞中的表达。\n-pCRII是一种商业质粒(InVitrogen)，用于PCR片段的克隆，\n-pSecTagB是一种商业质粒(InVitrogen)，用于加有分泌信号 (Igk信号肽)的cDNA的克隆和在哺乳动物细胞中的表达。\n-pSV2是一种商业质粒(Pharmacia)，用于cDNA的克隆和在哺乳 动物细胞中的表达。\n-pAcHTLB是一种商业质粒(Pharmingen)，用于向cDNA插入6(His) 表位和与杆状病毒的同源重组。\n-pAcSG2是一种商业质粒(Pharmingen)，用于与杆状病毒的同源 重组。\n-pET29a是一种商业质粒(Novagene)，用于cDNA在细菌中的表 达。\nB.方法\n1.细胞的转染\n对COS1细胞或CHO细胞建立的方法是，以与DNA1比8的比例(重 量/重量)使用一种脂转染剂和相同比例的一种合成多肽H1(序列： KTPKKAKKPKTPKKAKKP)以优化DNA的紧密度和转染效率。该方法尤其依 赖于DNA中磷酸根的电荷被脂转染剂正电荷的中和。\nCOS1细胞在含4.5g/l葡萄糖并补有3％L-谷氨酰胺、1％青链霉素 和10％胎牛血清的DMEM培养液(Dulbeco’s Modified Eagle’s Medium) 中在95％湿度和5％CO2的37℃孵箱中培养。\n在转染的前一天夜，以2.5×106细胞/100mm培养皿的密度接种细 胞。转染的当天，细胞用PBS(磷酸缓冲盐溶液)洗2次，用OptiMEM(专 利组合物，Gibco-BRL)洗一次以在孵箱中适应至少15分钟。\n对100mm培养皿而言，向300μl OptiMEM和64μg合成肽H1中 共加入8μg质粒DNA。在剧烈涡旋10秒钟后，等5分钟再向上述混 合物中加入稀释在300μl OptiMEM中的脂转染胺(32μl，即64μg)。 将混合物再次剧烈涡旋，然后静置30分钟。每管加入5ml OptiMEM， 涡旋后的混合物置于细胞上(其上已预先加了培养基)。然后将细胞置 于孵箱中4小时，其间用完全培养基置换其中的混合物。\n2.细胞溶解和蛋白的测定\n细胞通常在转染后48小时进行溶解(一般表达水平最高)。溶胞缓 冲液含有10mM Tris pH7.5，1mM EDTA，1％Triton X100，1％NP40 和混合蛋白酶抑制剂(，Boebringer-Mannheim)。在用PBS 清洗后，向每板中加入800μl冷缓冲液。然后对溶胞液进行超声处 理，再于4℃下磁棒搅拌过夜。以15000转/分钟离心30分钟分离沉 淀和上清液。然后按BCA试剂盒(Pierce)测定可溶性蛋白，以便为以 后的实验建立标准曲线。\n3.免疫沉淀\n通过用合成肽免疫兔子获得了抗PS2 N-末端肽的抗体95041 (Blanchard等，1997)和抗PS1前20个氨基酸的抗体(Duff等，1996)。 为了进行免疫沉淀，将100μg蛋白用400μl改进的RIPA(150mM NaCl， 50mM Tris pH8.0，1％Triton X100v/v，1％NP40v/v)稀释。加入30 μl蛋白A Sepharose悬液(PBS溶液中0.1％m/v)和3μl抗体。将该 悬液在旋转搅动机上4℃轻轻混合过夜。蛋白A Sepharose的复合物 用0.5ml改进的RIPA洗3次，用0.5ml洗涤缓冲液“Wash C”(10mM Tris pH7.5)洗3次。\n4.免疫转移\n样品(细胞溶解液)在等体积的上样缓冲液(125mM Tris pH6.8， 4％m/v SDS，20％甘油，0.02％溴酚蓝，50mM二硫苏糖醇)中95℃变性5 分钟。为了分析早老素的表达，样品在8M脲存在下37℃变性，以避 免95℃下早老素自身的聚集。\n将样品点在Tris-甘氨酸凝胶(Novex)上，其中丙烯酰胺的百分比 根据待分辨的分子量而不同。分子量标记也点在胶上(Broad Range， BioRad)。在100伏恒压下在1X最终SDS缓冲液(Novex)中迁移2小时。 然后在恒定150mA下凝胶向硝基纤维素膜或PVDF膜上转移约2小时 (1X最终转移缓冲液(Novex)加10％甲醇)。\n转移后，膜在含2％脱脂奶粉(Merck)的50ml PBS-T(PBS加0.5％ Tween)中室温封闭2小时。加入第一抗体(用有或无2％脱脂奶粉的 PBS-T稀释至1/1000至1/5000的最佳浓度)后，4℃放置一夜。用PBS-T 简单冲洗后，将膜在第二抗体(与辣根过氧化物酶偶联的抗小鼠或抗兔 IgG，视情况而定)存在下保温45分钟，第二抗体在称为“ECL”的缓 冲液(20mM Tris，150mM NaCl，0.1％Tween)中稀释至1/5000。\n然后将膜在“ECL”缓冲液中冲洗4次15分钟。通过ECL反应 (Amersham)，即以等体积即刻混合两种缓冲液来显示。对不同的照相 底片(Hyperfilun ECL；Amersham)进行曝光，然后冲印。\n5.PS2NT与淀粉样Aβ肽的体外结合\n5.1在细菌中产生重组蛋白PS2NT\n为了制备PS2NT(氨基酸1-87)的细菌表达载体，用下述寡核苷酸 经PCR扩增了PS2的cDNA：\n3′：(CCGCTCGAGTCATTGTCGACCATGCTTCGCTCCGTATTTGAGG)\n和5′(CCGGAATTCATCGATTCCACCATGCTCACATTCATGGCC)\n将所产生的片段克隆在pCRII中，验证序列。然后将该片段亚克隆在 载体pET29a(Novagene)中，与S-tag标签序列在同一读框中。在细 菌BL21中生产蛋白质。用IPTG诱导5小时后，离心回收(6000转/分， 10分钟)细菌，细胞沉淀溶解在RIPA缓冲液中(诱导后培养物的OD值 乘以培养物体积再除以23计算出体积)。超声溶解细菌，溶菌物在4 ℃下以13000转/分离心20分钟。上清液(总提取物)用于结合研究。\n还按供应商(Novagene)的报道用镍(Nickel)柱(有载体pET29a中 提供的多组氨酸标签)从总提取物纯化了重组蛋白PS2NT。\n5.2在硝酸纤维素膜上的PS2NT/Aβ42结合试验\n使用一96孔点印仪将合成的Aβ肽(溶液)上样于硝酸纤维素膜 (Schleicher and Schuell)上。上样后用TBST中稀释至1/10的封闭 反应物明胶(Novagen)封闭滤膜(对于非特异性蛋白结合位点)。封闭后 将滤膜置于点印仪上，在孔中加入PS2NT细菌提取物，于室温保温2 小时。在平行的孔中使用含pET29空质粒的细菌提取物作为对照。然 后将滤膜用RIPA缓冲液洗3次，从点印仪上取下，用PBST洗3次(每 次15分钟)。按供应商(Novagen)提供的方法用比色底物进行S-tag 标签的检测。通过滤膜的光扫描对比色反应(沉淀)进行定量，用软件 Tina2.1(Raytest)对每孔中的强度定量。\n5.3以ELlSA方式检测PS2NT/Aβ42相互作用的试验\n将合成的Aβ肽(1-40及1-42)(100μl，2μg/ml)在96孔板中 保温过夜以固定在塑料上。用PBS冲洗培养板2次，与PBS中5％(w/v) 的牛血清白蛋白保温使非特异性结合位点饱和。加入稀释在缓冲液 (25mM Tris/HCl，pH7.5，0.5％Triton X-100，0.5％NP40)中的纯化 的(按5.1中所述方法进行)重组蛋白PS2NT，在室温保温4小时。用 PBS-0.5％Tween冲洗2次后，与偶联有碱性磷酸酶的S-tag结合蛋白 按前述方法保温，显示保留在培养板上(与Aβ肽相互作用)的PS2NT 蛋白。在450nm处以分光光度法检测信号。\n5.4以HTRF(均匀时间分辨荧光)方式检测PS2NT/Aβ1-42相互作用 的试验\n将纯化的PS2NT蛋白(按5.1中所述方法产生)用荧光团铕穴合物 -----标记(PS2NT-K)。为了便于合成，合成了在其N-末端(Aβ肽1位的上 游)带有生物素和3β丙氨酸(或3个赖氨酸)间隔臂、在其C-末端有2 个精氨酸(R)的Aβ1-40和Aβ1-42肽：肽biot-3K-Aβ40RR和biot-3K-A β42RR。\nPS2NT-K与biot-Aβ40或biot-Aβ42相互作用的反应在含150mM NaCl、3.4mM EDTA和3mM CHAPS(去污剂)的缓冲液10mM HEPES，pH7.2 中进行。标记的PS2NT蛋白(终浓度6nM，即40μl 15nM的原始溶液) 与肽biot-Aβ40或biot-Aβ42(终浓度2μM，即40μl 5μM的原始 溶液和2μl的缓冲液)保温10分钟，然后加入于含400mM KF、133mM EDTA和1g/l BSA的100mM HEPES pH7.0缓冲液中8μg/ml浓度的XL665 标记的链霉抗生物素(XL665是交联的别藻蓝蛋白，CisBio International)。保温进行反应，于室温下4小时或于4℃下24小时， 用Packard Discovery计算机读数，其测定337nm激发后铕穴合物 620nm处的发射，及铕穴合物620nm荧光转移至XL655上后XL665在 665nm处的发射。复合物XL665-链霉抗生物素/biot-Aβ42/PS2NT-穴 合物的形成导致从穴合物向XL665的荧光转移，由计算机在665nm处 测定。在不形成复合物XL665-链霉抗生物素/biot-Aβ42/PS2NT-穴合 物时，铕穴合物在620nm处发射荧光。\n实施例\n实施例1.APP与PS2的相互作用和PS2上相互作用区的作图。\n本实施例的目的是确定PS2上的相互作用区域并证明所述区与 APP的相互作用。\n在图2是蛋白APP和PS2在哺乳动物细胞中相互作用的实例。用 PS2和APP转染的COS细胞的溶解物用抗PS2 N-末端的抗体(95041， Blanchard等，1997)进行免疫沉淀。然后用抗APP抗体进行免疫转移 分析了免疫沉淀。如以前所报道(Weideman等，1997)，在APP和PS2 共转染的细胞免疫沉淀中清楚地检测到了APP，而在不存在PS2时则 检测不到APP(图2，泳道6对比泳道7)。为了对两蛋白的相互作用区 域作图，构建了PS2的多种截短形式。为了保持PS2的膜拓扑结构- 后者一般由膜蛋白的N-末端部分决定，制得了PS2的C-端逐渐缩短的 形式，它们在不同的跨膜结构域之后结束：TM6(PS2ΔC1)、TM4(PS2 ΔC2)、TM3(PS2ΔC3)和TM2(PS2ΔC4)，见图1A的示意图。还以胞 浆形式(天然序列)或以加了Igk链信号肽的分泌形式构建了PS2的亲 水N-末端片段(87个残基)。这些不同形式的表达示于图1B中，用抗 PS2的抗体(95041)显示。具有疏水性结构域的构建体除呈现预期分子 量处单体形式相应条带外(这里形成相近的双带)，还出现PS2特有的 二聚体及高分子量聚积体形式(图1B，泳道3-5)。特别就全长PS2而 言，在该图中只能看到这些聚积体而看不到单体形式(泳道6)。PS2亲 水N-末端的两个构建体mycPS2Nt和SecPS2Nt给出预期分子量处的 条带(图1B，泳道1和2)。构建体SecPS2Nt还被分泌在细胞外介质中 (图3B，泳道2)，而mycPS2Nt在胞浆中。\n这些构建体逐一与APP一起共转染。细胞溶解物的去污剂可溶部 分用抗PS2N-末端的抗体进行免疫沉淀，通过免疫印迹分析这些免疫 沉淀。如使用全长PS2一样，使用所有PS2的截短形式PS2ΔC2到PS2 ΔC4都可以在免疫沉淀中检测到APP(图2，泳道3-5)，证明了APP 与含PS2N-末端之形式间的相互作用。分泌形式的PS2N-末端构建体 保留了与APP的这种相互作用(图2，泳道2)，说明PS2Nt锚定于脂 质膜上并不是这种相互作用所必需的。相反，胞浆形式的mycPS2NT 不与APP相作用(图2，泳道1)。\n用抗APP抗体进行的反向免疫沉淀实验及利用抗PS2N-末端抗体 的检测实验证实了在不同试验条件下APP与SecPS2Nt间的相互作用。\n在用APP和SecPS2Nt共转染细胞的培养基中，也通过共免疫沉淀 证明了这两种蛋白间的相互作用(图3A，泳道4，和图3B，泳道3)。 在该培养基中mycPS2NT形式不与APP相作用(图3B，泳道2)。培养基 中存在相互作用，说明APP/PS2Nt复合物在分泌过程中是相对稳定 的。\n实施例2.APP与PS2的相互作用和APP中相互作用区域的作图\n本实施例的目的是确定APP中的相互作用区并证明所述区域与早 老素2的相互作用。\n为此，使用了APP的多个截短形式，以界定APP上的相互作用区。 使用了在信号肽控制下或否的含APP后100个残基的构建体(SPA4CT 和C100，Dyrks等，1993)和仅含胞浆结构域(APP的后45个残基)的 构建体，用抗APP胞浆结构域的抗体(αCT43，Stephens和Austen， 1996)检测其存在。在与PS2共转染的细胞中，揭示了SPA4CT与PS2 的相互作用，而APP的胞浆结构域则无(图4A，比较泳道4和5)。还 证明了PS2与C100构建体(无分泌信号)间的相互作用(图4B，泳道 7)。既使APP胞浆结构域在与IL2受体的嵌合结构中与膜结合，也 未能观察到与PS2的任何相互作用。本实施例证明存在与SPA4CT(APP 的597-695残基)而不与胞浆结构域(651-695残基)的相互作用，因 而表明APP中Aβ区(597-637残基)和跨膜节段的其余部分(直到650 残基)对与PS2的相互作用已足够。\n实施例3.PS1与APP的相互作用和初步作图\n本实施例的目的是确定PS1上的相互作用区并验证所述区与APP 的相互作用。\n与PS2所获结果类似(实施例1和2)，在相同的COS1细胞系统中 进行了PS1与APP相互作用的研究。用抗PS1后20个氨基酸的抗体 (Duff等，1996)进行共免疫沉淀后，可在沉淀中检测到SPA4CT，即 APP的C-末端片段(图5A，泳道4)。APP也与PS1相作用。同样，PS1 的截短形式PS1ΔC2(1-213)也与APP相作用(图5B，泳道4)。这些 初步的结果使我们设想，APP和PS1间的相互作用区域应与上述PS2 的那些相近。\n为了验证PS1/APP相互作用的真实性和广泛性，使用了一个不同 的细胞系，其中用表达带或不带6His标签的PS1及APP的重组杆状病 毒感染的昆虫细胞(参见“材料和方法”)。当用两种类型的重组病毒 共感染细胞时，在抗6His(对于PS1-6His，图6A，泳道4)或抗PS1(对 于有或无6His的PS1，图6B，泳道4和5)免疫沉淀中通过分析溶胞 物检测到了APP，但只有一种蛋白表达时则检不到(泳道1、2和3)。 相应地，在抗APP免疫沉淀中，在双重感染时可检测到PS1-6His和 PS1蛋白(图6C，泳道4和5)。该实验用不同的抗体双向证实了相互 作用的存在。\n实施例4.细胞中Aβ与PS2的相互作用\n由于APP和PS2相互作用的区域涉及APP中含淀粉样肽的区域 (595-635)和PS2的亲水N-端结构域，在本实施例中证明该后一区域 可直接与细胞产生的淀粉样肽(Aβ)相作用。SPA4CT(相应于前面有信 号肽的APP最后100个残基)在COS细胞中的表达导致大量产生淀粉样 肽，这部分是由于SPA4CT被认为是Aβ的生物前体。用SPA4CT本身、 SPA4CT加SecPS2Nt或用SecPS2Nt自身转染COS细胞。相应的细胞外 介质用抗PS2抗体免疫沉淀，用特异性抗体WO2检测到了Aβ肽(Nida 等(1996)，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)271，22908-914)(图 7)。Aβ肽仅在用SecPS2Nt和SPA4CT共转染细胞中作为弱强度带被检 测到(图7，泳道1)，而在各对照中检测不到(泳道2和3)。另外，还 在双重感染的细胞中特异性检测到了约40kDa的另一带。洗膜并用PS2 抗体检测后显示，相同分子量的条带也是PS2免疫反应活性的(图7， 泳道4)。如所预料的，在用SecPS2Nt转染的细胞中也存在该条带。 因此，在双重感染的细胞中，该带代表SecPS2Nt与Aβ间的SDS稳定 的复合物，可证实这两种物质间的相互作用。Aβ肽(4kDa)带来的小分 子量差异可以解释为什么与SecPS2Nt单独感染的细胞间没有可检测 的大小差异。由这些实验的结果可以得出结论，PS2的分泌形式 (SecPS2Nt)在体外与Aβ肽(APP695的597-637)相作用。\n实施例5.Aβ和PS2Nt相互作用在硝酸纤维素膜上的体外重现\n本实施例的目的是说明PS2Nt-APP(Aβ)相互作用的体外重现。\n为了证实Aβ肽与PS2Nt(PS2的N-末端片段)间的相互作用，开发 了一种体外结合试验。构建了在N-末端带有肽标签/S标记(S-tag)的 PS2Nt融合蛋白，并在细菌中表达。将肽Aβ1-40和Aβ1-42上样于硝基 纤维素膜上，在表达PS2Nt蛋白的细菌提取物存在下保温。然后通过 偶联有碱性磷酸酶的S-tag结合蛋白和比色反应揭示S-tag。在该体 外试验中，S-tag-PS2Nt蛋白与Aβ肽结合良好(图8A)。作为对照， 在只表达S肽的细菌提取物存在下保温，其用作与Aβ肽(1-40和1 -42形式)非特异性结合的水平。细菌提取物的系列稀释样品表明这 种结合是剂量依赖性的并且是可饱和的。在该实验中，与Aβ1-42的结 合似乎强于与Aβ1-40的结合，但有一定的可变性。例如，PS2Nt的结 合依赖于沉积于膜上的Aβ的量，Aβ1-40和Aβ1-42具有相当的结合值。\n本实施例因而证实了PS2Nt-APP(Aβ)相互作用在合成Aβ和细菌 来源PS2Nt间的体外重现。由于PS2的病理突变导致一些系统中产生 的Aβ1-42/Aβ1-40比率升高，另外在PS2和APP间存在物理相互作用， 这种物理相互作用看来可能参与了Aβ1-42肽的产生。因此，抑制这种 相互作用构成了一种对阿尔茨海默氏病的特别新颖的治疗途径。\n实施例6.在96孔板中的Aβ42/PS2NT相互作用试验(ELlSA型)。图 11\n实施例5提供了证明Aβ肽与PS2NT蛋白在硝酸纤维素膜上直接 相互作用的结果。本实施例的目的是证实实施例5的信息并描述在96 孔板上对该相互作用的揭示。将Aβ肽(Aβ40或Aβ42)通过保温固定 在96孔塑料板上。然后将培养板与重组PS2NT蛋白保温。冲洗后，通 过S-tag结合蛋白在孔中的结合及比色显示进行相互作用(Aβ/PS2NT) 的检测。PS2NT以剂量依赖的方式结合于肽Aβ1-42上(图11)，但不与 肽Aβ1-40或反向序列肽Aβ40-1结合，也不与另一产淀粉样肽淀粉不溶 素(amyline)结合。经免疫检测证实，结合于孔板上的Aβ1-42和Aβ1-40 的量相等。PS2NT与Aβ42的结合常数为0.18μM。PS2NT对Aβ42形 式与Aβ40相比的特异性在实施例5中仅含蓄地提到。本实施例确认 该特异性在本试验中完全可以重现。\n从这种形式的Aβ42/PS2NT相互作用试验容易想到筛选抑制该相 互作用之分子的试验。\n实施例7.HTRF形式的Aβ42/PS2NT相互作用试验\n在实施例5和6中，分别在硝酸纤维素膜上和96孔板上(ELlSA 型)证实了Aβ42肽与蛋白PS2NT间的直接相互作用。\n本实施例的目的是证实这些信息并描述利用荧光转移技术在液相 /均相中对该相互作用的揭示。\n在“材料和方法”(5.4)中描述的试验原理是基于荧光转移的。铕 穴合物标记的重组蛋白PS2NT(PS2NT-K)与肽biot-Aβ42相作用，如 图12中(第3个直方柱)所示。在过量无标记的PS2NT存在下该信号减 弱，因而PS2NT-K/biot-Aβ42相互作用被无标记的PS2NT替代 (IC50＝400nM)。检测到的荧光信号随时间是稳定的：室温下4小时到 4℃下24小时(按所选的条件而不同，见“材料和方法”)。\n对于肽biot-Aβ42(信号的线性区为0-2.5μM)和PS2NT-K(信号 的线性区为0-7.5nM)，这种相互作用是剂量依赖性的。如图12中第 5个直方柱所示，PS2NT-K与肽biot-Aβ40不存在相互作用，这产生 了另外的特异性因素。PS2NT对Aβ42形式相对于Aβ40的特异性在 实施例5中只含蓄地提到，而在实施例6和本实施例中得以证实。\n该PS2NT与Aβ42相互用的HTRF试验(反映细胞中APP/PS的相互 作用)因而可通过高通量筛选用于鉴定抑制该相互作用的分子。\n实施例8.APP/PS1相互作用的体外重现\n本实施例的目的是证明全长蛋白APP和PS1间的相互作用可用不 同的细胞溶解物(为显示相互作用而以独特方式混合)重建。\n使用可大量表达重组蛋白的杆状病毒表达系统，用三种病毒各自 单独感染之细胞的溶解物作为蛋白APP、PS1和PS1-His6的来源。将 含有APP、PS1或6HisPS1的可溶部分混合，在抗组氨酸或抗PS1抗体 存在下4℃免疫沉淀过夜。在免疫沉淀中清楚地检测到了APP(图9A， 泳道3和图9B，泳道3)，表明通过两种蛋白保温体外重现了APP与 PS1-His或PS1间的相互作用。单独APP仅被抗PS 1抗体少量沉淀(图 9B，泳道1)，但用抗His无沉淀，证实了在这种情况下相互作用的特 异性。这些结果说明了两种全长蛋白APP和PS1体外相互作用的测定。\n实施例9.SecPS2Nt阻断转染细胞中APP与PS1的相互作用\n上述实施例证明以类似于PS2的方式APP与PS1相作用，对于 PS2，SecPS2Nt构建体足以与APP相作用。本实施例的目的是评价 SecPS2Nt与APP的结合可以以交叉方式(异源)阻断与PS1的相互作 用。在COS1系统中，在表达SPA4CT和PS1wt或突变PS1(PS1*)细胞 的抗PS1免疫沉淀中可以检测到SPA4CT(相应于前边有信号肽的APP 最后100个残基)(图10A，泳道1和2)。另外，当SecPS2NT也共转染 时，SPA4CT信号在抗PS1免疫沉淀中几乎消失(图10A，泳道3和4)。 在进行抗PS1免疫沉淀后，上清液(不与蛋白A Sepharose结合的部分) 用抗PS2的抗体进行第二次免疫沉淀。在PS1和SecPS2Nt共转染的细 胞中清楚检测到了SPA4CT(图10B，泳道3和4)，表明SecPS2Nt的结 合置换了SPA4CT与PS1的结合。该实验使我们得出结论：SecPS2Nt 这一分子不仅能与APP结合，而且能置换APP与PS1及很可能与PS2 的结合。因此SecPS2Nt在细胞中可作为阻断APP与两种早老素PS1 和PS2相互作用的引诱物。实际上，PS1/APP相互作用作图的结果证 实，起作用的相互作用区域与PS2的相似。\n实施例10.对APP/PS1相互作用的阻断导致抑制细胞内淀粉样肽的产 生\n实施例9证明SecPS2NT的表达可以阻断APP与PS1或突变PS1 间的相互作用。本实施例分析这种抑制对淀粉样肽生产的影响，特别 是对Aβ40和Aβ42两种形式。实际上文献中以前已报道，早老素(PS1 或PS2)的病理突变导致Aβ肽长形式Aβ42与Aβ40形式之比即Aβ 42/Aβ40之比升高(Borchelt等，1996，综述见Hardy，1997)。\n在不存在(泳道1和2)或存在SecPS2NT(泳道3和4)情况下， SPA4CT与PS1wt(图13A，泳道1和3)或与突变PS1(图13A，泳道2 和4)共表达。分析溶胞物和细胞的条件培养基中淀粉样肽的产生。用 特异性识别Aβ40的(FCA3340)或Aβ42的C-末端的抗体(FCA3542； Barelli等，1997)进行免疫沉淀分析Aβ40和Aβ42，用识别这两种 形式的抗体进行免疫印迹分析免疫沉淀。在溶胞物中，突变PS1的表 达与PS1wt相比明显导致Aβ42的产生(1.5至2倍)及多聚体形式的 产生升高，而Aβ40的水平变化很小(比较图13A，泳道1和2，Aβ42 和Aβ40溶胞物)，与预期的结果一致。在存在SecPS2NT时，Aβ42(及 多聚体)的水平显著降低(图13A，泳道3和4)，对PS1wt和突变PS1 结果相同。在胞外培养基中，Aβ42的水平似也减低，但程度较小。 在不同的条件下淀粉样肽Aβ40的水平没有变化，这证明对Aβ42的 影响是特异的，不是由于表达水平的整体改变引起的。这通过分析不 同转染基因的表达而得以证实：SPA4CT、SecPS2NT和PS1(图13B)。 在本实施例中从而证明了，无论对于突变PS1还是野生PS1，用遗传 结构域SecPS2NT抑制PS1/APP相互作用导致细胞内Aβ42生产水平降 低。与归于Aβ42的在阿尔茨海默氏病发展中的原始作用相比较，本 实施例提供了这样的证明：抑制APP/PS相互作用代表了该疾病遗传形 式及偶发形式的重要治疗靶点。\n实施例11.借助于药物处理检测PS2与COS细胞内源性APP的相互作 用\n本实施例的目的是前述这些实施例的结果(超量表达两种相互作 用配偶体APP和PS(PS1或PS2)的细胞中的结果)对于非超量表达的或 内源的蛋白也是有效的。实际上，两种蛋白的强超量表达可能导致相 互作用的假象。在本实施例中研究了不存在两个配偶体同时超量表达 的条件下相互作用的检测。\nCOS细胞以内源方式表达APP，尽管水平较低。因而仅用PS2转染 了COS细胞。用抗PS2N-末端肽的抗体进行免疫沉淀分析溶胞物，用 抗APP抗体WO2通过免疫印迹来显示。图14中上边的图框显示仅用 PS2转染不能通过共免疫沉淀检测到与内源性APP的相互作用(图14， 泳道1)。\n另外，因为APP/PS相互作用导致Aβ42淀粉样肽的产生(前述实 施例)，因而APP在内质网上代谢时，该细胞室中的蛋白降解系统蛋白 酶体(proteasome)可能参与。分析了蛋白酶体选择性抑制剂 lactacystine的作用。在lactacystine存在下PS2转染的细胞保温 后，可在PS2免疫沉淀中清楚地显示COS细胞的内源性APP(图14，泳 道5，110kDa的带)。这种与内源性APP的相互作用具有前述的相同特 征，因为它可以以剂量依赖方式被遗传结构域SecPS2NT置换(图14， 泳道6和7)。实际上，泳道7显示在中等剂量的SecPS2NT下，总能 看到相应于内源APP的弱强度带。在更大剂量的SecPS2NT下(泳道 6)，内源APP相应的条带很弱，显示剂量依赖的特性。APP弱的残余 信号(约110kDa的带)总是存在的，这是由于APP与SecPS2NT的复合 物，它迅速分泌(因为SecPS2NT不再具有锚定跨膜结构域)，从而不在 细胞内积累。\n图14(中间和下边的图框)表明lactacystine的处理并不影响细 胞和分泌的总APP水平。实际上，相应于APP表达水平的带强度几乎 是恒定的。因而lactacystine作用的特异性证明是在与PS2相作用的 APP亚群上。\n从这些结果可以证明，如果蛋白酶体被抑制，可以检测到内源性 APP的APP/PS2相互作用。另外，这些结果证明可以在较少人工的条 件下检测APP/PS2相互作用。但这种相互作用很弱。因而为了获得更 显著的检测信号，要么求助于本实施例中的蛋白降解抑制剂，要么求 助于前述实施例中的两配偶体的超量表达。本实施例因而证明，前述 实施例中用超量表达两相互作用配偶体(APP和PS1或PS2)的细胞所得 的结果，对于非超量表达的或内源性的蛋白也有效。\n实施例12.PS2与APP中Aβ外的第二节段相作用\n本实施例的目的是证明APP的另一节段与PS2相作用。\n前文已证明SecPS2NT在细胞外介质中与APP的分泌形式相作用 (图3A，泳道4)。在APP的β位点(595位，相应于Aβ肽的起始端) 或α位(612位，该肽的更深处)切割后，释放APP的分泌形式。这些 结果提示PS2NT还与APP N-末端不同于Aβ的区域相作用。在β位点 (β-sAPP)和α位点(α-sAPP)插入终止密码子构建了APP的截短形 式，并经测试。全长PS2和SecPS2NT都有效地与α-sAPP(图15，泳 道3和5)及β-sAPP(图15，泳道4和6)相作用。这些结果证实，APP 1-595位间的节段(因而不同于Aβ)也能够与PS2及PS2NT相作用。 另外这些结果得以证实PS2NT/APP相互作用可在缺乏两配偶体与膜的 锚定时及在细胞的腔室(或细胞外)发生。\n参考文献\n-Doan等(1996)早老素1的蛋白拓扑学，神经元(Neuron) 17：1023-1030.\n-Thinakaran等，(1996)早老素1的内切蛋白酶解和加工衍生物的体 内积累，神经元(Nuron)17：181-190.\n-Podlisny等，(1997)早老素蛋白在Thr291和Ala299间进行不均 一的内切蛋白酶解，在正常和阿尔茨海默脑组织中产生稳定的N- 和C-末端片段，疾病的神经生物学(Neurobiology of Disease) 3：325-337.\n-Pradier，L.，Czech，C.，Mercken，L.，Revah，F.和Imperato，A. 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用的肽\n(iii)序列数：11\n(iv)计算机可读形式：\n(A)载体类型：软盘\n(B)计算机：IBM PC兼容\n(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS\n(D)软件：PatentIn Release#1.0，版本#1.30(EPO)\n(2)SEQ ID NO：1的信息：\n(i)序列特征：\n(A)长度：261碱基对\n(B)类型：核苷酸\n(C)链数：双链\n(D)构型：线性\n(ii)分子类型：DNA(基因组)\n(iii)假拟：否\n(iv)反义：否\n(ix)特性：\n(A)名称/关键词：CDS\n(B)位置：1..261\n(xi)SEQ ID NO：1的序列描述：\nATG CTC ACA TTC ATG GCC TCT GAC AGC GAG GAA GAA GTG TGT GAT GAG       48\nMet Leu Thr Phe Met Ala Ser Asp Ser Glu Glu Glu Val Cys Asp Glu\n  1               5                  10                  15\nCGG ACG TCC CTA ATG TCG GCC GAG AGC CCC ACG CCG CGC TCC TGC CAG       96\nArg Thr Ser Leu Met Ser Ala Glu Ser Pro Thr Pro Arg Ser Cys Gln\n             20                  25                  30\nGAG GGC AGG CAG GGC CCA GAG GAT GGA GAG AAT ACT GCC CAG TGG AGA      144\nGlu Gly Arg Gln Gly Pro Glu Asp Gly Glu Asn Thr Ala Gln Trp Arg\n         35                  40                  45\nAGC CAG GAG AAC GAG GAG GAC GGT GAG GAG GAC CCT GAC CGC TAT GTC      192\nSer Gln Glu Asn Glu Glu Asp Gly Glu Glu Asp Pro Asp Arg Tyr Val\n     50                  55                  60\nTGT AGT GGG GTT CCC GGG CGG CCG CCA GGC CTG GAG GAA GAG CTG ACC      240\nCys Ser Gly Val Pro Gly Arg Pro Pro Gly Leu Glu Glu Glu Leu Thr\n65                   70                  75                  80\nCTC AAA TAC GGA GCG AAG CAT                                          261\nLeu Lys Tyr Gly Ala Lys His\n                 85\n(2)SEQ ID NO：2的信息：\n(i)序列特征：\n(A)长度：243碱基对\n(B)类型：核苷酸\n(C)链数：双链\n(D)构型：线性\n(ii)分子类型：DNA(基因组)\n(iii)假拟：否\n(iv)反义：否\n(ix)特性：\n(A)名称/关键词：CDS\n(B)位置：1..243\n(xi)SEQ ID NO：2的序列描述：\nATG ACA GAG TTA CCT GCA CCG TTG TCC TAC TTC CAG AAT GCA CAG ATG    48\nMet Thr Glu Leu Pro Ala Pro Leu Ser Tyr Phe Gln Asn Ala Gln Met\n1                 5                  10                  15\nTCT GAG GAC AAC CAC CTG AGC AAT ACT GTA CGT AGC CAG AAT GAC AAT    96\nSer Glu Asp Asn His Leu Ser Asn Thr Val Arg Ser Gln Asn Asp Asn\n             20                  25                  30\nAGA GAA CGG CAG GAG CAC AAC GAC AGA CGG AGC CTT GGC CAC CCT GAG   144\nArg Glu Arg Gln Glu His Asn Asp Arg Arg Ser Leu Gly His Pro Glu\n         35                  40                  45\nCCA TTA TCT AAT GGA CGA CCC CAG GGT AAC TCC CGG CAG GTG GTG GAG   192\nPro Leu Ser Asn Gly Arg Pro Gln Gly Asn Ser Arg Gln Val Val Glu\n     50                  55                  60\nCAA GAT GAG GAA GAA GAT GAG GAG CTG ACA TTG AAA TAT GGC GCC AAG   240\nGln Asp Glu Glu Glu Asp Glu Glu Leu Thr Leu Lys Tyr Gly Ala Lys\n65                   70                  75                  80\nCAT\n243\nHis\n(2)SEQ ID NO：3的信息：\n(i)序列特征：\n(A)长度：2088碱基对\n(B)类型：核苷酸\n(C)链数：双链\n(D)构型：线性\n(ii)分子类型：DNA(基因组)\n(iii)假拟：否\n(iv)反义：否\n(ix)特性：\n(A)名称/关键词：CDS\n(B)位置：1..2088\n(xi)SEQ ID NO：3的序列描述：\nATG CTG CCC GGT TTG GCA CTG CTC CTG CTG GCC GCC TGG ACG GCT CGG     48\nMet Leu Pro Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Trp Thr Ala Arg\n1                 5                  10                  15\nGCG CTG GAG GTA CCC ACT GAT GGT AAT GCT GGC CTG CTG GCT GAA CCC     96\nAla Leu Glu Val Pro Thr Asp Gly Asn Ala Gly Leu Leu Ala Glu Pro\n             20                  25                  30\nCAG ATT GCC ATG TTC TGT GGC AGA CTG AAC ATG CAC ATG AAT GTC CAG    144\nGln Ile Ala Met Phe Cys Gly Arg Leu Asn Met His Met Asn Val Gln\n         35                  40                  45\nAAT GGG AAG TGG GAT TCA GAT CCA TCA GGG ACC AAA ACC TGC ATT GAT    192\nAsn Gly Lys Trp Asp Ser Asp Pro Ser Gly Thr Lys Thr Cys Ile Asp\n     50                  55                  60\nACC AAG GAA GGC ATC CTG CAG TAT TGC CAA GAA GTC TAC CCT GAA CTG    240\nThr Lys Glu Gly Ile Leu Gln Tyr Cys Gln Glu Val Tyr Pro Glu Leu\n65                   70                  75                  80\nCAG ATC ACC AAT GTG GTA GAA GCC AAC CAA CCA GTG ACC ATC CAG AAC    288\nGln Ile Thr Asn Val Val Glu Ala Asn Gln Pro Val Thr Ile Gln Asn\n                 85                  90                  95\nTGG TGC AAG CGG GGC CGC AAG CAG TGC AAG ACC CAT CCC CAC TTT GTG    336\nTrp Cys Lys Arg Gly Arg Lys Gln Cys Lys Thr His Pro His Phe Val\n            100                 105                 110\nATT CCC TAC CGC TGC TTA GTT GGT GAG TTT GTA AGT GAT GCC CTT CTC    384\nIle Pro Tyr Arg Cys Leu Val Gly Glu Phe Val Ser Asp Ala Leu Leu\n        115                 120                 125\nGTT CCT GAC AAG TGC AAA TTC TTA CAC CAG GAG AGG ATG GAT GTT TGC    432\nVal Pro Asp Lys Cys Lys Phe Leu His Gln Glu Arg Met Asp Val Cys\n    130                 135                 140\nGAA ACT CAT CTT CAC TGG CAC ACC GTC GCC AAA GAG ACA TGC AGT GAG    480\nGlu Thr His Leu His Trp His Thr Val Ala Lys Glu Thr Cys Ser Glu\n145                 150                 155                 160\nAAG AGT ACC AAC TTG CAT GAC TAC GGC ATG TTG CTG CCC TGC GGA ATT    528\nLys Ser Thr Asn Leu His Asp Tyr Gly Met Leu Leu Pro Cys Gly Ile\n                165                 170                 175\nGAC AAG TTC CGA GGG GTA GAG TTT GTG TGT TGC CCA CTG GCT GAA GAA    576\nAsp Lys Phe Arg Gly Val Glu Phe Val Cys Cys Pro Leu Ala Glu Glu\n            180                 185                 190\nAGT GAC AAT GTG GAT TCT GCT GAT GCG GAG GAG GAT GAC TCG GAT GTC    624\nSer Asp Asn Val Asp Ser Ala Asp Ala Glu Glu Asp Asp Ser Asp Val\n        195                 200                 205\nTGG TGG GGC GGA GCA GAC ACA GAC TAT GCA GAT GGG AGT GAA GAC AAA    672\nTrp Trp Gly Gly Ala Asp Thr Asp Tyr Ala Asp Gly Ser Glu Asp Lys\n    210                 215                 220\nGTA GTA GAA GTA GCA GAG GAG GAA GAA GTG GCT GAG GTG GAA GAA GAA    720\nVal Val Glu Val Ala Glu Glu Glu Glu Val Ala Glu Val Glu Glu Glu\n225                 230                 235                 240\nGAA GCC GAT GAT GAC GAG GAC GAT GAG GAT GGT GAT GAG GTA GAG GAA    768\nGlu Ala Asp Asp Asp Glu Asp Asp Glu Asp Gly Asp Glu Val Glu Glu\n                245                 250                 255\nGAG GCT GAG GAA CCC TAC GAA GAA GCC ACA GAG AGA ACC ACC AGC ATT    816\nGlu Ala Glu Glu Pro Tyr Glu Glu Ala Thr Glu Arg Thr Thr Ser Ile\n            260                 265                 270\nGCC ACC ACC ACC ACC ACC ACC ACA GAG TCT GTG GAA GAG GTG GTT CGA    864\nAla Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Glu Ser Val Glu Glu Val Val Arg\n        275                 280                 285\nGTT CCT ACA ACA GCA GCC AGT ACC CCT GAT GCC GTT GAC AAG TAT CTC    912\nVal Pro Thr Thr Ala Ala Ser Thr Pro Asp Ala Val Asp Lys Tyr Leu\n    290                 295                 300\nGAG ACA CCT GGG GAT GAG AAT GAA CAT GCC CAT TTC CAG AAA GCC AAA    960\nGlu Thr Pro Gly Asp Glu Asn Glu His Ala His Phe Gln Lys Ala Lys\n305                 310                 315                 320\nGAG AGG CTT GAG GCC AAG CAC CGA GAG AGA ATG TCC CAG GTC ATG AGA   1008\nGlu Arg Leu Glu Ala Lys His Arg Glu Arg Met Ser Gln Val Met Arg\n                325                 330                 335\nGAA TGG GAA GAG GCA GAA CGT CAA GCA AAG AAC TTG CCT AAA GCT GAT   1056\nGlu Trp Glu Glu Ala Glu Arg Gln Ala Lys Asn Leu Pro Lys Ala Asp\n            340                 345                 350\nAAG AAG GCA GTT ATC CAG CAT TTC CAG GAG AAA GTG GAA TCT TTG GAA   1104\nLys Lys Ala Val Ile Gln His Phe Gln Glu Lys Val Glu Ser Leu Glu\n        355                 360                 365\nCAG GAA GCA GCC AAC GAG AGA CAG CAG CTG GTG GAG ACA CAC ATG GCC   1152\nGln Glu Ala Ala Asn Glu Arg Gln Gln Leu Val Glu Thr His Met Ala\n    370                 375                 380\nAGA GTG GAA GCC ATG CTC AAT GAC CGC CGC CGC CTG GCC CTG GAG AAC    1200\nArg Val Glu Ala Met Leu Asn Asp Arg Arg Arg Leu Ala Leu Glu Asn\n385                 390                 395                 400\nTAC ATC ACC GCT CTG CAG GCT GTT CCT CCT CGG CCT CGT CAC GTG TTC    1248\nTyr Ile Thr Ala Leu Gln Ala Val Pro Pro Arg Pro Arg His Val Phe\n                405                 410                 415\nAAT ATG CTA AAG AAG TAT GTC CGC GCA GAA CAG AAG GAC AGA CAG CAC    1296\nAsn Met Leu Lys Lys Tyr Val Arg Ala Glu Gln Lys Asp Arg Gln His\n            420                 425                 430\nACC CTA AAG CAT TTC GAG CAT GTG CGC ATG GTG GAT CCC AAG AAA GCC    1344\nThr Leu Lys His Phe Glu His Val Arg Met Val Asp Pro Lys Lys Ala\n        435                 440                 445\nGCT CAG ATC CGG TCC CAG GTT ATG ACA CAC CTC CGT GTG ATT TAT GAG    1392\nAla Gln Ile Arg Ser Gln Val Met Thr His Leu Arg Val Ile Tyr Glu\n    450                 455                 460\nCGC ATG AAT CAG TCT CTC TC CCTG CTC TAC AAC GTG CCT GCA GTG GCC    1440\nArg Met Asn Gln Ser Leu Ser Leu Leu Tyr Asn Val Pro Ala Val Ala\n465                 470                 475                 480\nGAG GAG ATT CAG GAT GAA GTT GAT GAG CTG CTT CAG AAA GAG CAA AAC    1488\nGlu Glu Ile Gln Asp Glu Val Asp Glu Leu Leu Gln Lys Glu Gln Asn\n                485                 490                 495\nTAT TCA GAT GAC GTC TTG GCC AAC ATG ATT AGT GAA CCA AGG ATC AGT    1536\nTyr Ser Asp Asp Val Leu Ala Asn Met Ile Ser Glu Pro Arg Ile Ser\n            500                 505                 510\nTAC GGA AAC GAT GCT CTC ATG CCA TCT TTG ACC GAA ACG AAA ACC ACC    1584\nTyr Gly Asn Asp Ala Leu Met Pro Ser Leu Thr Glu Thr Lys Thr Thr\n        515                 520                 525\nGTG GAG CTC CTT CCC GTG AAT GGA GAG TTC AGC CTG GAC GAT CTC CAG    1632\nVal Glu Leu Leu Pro Val Asn Gly Glu Phe Ser Leu Asp Asp Leu Gln\n    530                 535                 540\nCCG TGG CAT TCT TTT GGG GCT GAC TCT GTG CCA GCC AAC ACA GAA AAC    1680\nPro Trp His Ser Phe Gly Ala Asp Ser Val Pro Ala Asn Thr Glu Asn\n545                 550                 555                 560\nGAA GTT GAG CCT GTT GAT GCC CGC CCT GCT GCC GAC CGA GGA CTG ACC    1728\nGlu Val Glu Pro Val Asp Ala Arg Pro Ala Ala Asp Arg Gly Leu Thr\n                565                 570                 575\nACT CGA CCA GGT TCT GGG TTG ACA AAT ATC AAG ACG GAG GAG ATC TCT    1776\nThr Arg Pro Gly Ser Gly Leu Thr Asn Ile Lys Thr Glu Glu Ile Ser\n            580                 585                 590\nGAA GTG AAG ATG GAT GCA GAA TTC CGA CAT GAC TCA GGA TAT GAA GTT    1824\nGlu Val Lys Met Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val\n        595                 600                 605\nCAT CAT CAA AAA TTG GTG TTC TTT GCA GAA GAT GTG GGT TCA AAC AAA    1872\nHis His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys\n    610                 615                 620\nGGT GCA ATC ATT GGA CTC ATG GTG GGC GGT GTT GTC ATA GCG ACA GTG    1920\nGly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val\n625                 630                 635                 640\nATC GTC ATC ACC TTG GTG ATG CTG AAG AAG AAA CAG TAC ACA TCC ATT    1968\nIle Val Ile Thr Leu Val Met Leu Lys Lys Lys Gln Tyr Thr Ser Ile\n                645                 650                 655\nCAT CAT GGT GTG GTG GAG GTT GAC GCC GCT GTC ACC CCA GAG GAG CGC    2016\nHis His Gly Val Val Glu Val Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg\n            660                 665                 670\nCAC CTG TCC AAG ATG CAG CAG AAC GGC TAC GAA AAT CCA ACC TAC AAG    2064\nHis Leu Ser Lys Met Gln Gln Asn Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys\n        675                 680                 685\nTTC TTT GAG CAG ATG CAG AAC TAG                                    2088\nPhe Phe Glu Gln Met Gln Asn  ★\n    690                 695\n(2)SEQ ID NO：4的信息：oligo\n(i)序列特征：\n(A)长度：38碱基对\n(B)类型：核苷酸\n(C)链数：双链\n(D)构型：线性\n(ii)分子类型：cDNA\n(iii)假拟：否\n(iv)反义：否\n(ix)特性：\n(A)名称/关键词：-\n(B)位置：1..38\n(xi)SEQ ID NO：4的序列描述：\nCGGAATTCATCGATTCCACCATGCTCACATTCATGGCC              38\n(2)SEQ ID NO：5的信息：oligo\n(i)序列特征：\n(A)长度：43碱基对\n(B)类型：核苷酸\n(C)链数：双链\n(D)构型：线性\n(ii)分子类型：cDNA\n(iii)假拟：否\n(iv)反义：否\n(ix)特性：\n(A)名称/关键词：-\n(B)位置：1..43\n(xi)SEQ ID NO：5的序列描述：\nCCGCTCGAGTCATTGTCGACCATGCTTCGCTCCGTATTTGAGG                 43\n(2)SEQ ID NO：6的信息：oligo 8172\n(i)序列特征：\n(A)长度：27碱基对\n(B)类型：核苷酸\n(C)链数：双链\n(D)构型：线性\n(ii)分子类型：cDNA\n(iii)假拟：否\n(iv)反义：否\n(ix)特性：\n(A)名称/关键词：-\n(B)位置：1..27\n(xi)SEQ ID NO：6的序列描述：\nCAAAGATCTGATGCAGAATTCCGACAT                                 27\n(2)SEQ ID NO：7的信息：oligo 8181\n(i)序列特征：\n(A)长度：59碱基对\n(B)类型：核苷酸\n(C)链数：双链\n(D)构型：线性\n(ii)分子类型：cDNA\n(iii)假拟：否\n(iv)反义：否\n(ix)特性：\n(A)名称/关键词：-\n(B)位置：1..59\n(xi)SEQ ID NO：7的序列描述：\nCAAGCGGCCGCTCATCCCTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCTCCGTTCTGCATCTGCTC    59\n(2)SEQ ID NO：8的信息：oligo 8171\n(i)序列特征：\n(A)长度：27碱基对\n(B)类型：核苷酸\n(C)链数：双链\n(D)构型：线性\n(ii)分子类型：cDNA\n(iii)假拟：否\n(iv)反义：否\n(ix)特性：\n(A)名称/关键词：-\n(B)位置：1..27\n(xi)SEQ ID NO：8的序列描述：\nCAAAGATCTAAGAAACAGTACACATCC                                    27\n(2)SEQ ID NO：9的信息：oligo\n(i)序列特征：\n(A)长度：29碱基对\n(B)类型：核苷酸\n(C)链数：双链\n(D)构型：线性\n(ii)分子类型：cDNA\n(iii)假拟：否\n(iv)反义：否\n(ix)特性：\n(A)名称/关键词：-\n(B)位置：1..27\n(xi)SEQ ID NO：9的序列描述：\nccatcgatggctaCATCTTCACTTCAGAG                                      29\n(2)SEQ ID NO：10的信息：oligo\n(i)序列特征：\n(A)长度：31碱基对\n(B)类型：核苷酸\n(C)链数：双链\n(D)构型：线性\n(ii)分子类型：cDNA\n(iii)假拟：否\n(iv)反义：否\n(ix)特性：\n(A)名称/关键词：-\n(B)位置：1..31\n(xi)SEQ ID NO：10的序列描述：\nccatcgatggctaTTTTTGATGATGAACTTC                                    31\n(2)SEQ ID NO：11的信息：oligo\n(i)序列特征：\n(A)长度：17碱基对\n(B)类型：核苷酸\n(C)链数：双链\n(D)构型：线性\n(ii)分子类型：cDNA\n(iii)假拟：否\n(iv)反义：否\n(ix)特性：\n(A)名称/关键词：-\n(B)位置：1..17\n(xi)SEQ ID NO：11的序列描述：\nCCGTGGAGCTCCTCCCG                         17