种子散失

1.一种荚果开裂带选择性启动子，其包含SEQ ID No13中核苷酸位点251-2325的核苷酸序列。
2.权利要求1的荚果开裂带选择性启动子，其包含SEQ ID No13中核苷酸位点251-2328的核苷酸序列。
3.权利要求1或2的荚果开裂带选择性启动子，含有SEQ IDNo13中核苷酸位点1-2328的核苷酸序列。
4.权利要求1-3任一项的荚果开裂带选择性启动子，含有另一植物表达性基因的5′非翻译前导序列。
5.一种荚果开裂带选择性嵌合基因，包含(a)荚果开裂带选择性启动子，包含SEQ ID No13中核苷酸位点251-2325的核苷酸序列；和(b)在自然环境下与所述荚果开裂带选择性启动子不相关的转录DNA区。
6.权利要求5的嵌合基因，其中所述荚果开裂带选择性启动子包含SEQ ID No13中核苷酸位点251-2328的核苷酸序列。
7.权利要求5或6的嵌合基因，其中所述荚果开裂带选择性启动子含有SEQ ID No13中核苷酸位点1-2328的核苷酸序列。
8.权利要求5-7任一项的嵌合基因，其含有另一植物表达性基因的5′非翻译前导序列。
9.权利要求5-8中任一项的嵌合基因，其中所述转录DNA区编码蛋白质或多肽，当所述蛋白质或多肽在荚果开裂带细胞中产生时，杀死细胞或使细胞不稳定，或者干扰细胞的正常代谢、生理或发育，所述蛋白质或多肽选自：(a)核糖核酸酶，例如芽孢杆菌RNA酶；(b)细胞毒素，例如白喉毒素的A片段；(c)蛋白质，当其在荚果开裂带细胞中产生时，增加了所述细胞中生长素或生长素类似物的水平，例如色氨酸单加氧酶、吲哚-3-乙酰胺水解酶、酰胺水解酶，或者增加了所述细胞对生长素或生长素类似物例如rolB基因产物的敏感性；(d)蛋白质，当其在荚果开裂带细胞中产生时，降低了所述细胞对乙烯的敏感性，例如对乙烯不敏感的突变ETR 1蛋白，优选ETR1-1蛋白。
10.权利要求9的嵌合基因，其中所述荚果开裂带细胞是来自蔓菁属植物荚果开裂带的细胞。
11.含有以下可操作连接的DNA片段的荚果开裂带选择性嵌合基因：a)转录DNA区，编码选择性表达于所述荚果开裂带细胞中并能够抑制或减少编码多聚半乳糖醛酸酶的植物内源基因的表达的反义RNA，所述多聚半乳糖醛酸酶包含由SEQ ID No1中核苷酸位点95-1395的核苷酸序列编码的蛋白质的氨基酸序列，和b)植物表达性启动子，它能够至少在所述荚果开裂带细胞中指导所述转录DNA区的表达，所述植物表达性启动子是含有SEQ IDNO 13中核苷酸位点251-2325的核苷酸序列的荚果开裂带选择性启动子。
12.权利要求11的嵌合基因，其中所述内源植物基因编码一种mRNA，这里所述mRNA的cDNA含有SEQ ID No1的核苷酸序列。
13.权利要求11或12的嵌合基因，其中所述反义RNA包含至少50个核苷酸的连续片段。
14.权利要求11-13中任一项的嵌合基因，其中所述反义RNA包含至少100个核苷酸的连续片段。
15.权利要求11-14中任一项的嵌合基因，其中所述反义RNA包含至少1000个核苷酸的连续片段。
16.权利要求11-15中任一项的嵌合基因，其中所述荚果开裂带细胞是来自蔓菁属植物荚果开裂带的细胞。
17.荚果开裂特性被改变的植物的生产方法，包括以下步骤：I)用权利要求9或11的荚果开裂带选择性嵌合基因转化植物细胞的核基因组；及II)从所述转化细胞中再生出转化植物。
18.在荚果开裂带细胞中选择性表达嵌合基因的方法，包括以下步骤：I)用权利要求5的荚果开裂带选择性嵌合基因转化植物细胞的核基因组；及II)从所述转化细胞中再生出转化植物。

种子散失\n引言本发明涉及DNA序列，包括编码开裂带选择性蛋白，特别是诸如多聚半乳糖醛酚酶类的细胞壁水解酶的核酸片段，相应植物基因的调节区和它们调整植物开裂特性，更特别是蔓菁荚果开裂特性的应用。\n发明背景由于成熟浆果或荚果的种子脱落，也称作荚果开裂或荚果破裂，和下一作物年中自生长的同时增加所导致的产量损失，是培育干裂果的农作物的普遍性难题。这些不利特性尤其起作用的重要经济农作物是油菜(oilseed rape)：在不利天气条件下超过50％的潜在产量会损失掉。\n干裂果，也称荚果，发育自单心皮(如许多蝶形花科的荚果)，或发育自多心皮(发许多芸苔料的长角果)。就长角果来说，荚果由边缘相连的两心皮组成。边缘间缝形成厚脉，称作胎座椎。荚果成熟期来临时，两瓣膜由胎座椎逐渐分离，最终导致附着于胎座椎的种子散失。\n超微结构检测显示，荚果破裂与荚果瓣膜分离位点(即缝线)的细胞壁物质精确降解相联系。先于破裂的细胞壁降解和细胞粘合力的丧失对于细胞壁中间片层的增溶作用显著。该中间片层被发现介于初生细胞壁之间，是将单个细胞联系在一起形成组织的一种粘质。细胞分离之前有一乙烯高峰，后者在时间上相关于水解酶纤维素酶(β-1，4-葡聚糖酶)活性的组织特异性增加并且这特别发生于沿着被称作开裂带的缝线的一层细胞上。相反地，细胞壁降解酶多聚半乳糖醛酸酶表现为与荚果开裂既无时间也无空间上的相关性〔Meakin和Roberts(1990)，实验植物学杂志(J.Exp.Bot.)41：1003〕。发育早期的荚果开裂是受荚果蚋芸苔荚瘿蚊(Dasinera brassicae)侵染的特征。曾在侵染处观察到多聚半乳糖醛酸酶和纤维素酶活性都增强。然而，对蚋诱导与成熟相关的开裂的调节已发现是不同的〔Meakin和Roberts(1991)，植物学年鉴Annals of Botany 67：193〕。\n乍一看，荚果开裂过程享有许多脱落的特征，即植物的器官如叶、花和果会脱落。已经观察到乙烯能诱导或促进脱落，而生长素阻抑或延迟脱落。脱落决定性步骤是在一层被称作脱落带的细胞层中细胞壁水解酶类的高度协同表达、合成和分泌。纤维素酶(β-1，4-葡聚糖酶)构成这种细胞壁水解酶的一类。已经证实在大量组织中存在着纤维素酶活性，这些组织包括叶脱落带、浆果脱落带、成熟浆果、衰老子叶、花柱和花药〔Kemmerer和Tucker(1994)，植物生理学(Plant Physiol.)104：557及其参考文献〕。另一类主要涉及浆果脱落的水解酶类是多聚半乳糖醛酸酶，其突出的异构形式(isoforms)已经证实〔Bonghi等(1992)，植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)20：839；Taylor等(1990)植物(Planta)183：133〕。\nKadkol等〔(1986)，Aust.J.Biol.34：79〕在一份简单的有关油菜的澳洲资料中，报告了开裂抗性的提高。经辐射处理种子萌发出的油菜突变体中曾进一步观察到荚果成熟的变异〔Luczkiewicz(1987)，Proc.7thInt.Rapeseed Congress 2：463〕。然而可以认为，传统繁殖方法未能成功地向油菜栽培种内导入开裂抗性而不会干扰其它被期望具备的品质，诸如提前开花、成熟及气肿性炭疽病抗性等〔Prakash和Chopra(1990，Genetical Research 56：1〕。\n尽管其经济影响很大，但对油类种子荚果开裂过程中发生的基因表达的分子事件和变化知之甚少。日前，已描述了两种荚果特异性mRNA，其表达与荚果发育具有时间上和空间上的相关性。然而，其编码蛋白的功能未知。〔Coupe等(1993)，植物分子生物学23：1223；Coupe等(1994)，植物分子生物学24：223〕。PCT公开号WO 94/23043概括性地描述了一种调节植物脱落和开裂的方法。\n相应地，提供植物开裂带选择性基因是本发明的目的。\n如同本发明概述、优选实施方案及权利要求书中的陈述所证明的那样，本发明获得了这些及其它目标。\n本发明提供了植物开裂带(DZ)选择性基因，从这些基因编码的mRNA得到的cDNA，和所述基因的启动子。本发明特别提供了SEQ IDNO 1的cDNA和编码某一mRNA的基因的启动子，其中该mRNA的cDNA基本具有SEQ ID NO 1的真实核苷酸序列。更特别地，在优选实施方案中，本发明涉及到包含在SEQ ID NO 13起始于第一位并止于第2328位的5′调控区之内的启动子。\n另一方面，本发明也提供了DZ选择性嵌合基因，用于植物转化，当与不带有DZ选择性嵌合基因的植物相比时，由于转基因植物中DZ选择性嵌合基因的表达，可以获得植物开裂性被改变尤其荚果开裂特性被改变的转基因植物。\n而在另一方面，本发明还提供了至少带有一个整合到植物细胞基因组中的DZ选择性嵌合基因的植物，这里所述DZ选择性嵌合基因包括下列可操作连接的DNA片段：a)转录DNA区，编码：1)RNA，当产生于植物体特别DZ的细胞中时，它防止、抑制或减少所述细胞中植物内源基因的表达，优选内源DZ选择性基因，所述内源基因编码细胞壁水解酶，特别是内切多聚半乳糖醛酸酶(“endo-PG”)，或，2)蛋白质或多肽，当产生于DZ区细胞中时，它杀死或使这些细胞丧失功能或干扰它们正常代谢、生理或发育。\nb)植物表达性启动子，其指导转录DNA区至少在DZ细胞中表达，条件是如果转录DNA区编码蛋白质或多肽，或编码定向于某一有义RNA的反义RNA或核酶，该有义RNA由在植物体非DZ细胞中表达的内源植物基因所编码，该植物表达性启动子是DZ选择性启动子，即，指导DZ细胞中转录区的选择性表达。\n优选的转录DNA区编码当其产生时会对细胞有毒害的蛋白质或多肽，诸如芽胞杆菌RNA酶；一种增加其表达细胞内生长素或生长素类似物水平的蛋白质或多肽，诸如吲哚-3-乙酰胺水解酶和/或色氨酸单加氧酶；一种增加其表达细胞对生长素敏感性的蛋白质或多肽，诸如rolB基因产物；或一种降低其表达细胞对乙烯敏感性的蛋白质或多肽，诸如突变型ETR1-1蛋白或其它乙烯受体蛋白。\n本发明另一优选实施方案中，转录DNA区编码诸如反义RNA或核酶之类的RNA，它们可与DZ区天然表达基因，优选DZ选择性基因所编码的mRNA部分互补。\n这里所用术语“开裂”指的是一种过程，其中植物器官或结构，诸如花药或浆果，成熟时沿某一特定线或某一确定方向张开，导致的所述器官或结构的内含物脱落。某种程度上开裂过程使人联想到脱落过程，其中植物体一部分或其器官如叶、花或浆果从其它部分分离开来。\n这里所用术语“荚果”是指一种干的开裂果实，由一、两或多心皮组成。油类种子油菜的荚果为具两瓣膜的长角果，这里两瓣膜由纵向背腹面缝线所定形，其中包括开裂带。\n这里所用术语“荚果开裂”意指一个过程，其中果实尤其是荚果，沿着细胞分离层裂开，最终导致瓣膜分离，随后果实特别是荚果内含的种子就会脱落散失。荚果开裂发生于许多种发育干果实的植物中，如十字花科的大多数属。\n在最通常意义上术语“开裂带”(DZ)包括开裂过程中植物器官或结构沿着带线裂开的该带中的组织。宏观上DZ带可识别为出现于器官上的一条清晰缝线。严格意义上DZ带包括仅仅1-3个薄壁组织细胞宽的区域。荚果中，该区通常由致密层集细胞组成并附着于胚座框维管组织周围使之与膜瓣边缘相分离。对于本发明目的而言，DZ也包括围绕该区的细胞层。DZ从荚果小室一直延伸至表皮缝线。\n这里所用术语“启动子”概指任意可在转录起始阶段被DNA依赖性RNA聚合酶所识别并结合(直接或间接)的DNA。启动子包括转录起始位点，和转录起始因子和RNA聚合酶的结合位点，还可包括基因调控蛋白所能结合的许多其它位点(例如增强子区)。\n这里所用术语“植物表达性启动子”意指能在植物细胞中驱动转录的启动子。这包括任意植物起源启动子，但也能包括可在植物细胞中直接转录的非植物起源启动子，即诸如CaMV35S或T-DNA启动子之类的某些病毒或细菌启动子。\n术语“调节区”，用在这里，意指任何涉及驱动转录并控制(即调节)所给DNA序列(诸如编码蛋白质或多肽的DNA序列)的转录时间和转录水平的DNA。例如，5′调控区(或启动子区)是位于编码序列上游(即5′端)的DNA序列，它包括启动子和5′端非翻译的引导序列。3′调控区是位于编码序列下游(即3′端)的DNA序列，它包括适当的转录终止(和/或调控)信号，包括一或多个多聚腺苷酸信号。\n这里所用术语“细胞壁水解酶”意指涉于细胞壁材料降解，例如开裂过程中的酶。这类酶的举例包括，但不限于，多聚半乳糖醛酸酶，纤维素酶(β-1，4-葡聚糖酶)，β-半乳糖苷酸，水解细胞壁蛋白的蛋白酶，等等。\n术语“基因”意指包括由细胞中一段适当调控区(例如植物表达启动子)控制下可以转录出RNA分子(例如mRNA)的DNA区的任意DNA片段。因此基因可包括数个可操作地连接的DNA片段，例如启动子、5′端非翻译引导序列、编码区、和含有多聚腺苷酸位点的3′端非翻译区。内源植物基因是指天然存在于植物种内的基因。嵌合基因是指任何非正常存在于植物种内的基因，或者指任何其中启动子自然中并不同部分或全部所述转录DNA区相连或不与该基因至少另一调节区相连接的基因。\n术语“基因表达”是指一个过程，其中在调节区尤其是启动子控制下的DNA区，被转录成为一段具生物学活性的RNA，即或者能够与其它核酸相互作用或者能够被翻译成具生物学活性的多肽或蛋白。假如基因表达的终产物是具生物学活性的RNA，例如反义RNA或核酶时，该基因被称作编码一段RNA。假如基因表达的终产物是生物学活性蛋白质或多肽则该基因被称作编码蛋白质。\n基因表达的表型效果是指该基因编码的RNA或蛋白质产物在其产生的植物细胞(或植物体)中所具有的生化、生理和/或发育效果。基因表达的表型效果可以通过减少或阻抑其所编码RNA或蛋白质的产生，或通过干涉这类RNA或蛋白质的生物学活性来减弱或者阻抑。\n这里限定，在说明中无论何时说起“所述mRNA的cDNA包括SEQID NO X的核苷酸序列”，该RNA具有SEQ ID NO.X所出现的同样的核苷酸序列，除了(在RNA序列中)U残基(在DNA序列中)被T残基替代。\n根据本发明，DZ选择性cDNA和它们相对应的植物基因组DNA片段限定如下：1)cDNA文库由分离自DZ组织的mRNA起始构建，并对该cDNA文库进行差别筛选以便鉴别出当与其它植物组织相比较时选择性出现于特别的DZ组织中的mRNA，其它植物组织包括但不限于：荚果壁、种子、胚座框、叶片、茎、根、繁殖器官等等。或者，该cDNA库通过寡核苷酸筛选，该寡核苷酸是从已分离蛋白，例如已被确认选择性出现于DZ中的细胞壁水解酶的已确定氨基酸序列推导出来的。另外，利用巢式PCR(nested-PCR)方法里的同样寡核苷酸和利用所扩增片段作为探针来筛选文库也是可能的。可以用分离自DZ发育不同时期的mRNA池(pool)来构建DZ选择性cDNA文库；2)分离并鉴定编码DZ选择性mRNA或蛋白质的cDNA；3)该cDNA被用作探针来在植物基因组中确认和分离包含有编码DZ选择性mRNA或蛋白质的核苷酸序列的区域。或者，可以利用由该cDNA序列推导的寡核苷酸进行反向PCR来分离该基因组DNA；同时4)任选地，构建对应于该cDNA的RNA探针并用于不同植物组织，包括特别感兴趣的DZ组织的常规RNA-RNA原位杂交分析〔见DeBlock等(1993)，Anal.Biochem.215：86〕，来证实在该DZ中推测存在的DZ选择性内源植物基因所产生的mRNA的选择性出现。\n术语“开裂带选择性”，关系到相应于本发明的DNA的表达，意指，为应用目的，在一种特别的DZ(尤其是荚果DZ)或受限定的一系列DZ细胞中DNA的高度特异性(优选独有的)表达。\n因此DZ选择性基因是植物体某些特定开裂带细胞(尤其是在植物荚果开裂带细胞)中选择性表达的内源基因。任何拥有令人感兴趣的DZ的植物可用于DZ选择性基因的分离。适合分离DZ选择性基因的植物是十字花科家族植物，包括但不限于拟南芥(Arabidopsis thaliana)，油菜(Brassica campestris)，芥菜(B.juncea)，尤其是蔓菁(B.napus)；豆科家族植物包括但不限于大豆(Glycine max)，菜豆(Phaseolus vulgaris)等等。由这类基因转录而来的mRNA(或由此得到的cDNA)是DZ选择性mRNA。驱动和控制这类mRNA转录的启动子称作DZ选择性启动子。DZ选择性启动子例如可以在植物细胞中用来表达细胞毒素基因(如芽孢杆菌RNA酶基因)，而在非DZ细胞，优选非荚果DZ细胞中不会因为表达细胞毒素基因从而导致植物正常生长和发育、和农艺性状(如以种子产量为恒量尺度)受到负面影响。\n一旦获得DZ选择性基因(即编码DZ选择性mRNA的基因组DNA片段，从该mRNA可以制备出DZ选择性cDNA)，容有DZ选择性启动子的启动子区即被认作是该mRNA所编码蛋白第一位氨基酸密码子之前的上游区(即位于5′端区)。优选这类启动子区至少在起始密码子上游长约400至500bp，更优选至少约1000bp，尤其优选至少约1500至2000bp。为方便起见，优选这种启动子区从起始密码子延伸至上游不超过3000至5000bp。实际DZ选择性启动子是编码DZ选择性mRNA的基因区上游(即5′端)的基因组DNA区。通过常规原位组织化学技术〔DeBlock和Debrouwer(1992)，植物杂志，(The Plant Journal)2：261；De Block和Debrouwer(1993)，植物(Plant)189：218〕可以检测到含有DZ选择性启动子并可操作地连有gus基因编码区〔Jefferson等(1986)，美国科学院学报(P.N.A.S.USA)83：8447〕的嵌全基因在转基因植物中选择性地(在特定DZ的细胞中)产生出可检测的β-葡糖酸苷酶活性(由gus基因编码)。\n获得DZ选择性启动子的优选DZ选择性基因是那些编码可以制备出含有对应于寡核苷酸PG1(SEQ ID NO 2)第11至27位核苷酸序列，和/或寡核苷酸PG3(SEQ ID NO 4)第11至27位序列(即，始于第11并止于第27位)；和/或含有互补于寡核苷酸PG2(SEQ ID NO 3)第11至25位核苷酸的序列和/或寡核苷酸PG5(SEQ ID NO 5)第11至27位核苷酸之间序列的cDNA的DZ选择性mRNA的基因，优选蔓菁基因。优选该DZ选择性cDNA含有寡核苷酸PG1和PG3和PG2和PG5的上述序列，或编码一种由SEQ ID NO 1第95至1393位核苷酸区编码的蛋白质。\n特别优选的DZ选择性基因是编码可制备出含有SEQ ID NO 1至少第10至1600位核苷酸序列的cDNA的DZ选择性mRNA的蔓菁基因。另一优选的DZ选择性基因是编码可制备出含有SEQ ID NO 10序列的cDNA的DZ选择性mRNA的蔓菁基因。\n本发明优选启动子是含在相应于SEQ ID NO 1的cDNA的基因组克隆的5′调节区内的启动子，例如带有SEQ ID NO 13起始于第一位并止于第2328位的5′调节区。更优选的启动子区是由SEQ ID NO 13起始于单Sph1位点(第246-251位)和Hind II位点(第1836至1841)之间任一位点，特别位于Sph1位点和Bam HI位点(第1051至1056位)之间，并终止于第2328位核苷酸(刚好位于ATG翻译起始密码子之前)序列组成的DNA片段。这类启动子区包括本发明的DZ选择性启动子和5′端非翻译引导区，可用来构建DZ选择性嵌合基因。这方面更优选的启动子区是带有SEQ ID NO 13第251(Sph1位点)和2328位之间序列的DNA片段(由此至后被称作“PDZ”)。\n然而，本发明中可选用更小的DNA片段作为启动子区并且估计可以选用SEQ ID NO 13 DNA中翻译起始密码子上游至少约490碱基对，更优选至少661碱基对并最优选约1326碱基对的任意片段。本发明中用作启动子区的特别优选的较小片段具有由SEQ ID NO 13第1002和2328位之间核苷酸序列的DNA序列。\n估计SEQ ID NO 13的5′调节区的启动子的DZ特异性可以通过插入SEQ ID NO 13第1002至1674位核苷酸序列而得到相当的促进。因此，带有该核苷酸序列的启动子特别优选。\n或者，可以构建含有SEQ 1D NO 13 5′调节区启动子的决定该启动子DZ选择性的内源部分的人工启动子。这些人工启动子可含有其它能在植物表达的启动子的“核心启动子”或“TATA盒式区”，例如WO93/19188所述的CaMV35S的“TATA盒式区”。例如通过与报告基因(如gus基因)的适当融合并且检测报告基因在恰当组织中恰当发育期的表达，可以确认合适的启动子片段或人工启动子。已知这类含有SEQID NO 13 5′调节区的决定DZ选择性的内源部分的较小启动子和/或人工启动子可以提供DZ特异性细胞中转录的更好选择性和/或增强本发明的DZ选择性嵌合基因转录区的转录水平。\n除实际启动子外，本发明DZ选择性基因的5′调节区也包括编码位于转录起始位点和翻译起始位点之间的RNA的5′非翻译引导(5′UTL)序列的DNA片段。估计5′转录起始位点位于(SEQ ID NO13中)第2219和2227之间，导致5′UTL全长约为102至110个核苷酸。还估计该区能被另外的5′UTL。(例如其它植物表达基因的5′UTL)所替代，而基本上不会影响到启动子的特异性。\n本发明中其它有用的DZ选择性基因或cDNA是那些从其它来源，例如从蔓菁的其它载培种，或者甚至来自其它植物种，例如利用SEQ IDNO 1(或SEQ ID NO 10)cDNA作探针，根据核酸杂交应用方法(Nucleic Acid Hybridization；A Practical Approach(1985)，IRL PressLtd Uk(Eds.B.D.Hames和S.J.Higgins)所述标准方法在高度严紧型杂交条件下筛选而分离得到的那些。服务于本发明目标的有用基因因此可以是编码某一mRNA的特征性基因，由该mRNA制备的cDNA变体含有的编码区核苷酸序列实质上类似于SEQ ID NO 1的cDNA克隆编码区的核苷酸序列，并编码具多聚半乳糖醛酸酶活性的蛋白质。同样启动子区和启动子也可以例如使用这类实质上类似于带有SEQ ID NO 13中所含有序列的启动子区或启动子的cDNA变体来确认。\n关于核苷酸序列(DNA或RNA)，例如基因调节区或cDNA的序列，“实质上类似于”意指当两序列对齐比较时，序列完全相同的百分数即相同核苷酸位数除以两序列中较短序列核苷酸数所得数值高于80％，优选高于90％，尤其是对于调节区。两核苷酸序列的线性比较是用Wilbur和Lipmann算法〔Wilbur和Lipmann(1983)美国科学院学报80：726〕，选用窗口大小为20核苷酸，每字长4核苷酸，并且每4个核苷酸间有一空隔来完成的。\n两实质上类似的cDNA变体典型地编码彼此实质上类似的蛋白质。例如，SEQ ID NO 1的cDNA变体典型地编码蛋白质的氨基酸序列实质上类似于由SEQ ID NO 1的cDNA所编码蛋白质的氨基酸序列。关于“氨基酸序列”，实质上类似意指当两相关序列作线性比较时，序列的同一性百分数，即相同氨基酸残基位数除以两序列中较短序列残基数所得值高于80％，优选高于90％。两氨基酸序列线性比较是由Wilbur和Lipmann算法〔Wilbur和Lipmann(1983)，美国科学院学报80：726〕完成的，选用窗口大小为20氨基酸，每字长两个氨基酸，每4个氨基酸间有一隔离。序列数据包括上述的序列线性比较的计算机辅助分析和解释，可通过IntelligeneticsTM组合程序(Intelligenetics Inc.，CA)很方便地完成。\n根据本发明，DZ选择性cDNA和基因组DNA，以及由基因组DNA获得的调节区被用于调整植物的开裂特性，特别是蔓菁的荚果开裂带特性。\n因此，根据本发明，所提供的重组DNA至少包括含植物表达性启动子和转录DNA区的DZ选择性嵌合基因，该启动子和转录DNA区之一或二者都来自于本发明的DZ选择性基因。\n转基因植物中DZ选择性嵌合基因的表达只会对DZ区细胞产生表型影响。因此，DZ选择性基因的表达可以选择性地阻止、抑制、防止或减少某一特定开裂带(例如荚果DZ区)中内源植物基因的表达所产生的表型影响，可以选择性地杀死或使开裂带细胞丧失能力，或者可以干扰DZ区细胞正常代谢，导致开裂尤其是荚果开裂的延迟或受阻。为了本发明目的，如果植物细胞(如DZ细胞)的所有生化和/或生理进程被停止，或者该细胞的生化和/或生理进程发生改变，使得至少一种涉及植物细胞壁降解的酶类，特别是诸如多聚半乳糖醛酸酶的果胶降解酶类的细胞外产物有效减少，优选减少至少30％，特别至少75％，更特别优选至少90％，则该植物细胞就会被杀死或丧失能力。\n为本发明目的，植物细胞中某内源基因表达的表型效应在下述条件下被阻止、抑制、防止或减少，即减少细胞中表达该内源基因所产生的mRNA和/或蛋白质的量，优选至少减少30％，特别至少75％，更特别优选至少90％。\n其开裂不同程度地被延迟或甚至被阻止的植物体的产生方法是，用一种重组DNA转化植物，该重组DNA至少含有本发明一种DZ选择性嵌合基因，它在植物体内表达所产生的RNA或蛋白质会不同程度地干扰开裂带细胞的正常功能，比如通过减弱一或多个编码细胞壁水解酶内源基因的表型效应，或者杀死DZ区细胞。开裂尤其是荚果开裂的延迟，可以减少或阻止种子收获前的散失，这在那些受成熟前(即收获前)种子丢失所困扰的植物中具有应用价值。\n本发明优选实施方案中，DZ选择性嵌合基因包括一转录DNA区，它在DZ细胞中转录产生的RNA将减少、防止或阻止某内源基因，优选编码细胞壁水解酶基因，特别是DZ细胞的内切多聚半乳糖醛酸酶基因的表达。该内源基因表达减少可通过检测该内源基因正常产生mRNA的细胞质水平减少而显现。由植物体中分离的该内源基因从这之后被指定为有义基因，其编码有义mRNA(或有义mRNA前体，即可以带有内含子区的未成熟mRNA)。\n优选内源有义基因编码关系到细胞壁水解的酶类，优选果胶降解酶类，例如果胶酯酶，果胶甲基酯酸，果胶裂解酶，果胶酸裂解酶，多聚半乳糖醛酸酶等等，特别是内切多聚半乳糖醛酸酶(endo-PG)。据认为果胶降解酶类，特别是内切半乳糖醛酸酶类，在植物细胞壁中间层物质降解及开裂的过程中承担重要角色，并且在开裂带或开裂带周围区中选择性抑制这类酶的产生(即通过内切PG编码mRNA的对应反义RNA的表达)平均可以使荚果开裂至少延迟1天，优选2-5天。\n尽管有义基因可以编码任何在开裂过程中由DZ细胞产生并涉及参与特定开裂带细胞壁材料降解的细胞壁水解酶，例如纤维素酶，葡聚糖酶，或β-半乳糖苷酶，优选的有义基因是内源DZ选择性基因。\n因此本发明的一方面内容中，本发明的DZ选择性嵌合基因编码一种反义RNA，它可与有义mRNA或有义mRNA前体至少部分互补。这类反义RNA被认为定向于有义RNA(或有义mRNA前体)。据此，该编码反义RNA包括可与有义mRNA或有义mRNA前体部分互补的区域，优选连续伸展区至少长为50碱基，优选最少长度在100和1000碱基之间。可以选用的由植物细胞产生的与有义RNA互补的反义RNA区的长度上限当然是有义mRNA前体全长，或有义mRNA(其可能是也可能不是由有义mRNA前体加工而来)的全长。然而，反义RNA可与有义mRNA前体和/或经加工的有义mRNA序列的任何部分互补：它可以互补于接近有义mRNA前体5′端或帽子序列，部分或全部5′非翻译区，内含子或外显子区(或外显子与内含子之间的桥区)，非编码区与编码区之间的桥区，包括编码区3′末端在内的所有或部分编码区，和/或所有或部分3′非翻译区。如果有义基因是基因家族的成员，优选由本发明DZ选择性嵌合基因编码的反义RNA含有互补于有义RNA例如DZ选择性有义RNA至少有50个核苷酸长的序列，并且该序列具有于与任何该基因家族其它成员编码的任何有义RNA的任何50个核苷酸区相比较得出的序列同一性(见上述)百分数少于50％，优选少于30％。\n本发明DZ选择性基因的转录DNA区也可编码一种特异性RNA酶，或称作核酶(见例，WO 89/05852)，具有高度特异性切割有义mRNA或有义RNA前体的能力。这类核酶据称定向于有义RNA(或有义mRNA前体)。\n植物体产生有义mRNA的内源基因的表达也可由编码部分或全部(优选全部)这类有义RNA的DZ选择性嵌合基因所抑制或阻止〔Jorgensen等(1992)，AgBiotech News Info 4：265N〕。\n本发明DZ选择性嵌合基因编码的反义RNA或核酶所定向的有义RNA优选是一种mRNA，其中这种mRNA的(双链)cDNA含有SEQID NO 1(或SEQ ID NO 10)或其变体的核苷酸序列。对应于本发明DZ选择性嵌合基因所编码的反义mRNA或核酶所定向的有义RNA的cDNA区，优选包括SEQ ID NO 1核苷酸序列中起始于第890和950核苷酸位点之间任一点并终止于第1560和1620核苷酸位点间任一点的核苷酸序列，例如，但不限于，第952和1607核苷酸位点间的序列。相应于本发明DZ选择性嵌合基因所编码的反义RNA或核酶所定向有义RNA的另一优选cDNA区包括SEQ ID NO 1起始于第1280和1340核苷酸间任一位点并终止于第1560和1620核苷酸间任一位点的核苷酸序列，例如，但不限于，第1296和1607核苷酸位点间的核苷酸序列。\n如上所述，编码反义RNA或核酶的DZ选择性嵌合基因，优选受DZ选择性启动子控制。特别有用的DZ选择性启动子是来自于上述DZ选择性基因，特别是SEQ ID NO 13第1至2328位之间的5′调节区内所含的启动子。然而，如果DZ选择性基因编码一种反义RNA和/或核酶，该反义RNA和/或核酶定向于内源性DZ选择性基因(优选编码内源性多聚半乳糖醛酸酶基因)的有义RNA，则并不需要DZ选择性嵌合基因的启动子一定是DZ选择性启动子。不过，这类情况中该DZ选择性基因应至少定向表达于DZ区细胞。事实上，由于有义RNA为选择性产生于DZ区细胞，在非DZ区细胞中DZ选择性基因编码的反义RNA或核酶产物，在这类细胞中将不会产生引人注意的表型效应。指导至少在DZ细胞中表达的启动子实例是植物组成型表达启动子，例如烟草花叶病毒(CaMV)35S转录区启动子(P35S)〔Guilley等(1982)，细胞30：763〕，或根癌农杆菌胭脂氨酸合成酶启动子(Pnos)〔Depicker等(1982)，J.Mol.Appl.Genet.1：561〕。\n本发明另一优选实施方案中，DZ选择性嵌合基因编码某种mRNA，其产生于植物细胞时，可以翻译成为干扰植物细胞代谢和/或生理的蛋白质或多肽。大多数情况下这类蛋白质或多肽产物在非DZ细胞中不被期望出现，考虑到这方面，这类融合基因应优选含有DZ选择性启动子。特别有用的DZ选择性启动子还是来自上述DZ选择性基因。\n本发明的一个方面中，本发明DZ选择性嵌合基因含有编码某种蛋白质的转录DNA区，该活性蛋白质可导致细胞内具生物活性的生长素或其类似物的增加。这类蛋白质例如涉及参与生长素的生物合成，比如由根癌农杆菌T-DNA基因1(iaaM)和/或基因2(iaaH)分别编码〔Gielen等(1984)，The EMBO J.3：835〕的色氨酸单氧化酶和/或吲哚-3-乙酰胺水解酶，或由拟南芥菜(Arabidopsis thaliana)ILR1基因编码的酰胺水解酶，它可从IAA偶联物释放出吲哚-3-乙酸(IAA)〔Bartel和Fink(1995)，科学268：1745〕。鉴于观察到荚果开裂之前IAA水平下降(见实例1)，认为在植物细胞中这类选择性增加生长素量的蛋白质的产生，不会导致由于IAA过量而杀死细胞，但会使得发现于观察到下降之前的IAA水平基本得以保持和/或恢复。通过IAA对正常产生于开裂带细胞的细胞壁水解酶的产生和/或活性的长期抑制，可以延迟荚果开裂的起始。\n或者，本发明DZ选择性嵌合基因的转录DNA区可包括毛根农杆菌(A.rhizogenes)rolB基因〔Furner等(1986)，自然319：422〕的开放阅读框。植物体这种DZ选择性嵌合基因的表达可通过荚果DZ细胞中产生出rolB基因产物来导致植物细胞对生长素敏感性的增加，而防止先于荚果开裂的DZ细胞IAA浓度的通常下降。\n本发明另一方面，本发明DZ选择性嵌合基因含有编码一种蛋白质的转录DNA区，该活性蛋白质可导致产生它的植物细胞对乙烯的敏感性下降。事实上，植物体涉及乙烯信号转导途径的数个基因都已通过突变分析加以确认(例如，ETR1，ETR2，EIN4，ERS，CTR1，EIN2，EIN3，EIN5，EIN6，HLS1，EIR1，AUX1，EIN7)并且对应的许多基因已被克隆〔Chang(1996)，TIBS 21：129；Bleecker和Schaller(1996)，植物生理学111：653〕。认为ETR1、ETR2、EIN4、ERS都编码乙烯受体，而其它基因涉及参与受体下游的乙烯信号转导〔Ecker(1995)，科学268：667〕。已被测序的乙烯受体与反应调节因子组分的受体结构域和/或被称为细胞双组分调节因子的传感器组分的组氨酸蛋白激酶结构域具有同源性，并且根据是否具有受体结构域同源性而被分成两大类。第1类乙烯受体具有传感器和受体同源性结构域，例如ETR1(拟南芥)和ETAE1(番茄)，第二类乙烯受体仅含有传感器组分中组氨酸蛋白激酶结构域的同源性结构域，例如ERS(拟南芥)和NR(番茄)。这些已确定基因的突变型等位基因所编码受体可转移一种对乙烯的显性非敏感性〔Chang(1996)，supra；Bleecker和Schaller(1996)，supra〕。因此，含有编码其活性导致产生它的植物对乙烯敏感性下降的蛋白的转录DNA区的DZ选择性嵌合基因的实例，是含有拟南芥ETR1基因的显性乙烯非敏感性等位突变基因的开放阅读框架的基因，如ETR1-1〔Chang等，(1993)，科学262：539〕。表达这类DZ选择性嵌合基因的植物体在DZ细胞中选择性地产生一种突变型乙烯受体(ETR1-1蛋白)并且这些细胞由此对植物激素乙烯变得不敏感，并且对激素浓度变化，例如已观察到先于荚果开裂起始的乙烯高峰无反应(代谢上)。据认为含有以上所提第一类乙烯受体之任一的显性乙烯非敏感性突变等位基因的开放阅读框架的转录DNA区都可以产生同样效应。在这类转移乙烯非敏感性至表达DZ选择性嵌合基因植物细胞中的另一DZ选择性嵌合基因实例中，含有任意上述第二类乙烯受体之一，例如拟南芥ERS基因〔Hua等(1995)，科学269：1712)或番茄NR基因(Wilkinson等(1995)，科学270：1807〕的乙烯非敏感性显性等位突变基因开放阅读框架的转录DNA区可以实现同种目的。\n进一步可推测上述涉及乙烯信号转导途径基因所编码产物的其余组分作用于受体下游。代表CTR1、EIN2和EIN3的基因已经克隆〔Ecker(1995)，科学268：667〕。开裂带中后期基因表达的调节，例如定向于上述基因的反义RNA或核酶RNA在DZ选择性启动子控制下转录，也会影响对乙烯的敏感性。\n本发明另一方面，本发明的DZ选择性嵌合基因包括编码一种蛋白质或多肽的转录DNA区，该蛋白质或多肽产生于植物细胞，诸如荚果DZ细胞，会杀死这类细胞或者至少明显干扰其代谢、功能或发育。这类转录DNA区实例是那些含有编码核糖核酸酶，如RNase T1和特别为芽胞杆菌RNA酶〔Hartley(1988)，分子生物学杂志202：913〕；细胞毒素如白喉毒素I〔Greenland等(1983)，美国科学院学报80：6853〕或假单胞杆菌属外毒素A的DNA序列。根据它们已知的生物学性质可以使用数个编码具细胞毒素性质蛋白的其它DNA序列。实例包括，但不限于，编码蛋白酶诸如木瓜蛋白酶；葡聚糖酶；脂酶诸如磷酸脂酶A2；脂过氧化物酶；甲基化酶诸如大肠杆菌Dam甲基化酶；DNases诸如EcoR1内切核酸酶；植物细胞壁抑制物等等的DNA序列。\n本发明另一方面，本发明DZ选择性嵌合基因含有编码一种蛋白质或多肽的转录DNA区，其产物从植物细胞中分泌并至少抑制产生于开裂带(如荚果DZ)的至少一种内源性多聚半乳糖醛酸酶，特别是SEQ IDNO 1的cDNA编码的endo-PG。\n本发明DZ选择性嵌合基因中，优选的所编码RNA的5′非翻译区正常来自于嵌合基因的启动子，如DZ选择性启动子。然而，5′非翻译区也可来自于其它植物表达基因。因此，优选的本发明DZ选择性嵌合基因包括DZ选择性基因的完整5′调节区(含有5′非翻译区)。特别有用的5′调节区是SEQ ID NO 13的第1329位核苷酸以上的上游区，优选至少490bp的区，更优选该区延伸至第2329位核苷酸上游的第1个SphI位点。\n优选的本发明DZ选择性嵌合基因也含有指导植物细胞中mRNA正确多聚腺苷酸化和转录终止的3′非翻译区。这些信号可从诸如多聚半乳糖醛酸酶基因的植物基因获得，或者从植物体之外的基因获得。外源3′转录终止区或多聚腺苷酸信号的实例是来自于章鱼碱合成酶基因〔DeGreve等(1982)，J.Mol.Appl.Genet.1：499〕，胭脂氨酸合成酶基因〔Depicker等(1982)，J.Mol.Appl.Genet.1：561〕或T-DNA基因7〔Velten和Schell(1985)，核酸研究13：6998〕等等。\n优选地，含有DZ选择性嵌合基因的重组DNA也包括常规嵌合标记基因。该嵌合标记基因含有标记DNA，它受控于可操作地连接于其5′末端的植物表达启动子，优选诸如CaMV35S的组成型启动子，或诸如编码Rubisco小亚基基因启动子的光诱导启动子；和可操作地连接于其3′末端的合适的植物转录终止区和多聚腺苷酸信号。该标记DNA优选编码一种当在植物细胞中表达时允许该细胞可与标记mRNA不表达的那些细胞相区分的RNA，蛋白质或多肽。标记DNA的选择并无严格要求，并且在熟知范围内可以选择任意合适的标记DNA。例如标记DNA可编码一种为转化植物细胞提供易于区别色彩的蛋白质，如A1基因(Meyer等(1987)，自然330：670)，可为转化植物细胞提供除草剂抗性，如编码草甘膦抗性(EPO，242，246)的bar基因，或者为转化细胞提供抗生素抗性，如编码庆大霉素抗性(WO 94/01560)的aac(6′)基因。\n本发明的DZ选择性启动子被认为具有定向于DZ细胞内基因表达的高度特异性活性或效应。然而，嵌合基因所含启动子的特性(如组织特异性)可在一些转化有该嵌合基因植物中被稍稍改变。这可以，例如由于随机整合至植物基因组的结果被归因于“位置效应”。\n因此在某些转化有本发明DZ选择性嵌合基因的植物的某些非DZ细胞中也可观察到嵌合基因的低水平表达。所以，可视情况选择地，植物基因组也可转入第二嵌合基因，它含有由第二植物表达启动子控制的第二转录DNA区，并编码一种能阻止，抑制或抵消DZ选择性嵌合基因的基因产物活性的RNA、蛋白质或多肽。如果DZ选择性嵌合基因编码芽胞杆菌RNA酶，优选第二嵌合基因编码barstar，即芽胞杆菌RNA酶的抑制物〔Hartlery(1988)，分子生物学杂志202：913〕。其它第二嵌合基因编码的有用蛋白为抗体或抗体片段，优选单链抗体，它能特异结合于DZ选择性嵌合基因的编码蛋白并使该蛋白失去生物活性。\n优选第二启动子能至少在植物体非DZ细胞中驱动第二转录DNA区的表达，从而抵消、阻止或抑制在某些转化植物的这些细胞中的DZ选择性嵌合基因的非期望的低度表达效应。有用的第二启动子实例是CaMV小35S启动子〔Benfey和Chua(1990)，科学250：959〕或根癌农根菌T-DNA的胭脂氨酸合成酶基因启动子〔Depicher等(1982)，J.Mol.Appl.Genet，1：561〕。其它有用启动子是来自于已知在DZ中无活性的基因的启动子，如蔓菁中编码某mRNA的基因，由该mRNA可得到含有SEQ IDNO 7、SEQ ID NO 9，或SEQ ID NO 11序列的cDNA。\n植物体第二嵌合基因优选与DZ选择性嵌合基因位于相同遗传位点(Locus)以便确保它们联合分离。这可以通过使两嵌合基因结合于单一转化DNA中，如载体或作为相同T-DNA的部分组分来获得。然而某些例子中联合分离并不总为人所愿。因此两构建物可出现于分离的转化DNA上，这样转化可以造成在植物基因组的不同位点整合两构建物。\n本发明的另一实施方案中，开裂特性被改变的植物可从用已知方法被转化使得本发明DZ选择性嵌合基因稳定整合进核基因组中的单一植物细胞来获得。\n含有DZ选择性嵌合基因的重组DNA可以稳定整合至植物特别是可被农杆菌介导转导的植物细胞核基因组中。基因转移可由某一载体执行，该载体为去毒Ti质粒，含有本发明的DZ选择性嵌合基因，并由农杆菌携带。利用例如EP0,116,718所述方法可以完成这个转化。Ti质粒载体系统含有DZ选择性嵌合基因，它位于T-DNA边界序列之间，或至少到右T-DNA边缘的左边。或者也可以选用任何其它类型载体转化植物细胞，应用方法例如直接基因转移法(如EP 0,233,247所述)，花粉管介导转化(如EP0,270,356,WO 85/01856和US 4,684,611)，植物RNA病毒介导转化(如EP 0,067,553和US 4,407,956)，脂质体介质介导转化(如US 4,536,475所述)等等。\n其它方法如基因枪法，见Fromm等〔(1990)，生物技术(Bio/Technology)8：833〕和Gordon-Kamm等〔(1990)，植物细胞2：603〕所述也可以采用。单子叶植物细胞，例如主要谷类作物，也可转化那些能形成完整胚性俞伤组织的受伤或酶解的完整组织，或如WO92/09696所述的由此获得的胚性愈伤组织。结果转化的植物细胞由此可用于常规方法再生出转化植物。\n获得的转化植物可用于常规繁殖程序生产具相同特性的更多转化植物或在相同或相关植物种的其它变种中引入本发明的DZ选择性嵌合基因。种子获取于含有稳定插入基因组的本发明DZ选择性嵌合基因的转化植物。\n以下实例描述蔓菁中DZ选择性基因的分离及特性鉴定，DZ选择性启动子的确认以及该启动子用于调整植物体开裂特性的应用。除非实施例中另有说明，所有重组DNA技术都根据Sambrook等(1989)分子克隆实验室指南(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，SecondEdition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY)和Ausubel等(1994)分子生物学现代方法(Current Protocols in Molecular Biology，Current Protocols，USA)第1和2卷所述标准程序执行。植物分子工作标准材料和方法见述于R.D.D.Croy所著的Plant Molecular BiologyLabfax(1993)，由BIOS Scientific Publications Ltd(UK)和BlackwellScientific Publication，UK联合出版。\n本发明实施例和说明书中，提到了下列序列表中的序列：SEQ ID NO 1：DZ选择性cDNA，编码蔓菁多聚半乳糖醛酸酶SEQ ID NO 2：寡核苷酸PG1SEQ ID NO 3：寡核苷酸PG2SEQ ID NO 4：寡核苷酸PG3SEQ ID NO 5：寡核苷酸PG5SEQ ID NO 6：PCR片段BPG 32-26SEQ ID NO 7：PCR片段KPG 32-8SEQ ID NO 8：PCR片段LPG 12-16SEQ ID NO 9：PCR片段LPG 32-24SEQ ID NO 10：PCR片段LPG 32-25SEQ ID NO 11：PCR片段LPG 32-32SEQ ID NO 12：pGSV5的T-DNASEQ ID NO 13：含有驱动蔓菁内切多聚半乳糖醛酸酶基因表达的DZ选择性启动子区的基因组克隆序列。\n为了进一步阐明本发明及其优点，以下给出具体实施例，应理解为意作例证而决非局限于此。\n实施例1荚果发育期荚果开裂的特征鉴定荚果发育期内源植物激素分布蔓菁栽培种Fido生长于无热源温室。萌发后12天植物转移至1000cm3堆肥中进一步生长。花后两至八周期间每周收集一次荚果。荚果取自上数第三腋生总状花序的末端基部。将荚果分成开裂带、荚果壁和种子。\n样品置于杵臼中，用终浓度为80％甲醇于-20℃压榨抽提16小时。植物激素的纯化和分析按已述方法执行〔Bialek和Cohen(1999)，Plant Physiol.90：398；Prinsen等(1991)，in：ALaberatory Guide for Cellular and Molecular Plant Biology.Ed.Negrutiu and Gharti-Chhetri.Brikhauser Verlag，Basel/Boston/Berlin pp 175-185，pp 323-324；Chauvaux等(1993)，J.Chromatogr.A657：337〕。\n荚果不同部分(荚果壁，开裂带和种子)被筛选确定乙烯前体1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)及其偶联物和吲哚-3-乙酸及其偶联物的内源浓度。\n荚果开裂前瞬间可观察到乙烯释放高峰〔见Meakin和Roberts(1990)，J.Exp.Bot.41：1003〕；该峰与观测到的游离ACC峰相关联。特别在开裂带中观察到荚果开裂起始前IAA浓度〔游离及其偶联物〕的下降。这种IAA浓度下降特异性地相关于开裂带中纤维素酶活性的增加。\n进一步实验表明，荚果经ACC合成酶的竞争性抑制剂氨基乙氧基乙烯基甘氨酸(AVG)处理可抑制乙烯产生。花后28天应用浓度为500mg/L的AVG处理。该处理会导致整个荚果中乙烯产生有40～50％的下降并伴随着荚果壁的衰老约延迟4天。在开裂带和所处理荚果的种子中内源性ACC浓度减少都与乙烯的产生量减少相关。在其它经分析的组织中(荚果壁，隔膜和开裂带与荚果壁间带)没有显现这种ACC浓度或其合成的减少。这些对于对照和AVG处理植物的实验中都观测到先于荚果开裂前荚果带中内源IAA浓度的减少。\n为了检测生长素与荚果开裂的相关性，人工合成的生长素4-氯苯氧乙酸(4CPA)被用来控制生长素的水平。为了实现所有时期都能人工保持生长素浓度处于高水平，可以在花后35天用浓度为150mg/L 4CPA喷洒。这可导致荚果的开裂倾向明显延迟(见表1)，荚果壁衰老时间约延迟两周。没有观察到对内源植物激素浓度有何影响。然而在开裂带细胞中β-葡聚糖酶活性显著下降。这些结果清楚地表明生长素对β-葡聚糖酶产生量和/或活性的抑制效应。\n生长素减少是荚果开裂的主开关。\n表1：悬臂弯曲试验〔Kadkol等(1986)，Aust.J.Bot.34：595〕检测油菜栽种培种Fido荚果(8％含水量)的荚果开裂起始和蔓延(propagate)所需力(10-3N)。试验植物分别为未经处理植物，喷洒AVG减少乙烯产量的植物，或喷洒4CPA以阻止生长素降低的植物。(SED：差值的标准误df：自由度)\n显示荚果开始开裂带中多聚半乳糖醛酸降解酶活性油菜栽培种Fido的荚果收获自花后6.5周，剥去心皮和种子，并且粗制酶提取物制备于开裂带周围组织，包括具维管束的胎座框和长角果两小室间的薄膜。随后进行了关于提取物与聚合底物(糖醛酸)作用的测试，选用分子量下移(down-shift)分析法，基于底物分别与沸煮失活(作对照)和具活性酶类共温育后进行的凝胶渗透层析。特别检测具内切活性酶类的分析发现，当以外切方式除去单个外桂单糖时，仅仅非常迟缓地改变着聚合底物的分子量分配。糖醛酸分析基本按Blumenkrantz和Asboe-Hansen〔(1973)，Anal.Biochem.54：484〕所述方法执行。这里所用的分析仅是为了从严格定量意义上论证酶活性的存在。\n所制备的油茶荚果的DZ含有低度甲基化果胶聚合物完全降解所需的所有酶活性。经发现酶混合物中一种组分特地作用于多聚半乳糖醛酸聚合体。进一步论证表明在已知植物酶类中只有内切多聚半乳糖醛酸酶对所用多聚半乳糖醛酸制备物的分子量下移负责。\n可以认为内切多聚半乳糖醛酸在荚果开裂过程中观察到的中间层物质的不断降解过程中扮演重要角色。\n开裂过程中的结构观测对荚果组织结构的细节检测可以更深入洞察开裂带中发生的与生化过程相关联的结构变化。电子显微镜观察发现荚果壁的快速降解稍稍先于位于开裂带、中皮层、隔膜和种子脱落带的薄壁组织的降解。降解的起始信号为细胞壁的膨胀。随后仅见于开裂带有细胞分离，经观察沿中间层线发生并且随后即是细胞壁微纤维的溃散。最后，开裂带所有细胞发生分离而荚果的两膜片仅仅由穿过开裂带的维管束相互附着。电镜分析显示荚果开裂期间中间层的显著降解而初生细胞壁除了有些变薄变软的过程外仍完整保留。这些观察表明初生细胞壁中任意进程都依赖于中间层的降解。\n开裂带细胞中间层的完全溶解意味着诸如内切PG的果胶降解酶的出现。该酶降解了中间层果胶质的关键部分后，其它具中性聚合物亲合特性的多糖降解酶涉及完成中间层的解聚过程。\nβ-半乳聚糖酶和β-葡聚糖酶被纯化至同质均一。对底物特异性的详细研究显示这些酶涉及到开裂带细胞初生细胞壁的消化变薄。\n实施例2蔓菁中DZ选择性内切多聚半乳糖醛酸cDNA的克隆蔓菁栽培种Topaz植物荚果开裂带的poly-A+mRNA依下述方法制备。分别取20克组织(叶，开裂带，荚果壁，根或茎)在液氮中研磨并在Waring捣碎机中与100ml提取缓冲液(4M硫氰酸胍，25mM柠檬酸钠，PH7.0，0.5％十二烷基肌氨酸钠，0.1M2-巯基乙醇)进行匀浆处理30秒。匀浆转移至新试管中，并加入1/10体积的2M乙酸钠(PH4.0)和1体积TE饱和的苯酚/氯仿。混合溶液剧裂振荡后，冰水冷却15分钟，再4℃10,000g离心15分钟。上清以上述方法用苯酚/氯仿再抽提一次。等体积异丙醇加入再次抽提后离心所得上清中，-20℃温育过夜后RNA即可沉淀出来，经10,000g离心15分钟，用2亳升变性缓冲液溶解RNA沉淀。然后加入14ml 4M LiCl，将溶液冰浴过夜。10,000g离心15分钟沉淀出RNA，RNA沉淀经80％乙醇洗涤后干燥并溶于1ml水中。根据厂家说明方法用寡脱氧胸苷酸琼脂糖凝胶柱(oligo-d(T)sepharose柱)分离得到poly-A+RNA(Boehringer，Mannheim)。\n使用M-MLV逆转录酶和6μg经上述方法制备的总poly-A+RNA，根据厂家指定条件能够合成出以随机引物或oligo-d(T)为引物的cDNA第一条链(Life Technologies/BRL)，并用作以后PCR反应的模板DNA。\n根据已公布的番茄〔DellaPenna等(1986)，美国科学院学报83：6420；Grierson等(1986)，核酸研究14：8595〕，玉米〔Niogret等(1991)，植物分子生物学17：1155〕，avocado和Oenothera〔Brown和Crouch(1990)，植物细胞2：263〕PG氨基酸序列保守区设计了4个简并引物。所用四种引物序列(PG1，PG2，PG3和PG5)见SEQ ID NO 2-5。在两个上游引物PG1和PG3的5′端设计了限制性酶切位点EcoRI，在两个下游引物PG2和PG5的5′端设计了BamHI位点。\n所有PCR反应的最终组成如下：在50μl反应体系中含有50mM KCl，10mM Tris-HCl，pH8.3，1.5mM MgCl2，0.001％(W/V)明胶，100pmol简并引物和1单位Taq DNA聚合酶。模板DNA在1×PCR反应缓冲液中经95℃预变性3分钟后，在1×PCR缓冲液(热起始PCR)中加入1单位Taq DNA聚合酶从而起始PCR反应并经如下条件：95℃1分钟，45℃1分钟，72℃1分钟循环35次后，再72℃3分钟。PCR反应的热起始嵌套式PCR 21被用作新一轮PCR反应的模板。PCR产物用氯仿抽提，乙醇沉淀，再溶解于TE中，并用限制酶BamHI和EcoRI进行消化。限制酶切后的PCR产物从低熔点琼脂糖纯化后克隆到用BamHI和EcoRI酶切后的pGEM-7z中。通过双脱氧链终止DNA测序法选用测序酶Version2.0(Pharmacia)获得PCR片段的DNA序列。\n使用PG1/PG5引物组合可以获得最长的PCR片段。选用小等份PG1/PG5PCR反应产物作模板及PG3/PG2、PG1/PG2或PG3/PG5引物组合可以进行热起始嵌套式PCR。通过PCR产物测序确定了7个高度趋异性的PG相关的克隆，表明存在着至少7个不同的同功型PG。有3种形式皆分别从单一组织中获得，即lpg32-25(SEQ ID No 10)获自开裂带，kpg 32-8(SEQ ID No 7)获自荚果壳，bpg 32-26(SEQ ID No 6)获自叶片。lpg 32-32(SE Q ID No 11)，bpg 32-24(SEQ ID No 9)仅发现于2种荚果组织中，而lpg 12-16(EQ ID No 8)可来自所有三种被分析组织中。应该指出的是，当PG3/PG5引物组合用于嵌套式PCR反应时lpg 35-8(含有SEQ ID No 1从第884到1245位点之间DNA序列)是在开裂带中鉴定的唯一类型。\nPG相关的PCR克隆lpg 35-8在根、茎、叶和下胚轴以及荚果发育过程中的表达可通过以下Northern分析进行研究。单个组织的总DNA通过在0.66M甲醛/1％琼脂糖凝胶条件下进行凝胶电泳加以分离(Sambrook等(1989)，supra)。RNA被转移至Hybond-N滤膜上并经紫外照射而固定于滤膜上。滤膜在5×Denhardt，25mM Na2HPO4，25mM NaH2PO4，0.1％焦磷酸盐，750mMNaCl，5mM EDTA和100μg/ml变性青鱼精子DNA条件下经68℃预杂交4小时。PCR产物放射性标记和热变性，直接加入预杂交缓冲液中，于68℃杂交持续16小时。根据Sambrook等〔(1989)，supra〕清洗滤膜，最后一次清洗条件为68℃于0.2×SSC，0.1％SDS。滤膜在-80℃用增感屏进行放射自显影。\n从根、茎、叶和下胚轴中分离的总RNA中，检测不到与lpg 35-8克隆杂交的转录物。然而，lpg 35-8克隆与一段1.6-1.7kb转录物相杂交，此转录物在经分析的各阶段中都仅仅在开裂带中表达，并且发现在5周后其丰度急剧增加。\n利用从开花后6周的开裂带中分离的5μg poly-A+RNA在λZAPII插入载体(Stratagene)中构建出DZ选择性cDNA文库。从低熔点琼脂糖凝胶中纯化大于1kbp的cDNA并连入λZApII载体。初级库含有1.25×106pfu并且平均cDNA插入大小为约1.5kbp。根据标准程序在高度严谨条件下对文库进行筛选〔(Sambrook等(1989)，supra)〕。\n用测序酶V.2.0(Amersham)进行cDNA测序。用GCG序列分析软件包V.7进行序列分析〔Devereux等(1984)，核酸研究12：387〕用lpg 35-8PCR片段作探针筛选300,000个噬菌斑后产生约200个阳性杂交信号。将5个强杂交噬菌斑纯化到同质性。从λ载体切去插入DNA后，限制酶切分析表明cDNA插入物除1例外在所有cDNA克隆中皆大约为1600bp，在例外的1例中仅有1300bp插入。4个最大cDNA插入物(命名分别为X，5，9，11)的限制酶切图谱分析显示出4个cDNA插入物间的细微差别。\n最值得注意的是在cDNA克隆X和11中存在Nsil限制酶位点，在cDNA克隆9中存在Hind II位点。相反地，cDNA克隆5中不存在这些位点。5′和3′cDNA末端的部分测序显示不同cDNA克隆间包括小的删除/插入的附加序列多样性。这些结果显示了在开裂带内不同但具有高度同源性的PG编码基因的表达。序列资料也显示较大的4个cDNA插入物都含有PG蛋白的完整编码序列。\ncDNA克隆X的完整序列和其最大开放阅读框所编码的氨基酸序列见SEQ ID No.1。此开放阅读框架编码大小为433氨基酸的蛋白质，估计其分子量为46.6KD，与已知的内切多聚半乳糖醛酸酶相当近似。与别的细胞壁水解酶相似，假定的DZ选择性内切PG最初产生时是含有N-末端的共翻译切割的信号肽前体。最可能的切割位点位于氨基酸23和24之间，产生的成熟蛋白分子量大约为44.2kD。\n用cDNA克隆X作为探针的Northern分析证实并发展了已知的表达模式。依前述方法从荚果不同组织(开裂带，荚果壳，种子和隔膜)在5个时间点(开花后2，3，5，7，9周-WAA)中制备出总RNA。通过凝胶电泳分离5μg总RNA并与作为探针的放射性标记的SEQ ID No 1 cDNA在前述严谨条件下杂交，曝光过夜后可得到放射自显影图。在2WAA(开花后周数)，检测不到信号，在3WAA可观察到的微弱信号。基于光密度扫描读数结果，测得5WAA时的表达水平大约是3WAA时的3.5倍；7WAA时大约是3WAA时的7倍，9WAA时大约是3WAA时的12倍。在荚果壁或种子中没有检测到信号。在9WAA的隔膜中检测到微弱表达(与3WAA时的DZ水平相近)。\n本实验所用的RNA是提取于荚果发育大约9周的植物体的不同组织。\n实施例3从对应于cDNA克隆lpg 35-8的蔓菁基因组克隆中分离DZ选择性启动子商业上可得的大肠杆菌中蔓菁载培种BridgerλEMBL 3基因组文库(Clontech Laboratories，Inc.)的筛选如下。lpg 35-8cDNA被转移到Hybond-N尼龙膜上，用随机引物进行放射性标记，滤膜在高度严谨条件下即5×SSPE，5×Denhardt，0.5％SDS，50μg/ml青鱼DNA(1×SSPE：0.18M NaCl，10mm磷酸钠，pH7.7，1mM DETA)下杂交，再在高度严谨条件(最后一次清洗用68℃，0.11×SSPE，0.1％SDS)下清洗。筛选了大约600,000个噬菌斑分离了11个杂交斑。两个杂交斑即λ2和11被重筛2次。第2次重筛之后从无麦芽糖时生长的大肠杆菌NM538的λ2和11制得噬菌体裂解物。由λ2和λ11制得的DNA用Sal I消化，凝胶电泳后转移到Hybard-N尼龙膜上。两个克隆与标记的lpg35-8cDNA克隆杂交后产生相同的杂交模式。从λ11分离到一个高杂交性的6.3kbSal I片段，并将其插入pUC 18中，产生了主克隆6.3Sal。为了确定6.3Sal是否对应于lpg 35-8，设计一测序引物，该引物能够确定lpg 35-8中编码2个独特氨基酸的DNA序列。Sanger双脱氧测序法肯定了所分离的基因组克隆6.3Sal在此方面与lpg 35-8cDNA是相同的。此克隆的限制酶切图谱证明它含有完整的lpg 35-8的开放阅读框和下游序列约100到200bp及上游序列约3.5kb。约2.3kb的一段DNA序列(含启动子、5′端非翻译区和开放阅读框的前24个核苷酸)已经确定并示于SEQ ID No 13中。\n鉴于cDNA克隆(SEQ ID No 1)和基因组克隆(SEQ ID No13)是从不同的蔓菁品种(分别是cv.Topaz和cv.Bridger)分离的，令人吃惊的是两个序列对比后发现重叠片段有100％的序列同一性。\n对应于6.3Sal克隆所含基因的DZ选择性基因的转录起始位点是利用诸如引物延伸分析法〔Sambrook等(1989)分子克隆实验室指南，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY〕或RACE-PCR〔Innis等(1990)PCR Protocols：A Guideto Methads and Applications，Academic Press Inc.〕之类广为人知的技术确定的。认为5′UTL位于SEQ ID No 13第2,219和2,227位点之间。\n利用已完善建立的定点诱变技术〔Ausubel等(1994)，supra〕对DNA序列进行修饰而在编码序列的ATG翻译启始密码子周围产生一个唯一限制酶(如：NcoI)识别位点，这就可以直接融合DZ选择性基因的启动子区到一段令人感兴趣的DNA序列上，从而构建出本发明的DZ选择性嵌合基因。利用在ATG翻译启始密码子附近的单限制酶位点的上游(即5′端)第500至2000碱基对之间的单限制性酶识别位点，分离到一个很好确定的DNA片段，它在后面将被用作启动子序列组件，此后被称作PDZ，它可以指导植物中的DZ选择性表达。\n例如，一段能够在植物体定向于DZ选择性表达的SphI-NcoI片段(约2.08kb)，随后被用作启动子序列组件，此后被称为PDZ1。\n构建一个DZ选择性嵌合基因(PDZ或PDZ1-gus-3′nos)，含有以下可操作连接的DNA片段：-PDZ或PDZ1：含有DZ选择性启动子的5′调控区-gus：编码β-葡糖醛酸酶的DNA片段〔Jefferson等(1986)，美国科学院学报83：844〕；-3′nos：3′非翻译末端，含有胭脂氨酸合成酶基因的聚腺苷酸化位点(“3′nos”)〔Depicker等(1982)，J.Mol.App.Genet.1：561〕。\n使用已建立的定向诱变技术修改DNA序列从而产生位于编码序列的ATG翻译启始密码子上游紧邻处的唯一限制性位点，从而获得了第二个能够指导植物DZ选择性表达的启动子组件。为了此目的，在ATG密码子的紧邻上游，通过把SEQ ID No 13的第2327和2328位点的A核苷酸改为G核苷酸，产生一个SmaI位点。约2.1kb的SphI-SmaI片段，以下称为指启动组件PDZ2，被融合于质粒pBI101(Clontech Laboratories，Inc CA，USA)的GUS编码区上游的SmaI位点，构建出携带嵌合PDZ2-gus-3′nos基因构建物的质粒(2.1guspgem7)。\n具选择性标记的嵌合基因PSSU-bar-3′ocs已被构建〔DeAlmeida等(1989)，Mol.Gen.Genet.218：78〕。它含有以下的可操作连接的DNA片段：-PSSU：拟南芥核酮糖-1.5-二磷酸羧化酶小亚基1A编码基因的启动子区〔Krebbers等(1988)，植物分子生物学11：745〕，-bar：编码膦丝菌素乙酰转移酶〔Thompson等(1987)，The EMBO J.6：2519〕的bar基因区，-3′ocs：含有章鱼氨酸合成酶基因的聚腺苷酸化位点的3′端非翻译末端〔De Greve等(1983)，J.Mol.Appl.Genet.1：499〕。\n或者，构建与前述选择性标记嵌合基因除了3′ocs被含有T-DNA基因7(3′g7；Velten和Schell(1985)，核酸研究，13，6981)的多聚腺苷酸位点的3′非翻译末端替代外相同的片段PSSU-bar-3′g7。\nDZ选择性嵌合基因(PDZ2-gus-3′nos；约4.2kbHindIII-Xhol克隆片段)和选择性嵌合基因(PSSU-bar-3′g7)都被导入位于T-DNA载体pGSV5边界序列之间的多接头区，产生带有位于T-DNA边界重复之间的PDZ2-gus-3′nos和PSSUAra-bar-3′g7嵌合基因构建物的质粒载体pTCO155。pGSV5由质粒pGSC 1700衍生而来〔Cornelissen和Vandewiele(1989)，核酸研究17：833〕，但与pGSC 1700不同之处在于：pGSV 5不含有β-内酰胺酶基因，其T-DNA以SEQ ID No 12序列为特征。\n实施例4带有内切PG启动子控制下的芽胞杆菌RNA酶编码区的嵌合基因的构建构建的DZ选择性嵌合基因(PDZ-芽胞杆菌RNA酶-3′nos或PDZ1-芽胞杆菌RNA酶-3′nos或PDZ2-芽胞杆菌RNA酶-3′nos)，含有以下可操作连接的DNA片段：-PDZ或PDZ1或PDZ2：实施例3中的5′调控区，含有DZ选择性启动子。\n-芽胞杆菌RNA酶：编码淀粉液化芽胞杆菌的芽胞杆菌RNA酶的DNA片段〔Hartley(1988)，分子生物学杂志202：913〕，-3′nosDZ选择性嵌合基因和PSSU-bar-3′g7或PSSU-bar-3′ocs标记性嵌合基因都被导入位于实施例4中T-DNA载体pGSV5边界序列之间的多接头区。\n用PDZ2启动子组件取代pTC099芽胞杆菌RNA酶编码区的上游pTA29启动子，构建了位于T-DNA边界重复区之间的PDZ2-芽胞杆菌RNA酶-3′nos。为此，含有PDZ2的2.1kb(平端)SphI-SmaI片段在其SmaI位点与平端Nco位点融合，此平端NcoI位点与pTC099的成熟芽胞杆菌RNA酶编码序列5′末端改造后的ATG密码子相重叠，此融合产生在T-DNA边界重复之间带有pDZ2-芽胞杆菌RNA酶-3′nos嵌合基因的质粒载体pTPR1。pTC099的T-DNA载体部分是由pGSV5经如下方法衍生而来：将1个EcoRI接头(GGAATTCC)插入到多接头的SmaI位点；同时1个BglII接头(CAGATCTG)插入到多接头的NcoI位点，随后pTCO113〔WO96/26283〕的嵌合pTA29-芽胞杆菌RNA酶-3′nos基因导入多接头的EcoRI位点。在pTPR1位于T-DNA边界重复之间的多接头序列中插入嵌合选择性标记基因pSSUAra-bar-3′g7产生了pTPR3。\n另一T-DNA载体(pTPR2)被构建出来，其中上述的DZ选择性嵌合基因(PDZ2-芽胞杆菌RNA酶-3′nos)连同于含有受胭脂氨酸合成酶启动子控制的芽胞杆菌RNA酶抑制剂编码区(pnos-barstar-3′g7)的pTCO113〔WO96/26283〕的BglII酶切片段插入到pTPR1的T-DNA边界重复之间多接头区。pTPR4是由在pTPR2的T-DNA边界重复之间的多接头序列中插入嵌合选择性标记基因pSSUAra-bar-3′g7产生的。\n实施例5构建编码T-DNA基因1产物或rolB基因产物的DZ选择性嵌合基因构建的DZ选择性嵌合基因(PDZ-g1-3′nos)含有以下可操作连接的DNA片段：-PDZ或PDZ1或PDZ2：实施例3的5′调节区；含有DZ选择性启动子，-g1：编码根癌农杆菌色氨酸2-单加氧酶(iaaM或T-DNA基因1产物)〔Gielen等(1984)，EMBO J.3：835〕的DNA片段，它是通过聚合酶链式反应得到的，用于该反应的适当设计的引物含有的序列分别与基因1侧翼序列相同和互补。\n-3′nos第二个构建的DZ选择性嵌合基因(PDZ-g2-3′nos)含有以下可操作连接的DNA片段：-PDZ或PDZ1或PDZ2：含有DZ选择性启动子的实施例3的5′调节区。\n-g2：编码根癌农杆菌吲哚-3-乙酰胺水解酶(iaaH或T-DNA基因2产物)〔Gielen等(1984)，EMBO J.3：835〕的DNA片段，它是通过聚合酶链式反应扩增得到的，该反应所用的恰当设计的引物所含序列分别与基因2侧翼序列相同和互补，-3′nosDZ选择性嵌合基因(仅仅PDZ-g1-3′nos或者其与PDZ-g2-3′nos相联合)和PSSU-bar-3′ocs或PSSU-bar-3′g7嵌合标记基因都被导入位于实施例4中T-DNA载体pGSV5的边界序列之间的多接头区。\n另一构建的DZ选择性嵌合基因(PDZ-rolB-3′nos)含有以下可操作连接的DNA片段：-PDZ：实施例3中的5′端调控区，含有DZ选择性启动子，-rolB：毛根农杆菌rolB基因〔Furner等(1986)，自然319：422的开放阅读框〕-3′nosDZ选择性嵌合基因和PSSU-bar-3′ocs或PSSU-bar-3′g7嵌合标记基因都位导入位于实施例4中T-DNA载体pGSV5边界序列之间的多接头区。\n实施例6构建编码突变型ETR1-1乙烯受体的DZ选择性嵌合基因构建的DZ选择性嵌合基因(PDZ-etr1-1-3′nos)含有以下可操作连接的DNA片段：-PDZ或PDZ1或PDZ2：实施例3的5′调节区，含有DZ选择性启动子，-etr1-1：拟南芥ETR基因〔Chang等(1993)，科学262：239〕的显性乙烯非敏感性等位突变基因的开放阅读框，分离自利用携带含有突变型etr1等位基因〔Chang等(1993)，科学262：539〕的DNA的7.3kb基因组EcoRI酶切片段的质粒和合理设计的引物进行PCR扩增所获得的含有编码序列被5个内含子隔离的外显子的2.7kb片段。\n-3′nosDZ选择性嵌合基因和PSSU-bar-3′ocs或PSSO-bar-3′g7嵌合标记基因都被导入位于实施例4的T-DNA载体pGSV5边界序列之间的多接头位点。\n实施例7构建编码互补于某mRNA(由其可得到SE Q ID No1的cDNA)的反义RNA的DZ选择性嵌合基因构建的DZ选择性嵌合基因(PDZ-anti-PG-1-3′nos)含有以下可操作连接的DNA片段：-PDZ或PDZ或PDZ：实施例3中5′端调节区，含有DZ选择性启动子，-anti-PG-1：编码与SEQ ID No 1第10和第1600核苷酸位点之间区编码的RNA互补的RNA的DNA片段。\n-3′nos为此，35S-反义PG构建基因的CaMV35S启动子可通过HincII和XhoI双酶切消化而消除，并被含PDZ2的片段所取代，该35S-反义PG构建基因含有与克隆在CaMV 35S启动子和多聚腺苷酸化信号(见下述)之间的SEQ ID No1完整序列互补的RNA序列。\nDZ选择性嵌合基因和PSSU-bar-3′g7或PSSU-bar-3′ocs嵌合标记基因都被导入位于实施例4中T-DNA载体pGSV5的边界序列之间的多接头区。\n另一构建的DZ选择性嵌合基因(PDZ-anti-PG-2-3′nos)含有以下可操作连接的DNA片段：-PDZ或PDZ1或PDZ2：实例3的5′端调节区，含有DZ选择性启动子，-anti-PG-2：一个DNA片段，它所编码的RNA互补于由SEQ ID No1第20和700核苷酸位点之间区编码的RNA。\n-3′nosDZ选择性嵌合基因和PSSU-bar-3′ocs或PSSU-bar-3′g7嵌合标记基因都被导入位于实施例4的T-DNA载体pGSV5的边界序列之间的多接头区。\n还有一个构建的DZ选择性嵌合基因(PDZ-anti-PG-3-3′nos)含有以下可操作连接的DNA片段：-PDZ或PDZ1或PDZ2：实例3的5′调节区，含有DZ选择性启动子，-anti-PG-3：一个DNA片段，它所编码的RNA互补于SEQ ID No1第800和1600核苷酸位点之间区编码的RNA。\n-3′nosDZ选择性嵌合基因和PSSU-bar-3′ocs或PSSU-bar-3′g7嵌合标记基因都被导入位于实施例4的T-DNA载体pGSV5边界序列之间的多接头区。\n另外构建的3个反义构建基因含有CaMV35S启动子，互补于SEQ ID No1完整序列的DNA序列或互补于SEQ ID No1 3′末端679bp(A67)的DNA序列或互补于SEQ ID No1 3′末端336bp(A30)的DNA序列，和多聚腺苷酸化信号。切割cDNA库克隆X的cDNA所得EcoRI-XhoI片段被插入到pBluescript(Stratagene，CA USA)中。从该质粒中分离出来的全长cDNA作为BamHI-XhoI片段被插入到经BamHI-XhoI消化的pRT100载体上〔Topfer等(1987)，核酸研究15，5890〕，位于CamV35S启动子和多聚腺苷酸化信号之间。所得质粒经BamHI和EcoRI消化，经Klenow聚合酶处理后进行自身连接。\n携带含有SEQ ID No1的3′端679bp的cDNA插入片段的pBluescript质粒的HaeIII-XhoI酶切片段被插入到经SmaI-XhoI消化的pRT100载体的CaMV35S启动子和多聚腺苷酸化位点之间，产生了质粒A67。\nA67构建物用XhoI和Styl消化，经Klenow聚合酶处理并自身连接，产生出质粒A30，它含有互补于SEQ ID No1 3′末端的位于CaMV35S启动子和多聚腺苷酸信号之间的336bp的DNA序列。该嵌合基因以PstI片段形式被分离。\n35S-反义PG嵌合基因和PSUU-bar-3′ocs或PSSU-bar-3′g7嵌合标记基因被导入位于实施例4中T-DNA载体pGSV5的边界序列之间的多接头区。\n实施例8油菜(Oilseed rape)的转化及转化体的鉴定。\n农杆菌介导转化。\n蔓菁下胚轴外植体的获得、培养和转化基本按De Blook等〔(1989)，植物生理学91：694〕所述进行，但以下修改除外：-下胚轴外植体在A2培养基中预培养3天〔MS，0.5g/LMes(pH5.7)，1.2％葡萄糖，0.5％琼脂糖，1mg/L2，4-D，0.25mg/L萘乙酸(NAA)和1mg/L 6-苄基氨基嘌呤(BAP)〕。\n-感染培养基A3为MS，0.5g/L Mes(pH5.7)，1.2％葡萄糖，0.1mg/L萘乙酸，0.75mg/L BAP和0.01mg/L赤霉酸(GA3)。\n-选择培养基A5为MS，0.5g/L Mes(pH5.7)，1.2％葡萄糖，40mg/L硫酸腺嘌呤，0.5g/L聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，0.5％琼脂糖和0.1mg/L萘乙酸，0.75mg/L BAP，0.01mg/LGA3，250mg/L羧苄青霉素，250mg/L triacillin，0.5mg/LAgNO3。\n-再生培养基A6为MS，0.5g/L Mes(pH5.7)，2％蔗糖，40mg/L硫酸腺嘌呤，0.5g/L PVP，0.5％琼脂糖，0.0025mg/LBAP和250mg/L triacillin。\n-健康的苗被转移至生根培养基A8：100-130ml半浓缩MS，1％蔗糖(pH5.0)，1mg/L异丁酸(IBA)，100mg/Ltriacillin加至1升容器内的300ml perlite(最终pH6.2)。\nMS代表Murashige和Skoog培养基〔Murashige和Skoog(1962)，植物生理15：473〕。\n下胚轴外植体经根癌农杆菌菌株C58C1RifR浸染，该菌株带有：-诸如由pMP90衍生而来的pGV4000之类的辅助Ti质粒(Koncz和Schell(1986)，Mol.Gen.Genet.204：383)，该质粒是通过将与T-DNA载体pGSV5具有同源性的2.5kb片段相连的细菌氯霉素抗性基因插入到pMP90中得到的。\n-来自pGSV5的T-DNA载体，含有位于T-DNA边界之间的实施倒3、4、5、6、或7的DZ选择性嵌合基因和嵌合标记基因。\n含有本发明的一种类型嵌合基因的转化体的选择系被用于进一步的交叉实验，产生出含有本发明嵌合基因组合的新系。\n转化体特征鉴定实施例8的转化的蔓菁植物，其核基因组中含有实施例3的DZ选择性嵌合基因，存在于经常规原位组织化学技术〔De Block和Debrouwer(1992)，植物杂志2：261；De Block和Debrouwer(1993)，植物(Planta)189：218〕检测的各种植物组织。在荚果的DZ层发现了高GUS活性，这由强染色反映，但在其它荚果组织中没有观察到背景标记，证明实施例3的启动子在荚果DZ内定向选择性表达。\n其核基因组中含有实施例4、5、6、7的单个DZ选择性嵌合基因或其组合的实施例8蔓菁植物转化体通过以下特征进行特征鉴定：1)通过分析靶基因产物(如细胞壁水解酶)表达量的减少或生化活性的降低(见Blumenkratz，supra)，通过监测异源基因表达(见Sambrook等，supra)，或通过测定发育过程中内源IAA和IAA偶联物的水平(见，实施例1)，发现生理过程的变化。\n2)在荚果衰老过程中DZ解剖学结构和DZ细胞壁的变化，通过光学显微镜和透射电子显微镜观察；荚果开裂后细胞分离程度，通过扫描电子显微镜分析分离的DZ表面(见，实施例1)。\n3)DZ及其种子散失阻力的机械性质的改变，通过分析单个荚果的散失阻力。这可以做Kadkol等〔(1986)，Aust.J.Bot.34：595〕所述的悬臂实验。被夹紧的荚果作为悬臂放置于“通用试验机”中，该机器具有由促动器驱动的十字型横杆，由载件向其施加恒力使得荚果偏转。这可以记录荚果开裂带开裂起始和延伸所需的力。或者，用处于受控振动(用伞形顶盖和机械装置模拟碰撞)的分离荚果首次测定开裂敏感性。振动包括固定高度下的水平摆动，在具有钢球的容器中进行以增强能量传递。另一种设计，开裂延伸的敏感性由磨擦测量来确定。此例中，沿着DZ的楔口之间磨擦产生的力被记录下来，并能够与选出的阻力极大的例子中的DZ组织进行比较。\n最后，筛选出来的个体系易于在田间进行性能分析。田间测试设计建立在个体系(转基因纯合体)的两位点三重复载培基础上。\n由不同转化植物得到的统计学显著数目的荚果分析显示与未转化对照植物相比其荚果开裂阻力增加。\n毫无疑问，本发明中DZ选择性启动子和重组DNA构建物的使用并不局限于实施例中特定植物的转化。这些启动子和重组DNA构建物对于任何作物的转化都是有用的，只要启动子在此作物中能够促使基因表达，优选这类表达在开裂带植物细胞中大量发生。\n并且，本发明中DZ选择性启动子的使用并不局限于控制本发明特定转录DNA区，而且能够用于控制植物体任何外源基因或DNA片段的表达。\n此外，本发明并不限于上述实施例中特定的DZ选择性启动子。更确切地，本发明还包括与实施例所述启动子相当(或等价)，可用于控制结构基因至少在开裂带植物细胞中具实质选择性表达的启动子。事实上，实施例中DZ选择性启动子的DNA序列可以修改，即用别的核苷酸取代其中一些核苷酸，和/或删除或插入一些核苷酸，只要这些改变不严重改变由启动子控制表达的时间、表达水平和组织的特异性，这可以通过对用改造的启动子控制下的嵌合gus基因转化得到的转基因植物进行GUS活性测定而得知(见，实施例3)。至多可改变启动子20％的核苷酸而不会影响启动子的特性。这些启动子可在标准条件下(Sambrook等，supra)用SEQ ID No 13的选择的DNA片段进行杂交分离，如上述。\n本文引用的所有出版物(包括专利出版物)以参考文献引入本文。\n序列表(1)一般信息(i)申请人(A)名称：植物遗传系统公司(B)街道：Jozef plateaustraat 22(C)城市：Gent(E)国家：比利时(F)邮政编码：B-9000(G)电话：32 9 235 84 54(H)传真：32 9 223 19 23(ii)发明名称：种子散失(iii)序列数：13(iv)计算机可读性形式：(A)媒介类型：软盘(B)计算机：IBM PC兼容(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS(D)软件：PatentIn Release # 1.0，#1.30版(EPO)(v)现申请信息：申请号：EP 95203328.0(2)SEQ ID No：1信息(i)序列特征(A)长度：1631碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA到mRNA(iii)假拟：无(iv)反义：无(vi)原始来源：(A)有机体：蔓菁\n(B)株系：cv.Topaz(ix)特征：(A)名称/密码：CDS(B)位置：95..1393(ix)特征：(A)名称/密码：-(B)位置：821..837(D)其他信息：/标记＝pG1/注＝“与寡核苷酸pG1相应的内切PG cDNA区”(ix)特征：(A)名称/密码：-(B)位置：95..163(D)其他信息：/标记＝SP/注＝“假定的内切-PG信号肽编码区”(ix)特征：(A)名称/密码：-(B)位置：884..900(D)其他信息：/标记＝PG3/注＝“与寡核苷酸PG3相应的内切PG cDNA区”(ix)特征：(A)名称/密码：-(B)位置：1059..1073(D)其他信息：/标记＝PG2/注＝“与寡核苷酸PG2互补的内切PG cDNA区”(ix)特征：(A)名称/密码：-(B)位置：1229..1245(D)其他信息：/标记＝PG5/注＝“与寡核苷酸PG5互补的内切PG cDNA区”(xi)序列描述：SE Q ID No：1：\nGGCACGAGAA AAACTGCAAA GAGTCTCATA TTAGTTCTTA CTCTCAAGAA TCAAACACAC      60TCTTTCTAAA AAGATTAGCG TTTCAAACCC CGAAATGGCC CGTTGTTTTG GAAGTCTAGC     120TGTTTTCTTA TGCGTTCTTT TGATGCTCGC TTGCTGCCAA GCTTTGAGTA GCAACGTAGA     180TGATGGATAT GGTCATGAAG ATGGAAGCTT CGAATCCGAT AGTTTAATCA AGCTCAACAA     240CGACGACGAC GTTCTTACCT TGAAAAGCTC TGATAGACCC ACTACCGAAT CATCAACTGT     300TAGTGTTTCG AACTTCGGAG CCAAAGGAGA TGGAAAAACC GATGATACTC AGGCTTTCAA     360GAAAGCATGG AAGAAGGCAT GTTCAACAAA TGGAGTTACT ACTTTCTTAA TTCCTAAAGG     420AAAGACTTAT CTCCTTAAGT CTATTAGATT CAGAGGCCCA TGCAAATCTT TACGTAGCTT     480CCAGATCCTA GGCACTTTAT CAGCTTCTAC AAAACGATCG GATTACAGTA ATGACAAGAA     540CCACTGGCTT ATTTTGGAAG ACGTTAATAA TCTATCAATC GATGGCGGCT CGGCGGGGAT     600TGTTGATGGC AACGGAAATA TCTGGTGGCA AAACTCATGC AAAATCGACA AATCTAAGCC     660ATGCACAAAA GCGCCAACGG CTCTTACTCT CTACAACCTA AAGAATTTGA ATGTGAAGAA     720TGTGAGAGTG AGAAATGCAC AGCAGATTCA GATTTCGATT GAGAAATGCA ACAATGTTGG     780CGTTAAGAAT GTTAAGATCA CTGCTCCTGG CGATAGTCCC AACACGGATG GTATTCATAT     840CGTTGCTACT AAAAACATTC GAATCTCCAA TTCAGACATT GGGACAGGTG ATGATTGTAT     900ATCCATTGAG GATGGATCGC AAAATGTTCA AATCAATGAT TTAACTTGCG GCCCCGGTCA     960TGGGATCAGC ATTGGAAGCT TGGGGGATGA CAATTCCAAA GCTTATGTAT CGGGAATTGA    1020TGTGGATGGT GCTACGCTCT CTGAGACTGA CAATGGAGTA AGAATCAAGA CTTACCAGGG    1080AGGGTCAGGA ACTGCTAAGA ACATTAAATT CCAAAACATT CGTATGGATA ATGTCAAGAA    1140TCCGATCATA ATCGACCAGA ACTACTGCGA CAAGGACAAA TGCGAACAGC AAGAATCTGC    1200GGTTCAAGTG AACAATGTCG TGTATCAGAA CATAAAAGGT ACGAGCGCAA CAGATGTGGC    1260GATAATGTTT AATTGCAGTG TGAAATATCC ATGCCAAGGT ATTGTGCTTG AGAATGTGAA    1320CATCAAAGGA GGAAAAGCTT CTTGCGAAAA TGTCAATGTT AAGGATAAAG GCACTGTTTC    1380TCCTAAATGC CCTTAATTAC TAAGCTGATT ATGTAATATA CATAAATACG TAGTATATNT    1440AATTATAGAT GCATGTATAT CGTTATCTAC GTATTGATTC TTGATATATA TAGAAAACTA    1500AAGATATATG GGAATATACA TACAATAGTT GAGATAATTG TTGTCTTGTA TATGATTCAC    1560TGAAGTTGAT TGCTTGTCCA TGAATAAATG AATAATATCA TTTCTCTAAA AAAAAAAAAA    1620AAAAAAAAAA A                                                         1631(2)SEQ ID No：2信息：(i)序列特征：(A)长度：27碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：其他核酸(A)描述：/dese＝“寡核苷酸PG1”\n(iii)假拟：无(iv)反义：无(ix)特征：(A)名称/密码：已修改的碱基(B)位置：16(D)其他信息：/修改碱基＝i/注＝“残基位点16处的N代表中性碱基肌苷(次黄嘌呤核苷)”(xi)序列描述：SE Q ID No：2CCAGGAATTC AAYACNGAYG GNRTNCA             27(2)SE Q ID No：3信息(i)序列特征：(A)长度：25碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：其他核酸(A)描述：/desc＝“寡核苷酸PG2”(iii)假拟：无(iv)反义：无(ix)特征：(A)名称/密码：已修改的碱基(B)位置：12(D)其他信息：/修改碱基＝i/注＝“残基位置12处的N代表中性碱基肌苷”(xi)序列描述：SE Q ID No：3：CGACGGATCC ANGTYTTDAT NCKNA               25(2)SEQ ID No：4信息：(A)长度：27碱基对(B)类型：核酸\n(C)链型：单(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：其他核酸(A)描述：/desc＝“寡核苷酸PG3”(iii)假拟：无(iv)反义：无(xi)序列描述：SEQ ID No：4GGACGAATTC ACNGGNGAYG AYTGYAT             27(2)SE Q ID No：5(i)序列特征(A)长度：27碱基对(B)类型：核酸(C)链型：单(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：其他核酸(A)描述：/desc＝“寡核苷酸PG5”(iii)假拟：无(iv)反义：无(ix)特征：(A)名称/密码：已修改的碱基(B)位置：13(D)其他信息：/修改的碱基＝i/注＝“残基位点13处的N代表肌苷”(ix)特征：(A)名称/密码：已修改的碱基(B)位置：16(D)其他信息：修改碱基＝inote＝“残基位点16处的N代表肌苷”(ix)特征(A)名称/密码：已修改的碱基\n(B)位置：19(D)其他信息：/修改碱基＝i/注＝“残基位点19处的N代表肌苷”(xi)序列描述：SEQ ID No：5：CACAGGATCC SWNGTNCCNY KDATRTT             27(2)SEQ ID No：6的信息：(i)序列特征：(A)长度：155碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：其他核酸(A)描述：/desc＝“由cDNA第一条链而来的PCR片段BPG32-26”(iii)假拟：无(iv)反义：无(vi)原始来源(A)有机体：蔓菁(B)株系：cv.Topaz(xi)序列描述：SEQ ID No：6TCGATTCAAA CCGGTTGCTC CAATGTGTAT GTTCACAATG TGAATTGTGG ACCAGGACAT   60GGCATCAGCA TAGGGAGTCT TGGTAAAGAC AGTACCAAAG CTTGTGTCTC CAATATAACA  120GTCAGAGATG TAGTTATGCA CAACACAATG ACTGG                             155(2)SEQ ID No：7信息：(i)序列特征：(A)长度：155碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双\n(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：其他核酸(A)描述：/desc＝“由cDNA第一条链而来的PCR片段KPG32-8”(iii)假拟：无(iv)反义：无(vi)最初来源：(A)有机体：蔓菁(B)株系：cv.Topaz(xi)序列描述：SEQ ID No：7TCTATTGGAG ACGGGACGAG AGACCTTCTT GTCGAAAGAG TTACATGCGG TCCGGGACAT     60GGAATCAGTA TTGGAAGCCT CGGTTTATAC GTGAAGGAGG AAGACGTCAC TGGCATCAGG    120GTCGTGAACT GCACCCTCAT AAACACTGAC AATGG                               155(2)SEQ ID No：8信息：(i)序列特征：(A)长度：219碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：其他核酸(A)描述：/desc＝“由cDNA第一条链而来的PCR片段LPG12-16”(ii)假拟：元(iv)反义：无(vi)最初来源：(A)有机体：蔓菁(B)株系：cv.Topaz.\n(xi)序列描述：SEQ ID No：8：\nTTTGGGAAGA AGTGACGGAG TCAAGATCCT TAACACATTC ATCTCCACCG GAGACGACTG     60TATCTCCGTT GGAGATGGGA TGAAGAACCT TCACGTGGAG AAAGTCACCT GCGGTCCAGG    120ACATGGAATC AGTGTCGGAA GCCTTGGAAG GTACGGAAAC GAACAGGATG TCAGCGGCAT    180TAGAGTCATA AACTGCACTC TCCAACAGAC TGACAACGG                           219(2)SEQ ID No：9的信息(i)序列特征：(A)长度：155碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：其他核酸(A)描述：/desc＝“由cDNA第一条链而来的PCR片段LPG32-24”(iii)假拟：无(iv)反义：无(vi)最初来源：(A)有机体：蔓菁(B)株系：cv：Topaz(xi)序列描述：SEQ ID No：9：TCCATTGGAG GCGGTACTGA AAATTTACTT GTCGAGGGCG TAGAATGTGG ACCAGGACAC     60GGTCTTTCCA TCGGAAGTCT TGGAAAGTAC CCTAATGAGC AACCAGTGAA AGGAATCACC    120ATTCGTAAAT GCATCATCAA GCATACCGAT AATGG                               155(2)SEQ ID No：10的信息：(i)序列特征：(A)长度：155碱基对(B)类型：核酸\n(C)链型：双(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：其他核酸(A)描述：/desc＝“由cDNA第一条链而来的PCR片段LPG 32-25”(iii)假拟：无(iv)反义：无(vi)最初来源：(A)有机体：蔓菁(B)株系：cv.Topaz(xi)序列描述：SEQ ID No：10：TCTGTTGGGG ACGGGATGAA AAACCTTCTT GTCGAAAGAG TTTCATGCGG TCCGGGACAC     60GGAATCAGTA TTGGAAGCCT CGGATTATAC GGGCACGAGG AAGACGTCAC TGGCGTCAAG    120GTCGTGAACT GCACCCTCAG AAATACTGAC AATGG                               155(2)SEQ ID No：11的信息：(i)序列特征：(A)长度：155碱基对(B)类型：核酸(C)链型：双(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：其他核酸(A)描述：/desc＝“由cDNA第一条链而来的PCR片段LPG32-32”(iii)假拟：无(iv)反义：无(vi)最初来源：(A)有机体：蔓菁(B)株系：cv.Topaz\n(xi)序列描述：SEQ ID No：11TCCGTGGGAG ATGGGATGAA GAATCTCCTC ATTGAGAAAG TTGTGTGCGG TCCAGGACAC     60GGAATCAGTG TTGGAAGCCT TGGAAGGTAC GGATGGGAGC AAGATGTCAC TGACATTAAC    120GTTAAGAACT GTACCCTCGA GGGAACCGAC AACGG                               155(2)SEQ ID No：12的信息(i)序列特征：(A)长度：100碱基对(B)类型：核酸(C)链：双(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：其他核酸(A)描述：/desc＝“pGSV5的T-DNA的DNA序列”(iii)假拟：无(iv)反义：无(ix)特征：(A)名称：/密码：-(B)位置：1..25(D)其他信息：/标记＝RB/注＝“pGSV5T-DNA的右边缘序列”(ix)特征：(A)名称/关键词：-(B)位置：26..75(D)其他信息：/标记＝MCS/润＝“多克隆位点”(ix)特征：(A)名称/关键词-(B)位置：76..100(D)其他信息：/标记＝LB\n/注＝“pGSV5 T-DNA的左边缘序列”(xi)序列描述：SEQ ID No.12：AATTACAACG GTATATATCC TGCCAGTACT CGGCCGTCGA CCGCGGTACC CGGGGAAGCT     60TAGATCCATG GAGCCATTTA CAATTGAATA TATCCTGCCG                          100(2)SEQ ID No：13的信息：(i)序列特征：(A)长度：2352bp(B)类型：核酸(C)链型：双(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组的)(iii)假拟：无(iv)反义：无(vi)原始来源：(A)有机体：蔓菁(B)株系：cv.Bridger(ix)特征：(A)名称/密码：-(B)位置：2329..2331(D)其他信息：/标记＝ATG/注＝“翻译起始密码子”(ix)特征：(A)名称/密码：-(B)位置：246..251(D)其他信息：/标记＝SphI/注＝“SphI限制酶识别位点”(ix)特征：(A)名称/密码：-(B)位置：10.51..1056\n(D)其他信息：/标记＝BamHI/注＝“BamHI限制酶识别位点”(ix)特征：(A)名称/密码：-(B)位置：1836..1841(D)其他信息：/标记＝HindII/注＝“HindII限制酶识别位点”(ix)特征：(A)名称/密码：-(B)位置：2327..2332(D)其他信息：/标记＝Ncol/注＝“序列突变形成NcoI限制酶识别位点(AAATGG变为CCATGG)”(ix)特征：(A)名称：/密码：-(B)位置：2219..2227(D)其他信息：/标记＝转录起始/注＝“含有推定的转录起始位点的区域”(xi)序列描述：SEQ ID No：13：ACGAGAATCG AGAGAAACAA AAACTCTCGT CGCAAGCACA AGTTTGGGGT AGGTTGTATG     60GTGTAAGAAT GACGGGCCAT AGAGAATAAT GTCTTCCACT CTTGCCAAAC GGACTGAAAC    120CATCAGTACA TAATCCAAGG TAGACATTTC TTCTCTCATA CGCAAAGTCG GGATACTTTG    180ATTGGAAATG CTTCCACGCT TTTGCATCTG AAGGATGTCT GATCTCACCA TCTGTTGAGT    240GCTCCGCATG CCATCTCATT GGTTGCGCTG TGCGTTCAGA CAGATACAAC CTCTGCAACC    300TTTCCGTCAA AGGTAAATAC CACATCCTTT TATATGGCAC TGGAACTCTT CCACTCGTAT    360CTTTATAACG AGGCTTTCCA CAAAATTTGC ATGTAACCCG CTGTTCATCC GCCCTCCAAT    420AAATCATGCA GTTGTCGCTG CATACATCTA TTACCTGATA CGCCAAGACC AGCTACGAGT    480TTCTGAACCT CGTAGTATGA ACCAGGAGCT ACATTATTCT CGGGTAGAAT ACCTTTTACA    540AAATCAGCAA TCGCATCCAC ACAGTCTTCA GCCAAATTAT AATCTTTTTC AATGCCCATC    600AATCTTGTAG CAGATGATAA AGCTGAATGA CCATCTCTGC AACCTTCGTA CAATGGTTGC    660TTTCCAGCAT CCAACATATC ATAAAATTTC CTAGCTTGTG CATTGGGTAA ATCTTCCCCT    720CTAAAATGAT CATTTACCAT CTGCTCAGTA CCTACACCAT AATCTACATC CGTTCTAATT    780\nGGTTCTTCTA ATCTAACCGC TGGCTGAGGT TCGCTAGTAC TACCATGTTC ATAATCAGTT       840TCCCCATGAT GATACCAAAT TTTGTAACTT CGTGTAAACC CACTCAAATA TAGATGAGTC       900CAAACATCCC ACTCTTTAAT AACTTTTCTA TTTTTACAAT TAGAGCAAGA ACATCTTAAC       960ATACATGTTT TTGCTTCCGG TTGTCGGTGAAC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