驱动直链淀粉合成酶基因GBSSI-3在香蕉果实中特异表达的启动子及其应用

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驱动直链淀粉合成酶基因GBSSI-3在香蕉果实中特异表达的\n启动子及其应用\n技术领域\n[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体而言，本发明涉及一种驱动直链淀粉合成酶基因GBSSI-3在香蕉果实中特异表达的启动子及其应用。\n背景技术\n[0002] 香蕉是热带、亚热带地区重要的经济作物，是仅次于柑橘的世界第二大水果。淀粉作为香蕉果实中的主要组成成分，又促使其被联合国粮农组织(FAO)认定为仅次于水稻、小麦、玉米之后的第四大粮食作物，是超过4亿人的口粮(Englberger et al.,2006)。然而，随着香蕉产业的快速发展和人们生活水平的迅速提高，对香蕉果实品质的要求也越来越高。\n将现代生物技术运用于香蕉品质改良中，可以解决一些用常规方法难以解决的问题。近年来，香蕉生物技术取得了很大的发展，一些控制重要农艺性状基因的相继分离并在香蕉中遗传转化成功(Sreedharan et al.,2013；Rustagi et al.,2015；Tripathi et al.,2015；\nElitzur et al.,2016)为用基因工程技术来改良香蕉果实品质奠定了良好的基础。\n[0003] 目前，我国香蕉优质果率不足30％，大多数香蕉果实后熟过程中出现硬心、糯性差、糖分含量偏低、抗性淀粉含量不稳定等品质问题。直链淀粉是香蕉果实的主要成分之一，它的含量直接决定着果实糯性、甜味及抗性淀粉含量等品质。直链淀粉合成酶基因(GBSS)编码结合在淀粉颗粒上的淀粉合成酶，又称为颗粒结合型淀粉合成酶，是影响直链淀粉合成的一个关键酶基因。前期研究发现GBSSI-3基因只在香蕉果实中高效表达，因此它是专一性表达的基因(Miao et al.,2014)。\n[0004] 植物基因工程中常用组成型启动子(如35S)来调控外源基因的表达，但存在一些缺点，如：35S启动子能促使外源基因在双子叶植物中获得较高的表达，但在单子叶植物中驱动基因表达能力不强；35S驱动的表达无明显的组织和器官专一性，产生大量异源表达产物甚至有毒物质，导致植物代谢失衡影响其正常生长发育甚至死亡。应用组织特异性启动子则可以避免这种影响。\n[0005] 因此，希望从香蕉直链淀粉合成酶基因中分离出能在香蕉果实中专一表达的启动子和表达调控元件，从而能在单子叶植物、特别是包括香蕉在内的淀粉转化型作物中驱动外源基因表达，从而提高作物产量，改善淀粉品质。\n发明内容\n[0006] 本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种驱动直链淀粉合成酶基因GBSSI-3在香蕉果实中特异表达的启动子及其应用。\n[0007] 本发明的第一个方面是提供一种启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。\n[0008] 其中，该启动子能够引导直链淀粉合成酶基因GBSSI-3在果实中特异性表达。\n[0009] 本发明的第一个方面是提供一种重组载体，其为含有本发明第一个方面所述的启动子的载体。\n[0010] 其中，所述载体为载体或病毒载体。\n[0011] 优选地，所述重组载体为利用Sac I和BamHI两个限制性酶切位点将权利要求1所述的启动子替换到pVKH-35S-GUS-pA表达载体的CaMV35S启动子处得到的表达载体。\n[0012] 本发明的第三个方面是提供如本发明第一个方面所述的启动子，或者本发明第二个方面所述的重组载体在提高香蕉果实直链淀粉含量中的应用。\n[0013] 本发明的第四个方面是提供一种本发明第一个方面所述的启动子的获得方法，其特征在于，以巴西蕉基因组DNA为模板，以SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示核苷酸为引物，通过PCR方法扩增获得。\n[0014] 本发明的第五个方面是提供一种引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。\n[0015] 本发明的第六个方面是提供一种本发明第一个方面所述的启动子的应用方法，其特征在于，用含有本发明第一个方面所述的启动子的载体转化香蕉果实薄片。\n[0016] 本发明的启动子(GBSSI-3启动子)能驱动目的基因在果实中高效表达，而在根、茎和叶片中不表达，针对GBSSI-3启动子进行克隆及功能研究，明确此启动子部分功能和驱动活性，为香蕉GBSSI-3基因启动子序列研究提供理论依据；同时为组织特异性启动子的开发和应用，为用基因工程手段提高香蕉果实直链淀粉含量，改良直链淀粉品质提供了候选果实特异性启动子；为明晰整个淀粉合成及调控网络提供理论依据，为满足人们对直/支链不同比例淀粉多样化需求提供了候选果实特异性启动子。\n附图说明\n[0017] 图1为GBSSI-3启动子扩增电泳结果图：M为DL2000DNA Marker，泳道A为GBSSI-3启动子PCR产物。\n[0018] 图2为pVKH-GBSSI-3双酶切验证电泳结果图：M为DL2000DNA Marker，泳道A为大片段为酶切后PVKH(1075bp片段为GBSSI-3启动子)，泳道B为pVKH-GBSSI-3重组质粒，泳道C为GBSSI-3启动子PCR产物。\n[0019] 图3为转化后香蕉不同组织GUS染色：Contol为阴性对照(水)转化后不同组织GUS染色，35S::GUS为阳性对照(pVKH-35S-GUS-pA)转化后不同组织GUS染色，GBSSI-3::GUS为pVKH-GBSSI-3转化后不同组织GUS染色。\n具体实施方式\n[0020] 下面参照附图，结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。\n[0021] 本发明实施例提供了一种驱动直链淀粉合成酶基因GBSSI-3在香蕉果实中特异表达的启动子(GBSSI-3启动子)，它是以巴西蕉基因组DNA为模板，以\n[0022] 5’-ACTGTTCACTTCTTCCACTGCCA-3’，\n[0023] 5’-GTCCATCCCATTTACTATTCCAG-3’，\n[0024] 为引物，通过PCR方法扩增获得的一种含有碱基序列为1075bp(图1)的香蕉GBSSI-\n3基因启动子序列，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。\n[0025] 本具体实施采用常规PCR方法克隆1075bp香蕉果实特异表达的直链淀粉合成酶基因GBSSI-3启动子序列，通过PlantCare软件对其进行分析，发现其除具有典型启动子基本顺式作用元件之外，还有ABA响应顺式作用元件、茉莉酸甲酯响应元件、赤霉素响应元件、光响应元件、干旱诱导MYB应答元件、光诱导MYB应答元件、胚乳表达响应元件等其他调控元件(见表1)。\n[0026] 表1GBSSI-3基因启动子元件分析\n[0027]\n[0028]\n[0029] 将上述GBSSI-3启动子序列，利用Sac I和BamHI两个限制性酶切位点将其替换到pVKH-35S-GUS-pA表达载体的CaMV35S启动子处，即得含有GBSSI-3启动子的表达载体pVKH-GBSSI-3。用表达载体pVKH-GBSSI-3通过基因枪转化至香蕉根、茎、叶、果实薄片。具体操作为：\n[0030] 重组载体构建：以pVKH-35S-GUS-pA为载体，构建以GBSSI-3启动子1075bp序列为驱动启动子，以GUS基因为报告基因，以潮霉素为筛选，在其两端加上Sac I和BamHI酶切位点设计5’和3’端引物。通过PCR方法扩增启动子序列，回收PCR产物，用Sac I和BamHI双酶切该产物和表达载体PVKH，将酶切获得的目的片段和载体大片段用T4DNA连接酶16℃连接过夜，转化、提取质粒、双酶切及测序验证正确后，即为pVKH-GBSSI-3重组载体(见图2)。\n[0031] 基因枪转化：利用基因枪将水(阴性对照)、pVKH-35S-GUS-pA(阳性对照)、pPVKH-GBSSI-3质粒DNA直接导入根、茎、叶、果实受体细胞，24～72h后观察该重组载体中GUS基因的瞬时表达情况，其具体实验方法步骤如下：\n[0032] (1)受体材料预处理：在基因枪轰击前先将外植体转入含渗透剂(0.2mol/L甘露醇和0.2mol/L山梨醇)的MS培养基预处理4-6h。\n[0033] (2)微弹载体制备：称取60mg M10钨粉(Bio-Rad)置1.5mL离心管中；加入1mL 70％的酒精，充分涡旋，然后静置15min，1500rpm离心5min；小心去除上清液，加入1mL无菌水,充分涡旋，1500rpm离心5min，去上清液，用无菌水重复冲洗三次；将金属颗粒转入1mL无菌水的50％甘油中；取50μL上述制备好并已涡旋的金属颗粒转入一无菌的1.5mL离心管中，按顺序加入5μL DNA(1μg/μL)、50μL 2.5mol/L CaCl2和20μL 0.1mol/L亚精胺(现配现用)；将混合物涡旋10min，然后用15000rpm离心5s，去除上清液；用140μL 70％乙醇冲洗上述沉淀物一次，再用100％乙醇冲洗一次，最后用48μL100％乙醇重新悬浮颗粒，并将离心管浸入超声波清洗器中3s，以分散金属颗粒。\n[0034] (3)装弹：将基因枪放置于一个较大型的超净工作台上，以利于无菌操作。用70％乙醇擦净真空室，用浸泡消毒法将可裂圆片、微粒子弹载体、阻挡网于70％酒精中消毒\n15min，然后用无菌滤纸吸干或吹干残余酒精；打开电源开关、真空泵及氦气瓶阀；将可裂圆片装入固定盖，旋紧；取6μL包被DNA的金属颗粒无水乙醇悬浮液(约含0.6μg质粒DNA和\n0.37mg的金属颗粒)点于微粒子弹载体中心，立即在干燥器中干燥，或于工作台上吹干；将载有微粒子弹的微粒子弹载体及阻挡网装入微粒子弹发射装置中；将欲转化的靶组织平铺在一个由液体培养基润湿过的1-2层滤纸或含有固体培养基的9cm培养皿中心。\n[0035] (4)轰击：按VAC键，当真空度达到所需要值(600-760mmHg，1mmHg＝133.332Pa)时，将VAC键转到HOLD位置；按FIRE键使氦气压力达到适当位置，约花费12s打一枪，再按VENT键，取出样品，通常每四枪打二次。\n[0036] (5)外植体材料培养：将轰击后的外植体转入愈伤组织诱导培养基或芽分化培养基中于28℃、黑暗条件下培养。该培养基中不添加卡那霉素等选择压力，以利于受轰击细胞的恢复及充分表达外源基因。\n[0037] GUS染色方法：将上述材料黑暗放置48h后，将其浸泡在染色液(50mmol/L磷酸钠缓冲液(pH7.0)中含有：0.1mol/L K3[Fe(CN)6]，0.1mol/L K4[Fe(CN)6]，10mmol/L Na2EDTA，\n0.001％(v/v)Triton X-100，20％甲醇，0.5mg/mL X-Gluc)中，于25-37℃保温1h至过夜；然后将外植体材料转入70％乙醇中脱色2～3次，至阴性对照材料呈白色；于显微镜下观察靶启动子所调控的GUS基因的瞬时表达情况，结果如图3所示。结果表明，染色部位在果实中，而根、茎、叶中没有，说明GUSSI-3基因启动子在转基因香蕉中能够引导外源基因在果实中特异表达，由此可见，本发明的GUSSI-3基因启动子能够驱动外源基因特异性表达，从而提高作物产量，改善淀粉品质。\n[0038] 以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。