一种邻苯二甲酸二辛酯半抗原及人工抗原合成方法及其应用

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一种邻苯二甲酸二辛酯半抗原及人工抗原合成方法及其应用\n技术领域\n[0001] 本发明涉及免疫学检测技术领域，更具体的说，本发明涉及一种邻苯二甲酸二辛酯半抗原及人工抗原合成方法及其应用。\n背景技术\n[0002] 邻苯二甲酸二(α-乙基己)酯(Di(2-ethylhexyl)phthalate)，英文缩写DEHP，又名邻苯二甲酸二辛酯，分子量为390.5，25℃时该品在水中溶解度<0.01％，溶于大多数有机溶剂和烃类，其结构式为：\n[0003]\n[0004] DEHP属邻苯二甲酸酯类塑化剂，是一种工业原料，是目前使用最广和产量最大的塑化剂。DEHP会被食物及水所吸收，与含有DEHP容器接触的食品也会受到污染，也有不法厂商将其作为添加剂用于食品生产。\n[0005] 世界卫生组织指出邻苯二甲酸酯类进入人体和动物体内会有类似雌激素的作用，会干扰内分泌，会造成内分泌失调，阻害生物体生殖机能，包括生殖率降低、流产、天生缺陷、异常的精子数、睾丸损害，还会引发恶性肿瘤或造成畸形儿。临床研究表明服用或长期暴露于DEHP中也会对于心肌细胞有显著的影响，导致心脏不规则节律。因此，DEHP在食品中属于违禁的工业原料。\n[0006] 对食品中的邻苯二甲酸酯类塑化剂的检测主要以理化分析法(如GC-MS、HPLC)为主。然而应用仪器方法时，其灵敏度受样品的净化、浓缩等步骤的影响很大，测定方法复杂、繁琐，检测通量小，需要培养专业人员进行检测，检测成本昂贵，不能实现大批量样品的快速检测分析。因此，有必要研制更加简单快捷方便的检测方法。\n[0007] 免疫检测方法，是目前食品安全快速检测的重要方法之一，检测成本很低，使用简单，适合大量样品的筛选检测，已经在食品安全检测中发挥了重要作用。\n发明内容\n[0008] 本发明解决的技术问题是提供一种邻苯二甲酸二辛酯半抗原及人工抗原合成方法及其应用，为建立免检检测方法提供免疫抗原和包被抗原及抗体制备奠定基础。\n[0009] 为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：\n[0010] 一种DEHP半抗原的分子结构式为：\n[0011]\n[0012] n为1～6的自然数。\n[0013] 所述的DEHP半抗原与载体蛋白结合，得到DEHP人工抗原，其分子结构式为：\n[0014]\n[0015] n为1～6的自然数；所述的n优选为2；所述的载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白或血蓝蛋白。\n[0016] 所述DEHP半抗原的合成方法，包括以下步骤：\n[0017] (1)按摩尔比为2:1～3:1将浓硝酸与DEHP置于圆底烧瓶中，冰浴条件下滴加5倍于浓硝酸体积的浓硫酸，磁力搅拌，反应至室温，再60℃回流反应5h，期间用TLC监控，用1moL/L的氢氧化钠溶液中和反应液至弱碱性，乙酸乙酯萃取3次，有机相于旋转蒸发仪上减压蒸干得到粗的硝化产物DEHP-NO2，过硅胶柱，收集洗脱液为V/V为2:1～3:1的氯仿/环己烷洗脱相，洗脱液浓缩至干，得到纯化的硝化产物DEHP-NO2；\n[0018] (2)按摩尔比为1:3:3将DEHP-NO2、NH4Cl、铁粉置于圆底烧瓶中，添加到适量的70％乙醇溶液中，磁力搅拌，50℃回流反应5h，期间用TLC监控；反应结束后，向反应液中加入\n100mL无水乙醇，滤去铁粉，收集滤液，于旋转蒸发仪浓缩近干；向浓缩液中加30mL水，用乙酸乙酯萃取3次，收集有机相，蒸干，得到粗产物DEHP-NH2；过硅胶柱，收集洗脱液为V/V为5:\n1～4:1的氯仿/甲醇洗脱相，洗脱液浓缩至干，得到纯化的还原产物DEHP-NH2；\n[0019] (3)按摩尔比为1:2～1:3将DEHP-NH2与卤代酸盐置于圆底烧瓶中，并将其混合物用少量的无水乙醇溶解，同时加入与卤代酸盐等摩尔量的碳酸钾，在60℃下回流反应，在反应过程中加入适量的碘化钾作为催化剂，回流搅拌反应5h后，停止反应。过滤反应混合物得到黄棕色滤液，浓缩得到棕黄色油脂状物质。过硅胶柱，收集洗脱液为V/V为4:1～5:1的氯仿/甲醇洗脱相，洗脱液浓缩至干，得到产物即为目标半抗原。\n[0020] 所述的浓硝酸为65％的硝酸，卤代酸盐为卤代酸钠，其结构式为R-(CH2)n-COONa，其中R可为Cl或Br，n＝1～6\n[0021] 所述DEHP人工抗原的制备方法为活泼脂法与混合酸酐法。\n[0022] 所述活泼酯方法包括以下步骤：\n[0023] (1)将50μmol的DEHP半抗原溶解于1mL的DMF中，然后在该溶液里加入等摩尔的DCC和NHS，室温避光反应过夜；\n[0024] (2)4℃离心去除沉淀，取上清液，并将其缓慢加入到5mL pH 9.5的碳酸缓冲液中，其缓冲液含有载体蛋白BSA或OVA，其中载体蛋白的浓度为10～15mg/mL，在4℃下反应过夜；\n[0025] (3)将步骤(2)中的反应液装入透析袋，用0.9％的生理盐水透析3天，得到人工抗原。\n[0026] 所述混合酸酐法包括以下步骤：\n[0027] (1)将0.1mmol DEHP半抗原溶于1mL DMF中，加入80μL正三丁胺，冰浴下缓慢滴加\n0.15mmol氯甲酸异丁酯，4℃搅拌反应1h，此为甲液；\n[0028] (2)将60mg载体蛋白BSA或OVA溶于5mL 1mol/L pH 9.6的碳酸氢钠缓冲液中，此为乙液；\n[0029] (3)将甲液缓慢滴加到乙液中，4℃磁力搅拌反应过夜，待反应完成后，装入透析袋，然后用0.9％的生理盐水透析3天，得到人工抗原。\n[0030] 所述的DEHP人工抗原可应用于制备抗DEHP多克隆抗体或单克隆抗体的制备。\n[0031] 本发明的有益效果是：\n[0032] 由于DEHP是小分子物质(分子量小于1000Da)，本身不具备免疫原性，必须与大分子蛋白偶联制备为人工抗原，才能使动物产生抗体。由于DEHP本身不具备活性基团，不能与大分子蛋白偶联，因此需要对DEHP进行分子改造，引入-NH2和-COOH等活性基团，合成DEHP半抗原。本发明以DEHP为原料，与硝酸、氯化铵、卤代酸盐反应制得DEHP半抗原；通过活泼酯法或混合酸酐法将DEHP半抗原与载体蛋白偶联制得DEHP人工抗原，该人工抗原可用于动物免疫制备抗DEHP的特异性抗体，对建立检测DEHP的ELISA分析方法，具有重要现实意义，即为建立免检检测方法提供免疫抗原和包被抗原及抗体制备奠定基础。\n具体实施方式\n[0033] 实施例1\n[0034] DEHP半抗原合成\n[0035] 当n＝1时，DEHP半抗原制备的路线如下：\n[0036]\n[0037] 将4mL DEHP(10mmoL)与1mL 65％的浓硝酸(20mmoL)置于圆底烧瓶中，冰浴条件下加入5mL浓硫酸，磁力搅拌，反应至室温，再60℃回流反应5h，期间用TLC监控。反应结束后，用1moL/L的氢氧化钠溶液中和反应液至弱碱性，乙酸乙酯萃取3次，有机相于旋转蒸发仪上减压蒸干得到粗的硝化产物DEHP-NO2，过硅胶柱，收集洗脱液为V/V为2:1～3:1的氯仿/环己烷洗脱相，洗脱液浓缩至干，得到纯化的硝化产物DEHP-NO2。\n[0038] 1mmoL DEHP-NO2、3mmoLNH4Cl、3mmoL铁粉置于圆底烧瓶中，添加到20mL 70％的乙醇溶液中，磁力搅拌，50℃回流反应5h，期间用TLC监控。反应结束后，向反应液中加入100mL无水乙醇，滤去铁粉，收集滤液，于旋转蒸发仪浓缩近干；向浓缩液中加30mL水，用乙酸乙酯萃取3次，收集有机相，蒸干，得到粗产物DEHP-NH2；过硅胶柱，收集洗脱液为V/V为5:1～4:1的氯仿/甲醇洗脱相，洗脱液浓缩至干，得到纯化的还原产物DEHP-NH2。\n[0039] 称取1mmoL DEHP-NH2(406mg)与2mmoL氯乙酸钠(0.232g)置于圆底烧瓶中，并将其混合物用10mL的无水乙醇溶解，同时加入的0.276g碳酸钾，在60℃下回流反应，在反应过程中加入适量的碘化钾作为催化剂，回流搅拌反应5h后，停止反应。过滤反应混合物得到黄棕色滤液，浓缩得到棕黄色油脂状物质。过硅胶柱，收集洗脱液为V/V为4:1～5:1的氯仿/甲醇洗脱相，洗脱液浓缩至干，得到产物即为目标半抗原。\n[0040] 实施例2\n[0041] 人工抗原的合成\n[0042] 2.1 免疫抗原的合成与纯化：\n[0043] 免疫抗原采用活泼酯法。将50μmol的DEHP半抗原溶解于1mL的DMF中，然后在该溶液里加入等摩尔的DCC和NHS，室温避光反应过夜，4℃离心去除沉淀，取上清液，并将其缓慢加入到5mL pH 9.5的碳酸缓冲液中，其缓冲液含有载体蛋白BSA，其中载体蛋白的浓度为\n10mg/mL。将混合物在4℃下反应过夜，待反应完成后，装入透析袋，然后用0.9％的生理盐水透析3天。得到透析好的溶液即为人工免疫抗原DEHP-BSA。\n[0044] 2.2 包被抗原的合成与纯化：\n[0045] 包被抗原采用混合酸酐法。将0.1mmol DEHP半抗原溶于1mL DMF中，加入80μL正三丁胺，冰浴下缓慢滴加0.15mmol氯甲酸异丁酯，4℃搅拌反应1h，此为甲液。将60mg载体蛋白OVA溶于5mL 1mol/L pH 9.6的碳酸氢钠缓冲液中，此为乙液。将甲液缓慢滴加到乙液中，4℃磁力搅拌反应过夜，待反应完成后，装入透析袋，然后用0.9％的生理盐水透析3天。得到透析好的溶液即为人工包被抗原DEHP-OVA。\n[0046] 实施例3：\n[0047] 人工抗原的鉴定：\n[0048] 按照分光光度法测定半抗原、载体蛋白以及偶联物的最大吸收值，计算偶联物的偶联比。在200-400nm之间分别对原料、BSA、OVA及偶联物紫外吸收光谱进行扫描，鉴定半抗原与载体蛋白是否发生偶联。同时估算半抗原和载体蛋白偶联比，经计算结果如下：DEHP-BSA为18.5:1，DEHP-OVA为6.8:1。\n[0049] 虽然本发明的较佳实施例已揭露如上，本发明并不受限于上述实施例，任何本技术领域内的技术人员，在不脱离本发明所揭露的范围内，当可作些许的改动与调整。