一种生物学控制方法

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技术领域\n本发明涉及一种生物学控制方法，这种方法使用螺旋藻 (Spirulina)粉末作为控制剂或抑制剂来控制和抑制真菌感染或传 染。本发明进一步涉及生物和动物的生物学控制方法，更具体地说， 就是使用经过处理的螺旋藻粉末作为控制剂或抑制剂来抑制害虫及其 相关疾病的生物学控制方法。\n背景技术\n依据国际食品和药物标准，螺旋藻作为一种蛋白来源被批准用于 人类和动物的食用.螺旋藻还含有多种类胡萝卜素、维生素和矿物质 (Hayashi & Hayashi，“Calcium Spirulan，来源于蓝绿藻中的盘状 螺旋藻，是一种阻碍有被膜病毒复制的抑制剂”。J.Nat Prod.(1996) 59，p.83)。\n正如从上述文章和美国专利No.5585354(Hayashi等)所见到的， 螺旋藻还具有抗病毒能力。经过热水处理的螺旋藻提取物已被公开， 其中的一种多糖钙已被提纯。纯化的提取物治疗病毒性疾病有效。\n美国专利No.4845085(sesin)揭示了一种来源于Nostoc Sp.的 半合成混合物具有抗真菌能力。然而这种混合物至多只显示出抗丝状 真菌的能力。来源于螺旋藻类的次级代谢产物还被用作防污浊剂(DE 19646324(摘要))。\n此外，据报导螺旋藻还具有以下一些生物学活性，如降低血糖(糖 尿病)；降低血胆固醇和其它一些作用(Hayashi等)。螺旋藻其它的 生物学活性已经被公开，例如Amirani的文章(化学文摘91： 169142n)；美国专利No 4886756(Kawamura)公开了来源于螺旋 藻的一种限制性内切酶；J 6303391(摘要)公开了一种方法，这种方 法利用螺旋藻制备具有生理活性的物质。\n现在已知，可以应用某种制剂来阻碍竞争性生物(害虫或污染物) 的生长和建立，或者促进伴生生物的生长。\n然而，现在还没有控制和抑制竞争性生物的生物学控制方法，由 此可以通过外源因素在不改变螺旋藻基因型的情况下，维持螺旋藻和 伴生生物之间的共生关系。\n本发明人没有看到任何报导说螺旋藻是特异性的抗真菌剂(或杀 真菌剂)，也没有看到任何报导说螺旋藻可以作为农业和园艺中害虫 的生物控制剂。\n本发明的目的是使用经过处理的螺旋藻混合物来填补此项空白。 本发明的进一步目的是提供改进的生物学控制方法，由此可以通过不 使用可见光来调控螺旋藻的活力。\n发明概述\n本发明提供了一种生物学控制方法，这种方法与伴生生物(一种 与抗真菌剂存在共生关系的伙伴)协同控制和抑制真菌污染的生长和 影响，此方法中抗真菌剂是经过处理的螺旋藻混合物，该方法包括以 下步骤：\n经过处理的螺旋藻混合物的制备；把所述混合物应用到以下被选 择的作用部位或其附近：园艺产品、蘑菇菌种、农业产品及其组合， 其中所述制备方法包括以下步骤：干燥的螺旋藻再次水化，给予培养 物以应激刺激；并通过冷冻干燥将螺旋藻制成粉末。\n优选地，本方法进一步包括了控制螺旋藻混合物活力的方法，此 方法使用可见光，其中螺旋藻混合物被制成液体培养物喷雾剂来应 用。\n更具优势的是，本混合物叶绿素绿颜色的深浅可以作为专利药制 备物保存期长短的一种指标。\n本发明还提供了一种抑制或驱除害虫的生物学控制方法，其中使 用的杀虫剂是经过处理的螺旋藻混合物，此方法包括以下步骤：\n经过处理的螺旋藻混合物的制备；把本混合物应用到以下被选择 的作用部位或其附近，这些作用部位包括：欲被抑制，驱除或控制的 含有害虫的液体；害虫出没地的食饵存放处或其附近；已知的害虫飞 行路径上；其中所述制备方法包括以下步骤：干燥的螺旋藻再次水化， 给予培养物以应激刺激，通过冷冻干燥将螺旋藻制成粉末。\n甲壳虫和昆虫是优选的害虫，更具体地说，在农业、园艺和医药 领域中昆虫被认为是害虫。也优选诱饵存放处包含害虫诱惑剂。\n实施本发明的最佳方案\n单就实例而言，本发明的优选实施方案将参考一系列实例进行详 述，它们仅为例证。\n在进行优选实施方案的描述中，真菌污染、伴生生物和制剂的含 义如下：\n真菌污染-分别产生分生孢子(conidia)或子囊(asci)的半知 菌(Deutermycota)和子囊菌(Ascomycota)。\n伴生生物-与螺旋藻有共生关系的伙伴。\n制剂-蓝细菌中螺旋藻属细胞的存活培养物，具有光合作用和固 氮代谢活性。\n使用以下进行实验：\n真菌感染：由座菌科(Hypocreaceae)-绿色木霉(Trichoderma Viride Canterbury/CTV 1)。\n真菌感染由新西兰，Canterbury大学动物部提供。\n伴生生物-担子菌(Basidiomycota)\n肺形侧耳(pleurotus Pulmonaries Canterbury CPP 1)的一种或是 香菇(Lentinula edodes)Western Biologicals，C10、C13、C40 (Shiitake mushroom)\n伴生生物用标准组织培养技术进行培养(Staments P，Growing Gourmet & Medicinal Mushrooms，Ten Speed Press，1995)，由新西 兰，Canterbury大学动物部提供。\n制剂：盘状螺旋藻(Spirulina platensis)，(Earthrise Farms， Mass Culture Facilitico，California)。\n混合物制备：干燥的盘状螺旋藻在0.84w/v碳酸氢钠溶液(pH 8.5)中再次水化约12小时，最好在光照下进行(8～80Watts/m2)。\n任选地，再次水化的溶液可含有0.04～0.25w/v的硫化钠以便抑 制细菌生长。\n可以用减少营养供应或部分干燥的应激刺激使培养菌种进入静止 期。\n该混合物经冷冻干燥可制备出不含其它存活生物的粉末。或者使 用商品化供应的干燥的盘状螺旋藻(Earthrise Farms)\n实验\n实例1-伴生生物感染\n肺形侧耳的组织标本在25℃环境下的PDA皿中进行培养。当生 成的菌苔占据培养基表面2/3左右时，用2.5％的绿色木霉浸湿的菌丝 和孢子悬液对每个培养基进行划线接种，在25℃环境下孵育5～7天 以便建立产生孢子的真菌污染物。真菌污染是否产生孢子可依据分生 孢子的特征性绿颜色来判断。被绿色木霉感染的培养基分成对照组和 实验组。\n用制剂处理：实验组培养皿分别用(0.1％、1％、5％w/v) 的盘状螺旋藻混合物喷洒在表面。\n整个培养皿进行比较\n实验组和对照组中微生物群体的组成每天都进行质量监控。2～ 5天内绿色木霉完全覆盖了对照组培养基的表面，而实验组培养基表面 大量的绿色木霉感染却在减少，实验组培养基含有各种浓度(0.1％、 1％、5％w/v)的盘状螺旋藻。\n在喷洒螺旋藻混合物后约24小时，污染的分生孢子由绿色变为褐 绿色。4天内，污染的分生孢子表现为绿色球形团块，而肺形侧耳的 白色菌丝快速侵入这些绿色物质。进一步孵育48小时，培养基表面看 不到污染的迹象，并且担子菌，肺形侧耳完全恢复而在实验组各培养 皿上形成连续的菌苔。\n光学和扫描电镜\n绿色木霉污染的肺形侧耳培养物经螺旋藻处理前后进行形态学比 较，处理前，绿色木霉分生孢子梗的分支形态明显地是瓶梗样分支结 构，这种结构终止于分支孢子的分支。经过制剂处理后一天，分生孢 子出现球形结构，其表面基本没有或只有一点装饰结构 (ornamentation)。处理后五天，菌丝和分生孢子结构触合成一团不 规则形的原生质样的物质，这些物质并无细胞壁包被，还可观察到肺 形侧耳菌丝侵入这些物质。由此可得出结论，即真菌污染是通过伴生 生物来进行腐生性代谢的。\n使用担子菌香菇重复上述实验步骤，仍然得出上述相同的结果。\n实例2-真菌污染的处理\n25℃环境下，将2.5％绿色木霉浸润的菌丝和孢子悬液划线接种 于PDA培养皿中并孵育5～7天。当孢子形成时，用1％w/v的螺旋 藻粉末喷洒到每一个培养皿上，喷洒面积为培养基表面的100％或50 ％。\n接受制剂100％面积喷洒的培养基在制剂喷洒三天内就变成黑 色。绿色木霉的分生孢子梗和分生孢子干燥化，未见到孢子形成和真 菌污染的再生长。\n接受制剂50％面积喷洒的培养基；在喷洒区和未喷洒区之间出现 间断的界限差别。喷洒区的培养基变成深褐色或黑色，这和接受100 ％面积喷洒的培养基一样，然而大约五天之后，界限渐渐消失，螺旋 藻制剂可移行到未喷洒区而攻击先前未受损的污染菌丝。以上的观察 显示，本制剂和其它蓝细菌一样，具有游走能力。蓝细菌的游走速度 估计约有每天2.5毫米。\n实例3-共同培养实验\nA.用制剂预处理\n将5克盘状螺旋藻粉末与商品化的蘑菇菌种体(肺形侧耳和香菇 (L.edodes))混合。这种螺旋藻制剂/伴生生物的混合物，使用已知 的方法(袋装培养)，在含有Pinus radiata培养基的3公斤塑料袋中培 养。培养菌种首次大批成熟(产生成熟菌体或蘑菇)的时间，成熟菌 体的形态和口味都与对照组相比进行了评价。\n经过处理的蘑菇菌种，其生长速度提高了17％(即首次大批成熟 为15天，而对照组为18天)，产量也比对照组高出10％。经过处理 的成熟菌体，其形态或口味与对照组的菌体相比没有变化。\n从经过处理的蘑菇菌种产量提高的百分率和首次大批成熟期缩短 三天的分析来推断，蓝细菌与伴生的担子菌具有协同作用。发明者认 为蓝细菌可降解非担子菌细胞壁壳多糖的组分，然而这一推测的机理 还有待于证实。进一步实验表明，蓝细菌的渗出物显示了促进成熟菌 体产量的作用。\nB.不用可见光对实验的影响\n用于食用担子菌培养的商品化培养袋是在适宜的环境下按以下步 骤进行的：担子菌菌丝生长成为菌体支持系统，其中菌丝与培养基的 接合构成了持续稳固的生长团块，以至于聚乙烯塑料生产袋可以被移 走。生长团块表面的菌丝外被层逐渐老化而呈现出深褐色可观察到的 垫状物，这一垫状物被称作“树皮”(barking)，成熟菌体是由活跃 的菌丝在老化的菌丝外被层下大量成熟起来的。\n按先前描述的方法，20个3公斤的肺形侧耳生长团块2.5％w/v 绿色木霉浸湿的菌丝和孢子悬液进行喷洒接种，并在25℃有光照的培 养室内孵育至出现有孢子形成的真菌污染物。将真菌污染的生长团块 分为实验组和对照组，每组各五个。实验组用1％w/v的制剂进行表 面喷洒。\n对照组和实验组都进一步孵育大约3天，直到肉眼看不到孢子形 成和污染物绿色木霉外周菌丝的生长。然后，第一对实验组和对照组 被移至漆黑的25℃培养室中，其余四对继续在光照环境中孵育。每天 监测各组微生物的相对数量。\n对照组中无论是有光照组还是无光照组的生长团块在培养基周边 都无特征性“树皮”样老化的菌丝外被层形成。绿色木霉孢子中绿色 的分布和深浅程度显示，第一个对照组被移到漆黑的培养室后2～3 天内绿色木霉污染已经占据主导地位或超过担子菌的生长。对培养基 的检查没有发现活跃代谢的肺形侧耳菌丝。对照组的培养基因担子菌 菌丝腐败而失去了生长团块的稳固性。\n实验组中无论是有光照组还是无光照组的生长团块都显示绿色木 霉污染明显减少。在被处理后4～5天内，绿色木霉停止形成孢子。 然而，无光照环境下孵育的实验组从培养基中清除绿色木霉污染的速 度较慢(与有光照实验组相比，时间大约滞后2～4天)。生长团块 可见特征性的叶绿素样绿颜色，并生长出成熟菌体。\n无光照的优势在于，当螺旋藻的生长因为光合作用的中止而被抑 制时，螺旋藻降解绿色木霉细胞壁的能力提高了。伴生生物担子菌从 中有两方面益处，因为对于担子菌的营养来源来说，来自绿色木霉和 蓝细菌的竞争受到限制，另外可能是受损的绿色木霉菌丝和蓝细菌在 光合作用及固氮作用中产生的渗出物为担子菌提供了氮素来源。\n发明者进一步发现调节培养室的光照强度可以影响螺旋藻和同伴 担子菌的活力。完全无光照则完全失掉了螺旋藻的光合作用。螺旋藻 是具有光合作用和固氮作用的自营性生物，来自活性细胞的渗出物可 给伴生生物提供有机氮和其它丰富的有机营养物。\n实例4-绿色木霉污染的原位处理\n担子菌成熟菌体和木质纤维素的绿色木霉感染\n商品化培养的担子菌易于形成点状真菌感染，这些真菌可以感染 含木质纤维素的培养基和蘑菇。对于诸如绿色木霉类的真菌感染，培 养室为真菌感染的播散和生长各自提供了良好的含氧和潮湿环境。\n发明者向真菌感染的成熟菌体喷洒1％w/v的螺旋藻悬液而有效 地控制了真菌的点状感染。向真菌感染的同伴担子菌喷洒相同的悬 液，当担子菌处于活跃状态时，产生快速的反应。在以上处理之前2～ 3天给担子菌浇水即可使其活跃。进一步发现，撒到培养基上的螺旋藻 粉末可以限制和治疗轻微的真菌感染。\n实例5-控制蚊子的原位处理\n在含有蚊子幼虫的一个10平方米左右的池塘中进行了三次实验， 每次都是将15克的螺旋藻粉末(或者是上述实例中的干燥乳膏)撒到 水面上。1～5天内所有的蚊子幼虫都死亡。\n蚊子幼虫死亡的机制还不清楚，蚊子幼虫食用了螺旋藻是明确 的。据推测是外壳多糖酶消化了衬附在幼虫中、后肠腔的外周营养膜， 这样就使得蚊子幼虫易被感染而死亡。\n实例6-苍蝇和黄蜂的实验处理\n将25％w/v的螺旋藻干燥乳膏放在商品化的油腻基座上(作为诱 饵)并暴露于有苍蝇和黄蜂存在的自然环境中而进行了十次实验。在 诱饵的附近可发现死亡的苍蝇和黄蜂。\n虽然机理还不清楚，但苍蝇和黄蜂的死亡原因和实例5中推测的 原理是相似的。\n尽管在本实验中未使用其它诱饵，可以认为其它诱饵也可以加到 螺旋藻乳膏中而不降低其作用。\n虽然本发明以有关蘑菇培养的生物学控制作为优选的实施方案进 行了叙述，但还可以认为本发明可用于防止和治疗其它果品和蔬菜类 农产品的感染。