一种藻毒素金标检测试纸盒及其制备方法

1、一种藻毒素金标检测试纸盒，其特征是由盒壳体(1)和试纸条(2)所 组成，试纸条被封装在盒壳体内，试纸条用聚氯乙烯或聚乙烯作背衬，在试纸条 一端的注样区粘贴吸附胶体金-抗藻毒素单克隆抗体结合物的玻璃纤维膜(3)；在 试纸条中间的测试区粘贴硝酸纤维素膜(4)，硝酸纤维素膜和玻璃纤维膜连接处 有一小段重叠区，玻璃纤维膜的一小段重叠在硝酸纤维素膜上，在试纸条另一端 吸水区粘贴吸水纸(7)；在硝酸纤维素膜上从注样区到吸水区的方向，依次喷涂 藻毒素-牛血清白蛋白作检测线(5)，喷涂羊抗鼠Ig G作质控线(6)，然后，再 用1％牛血清白蛋白封闭硝酸纤维素膜；盒壳体上面开有注样孔(8)，观测孔(9)， 注样孔的位置对应于试纸条注样区的玻璃纤维膜，观测孔的位置对应于试纸条的 测试区，使能观察到检测线和质控线的变色；
吸附胶体金-抗藻毒素单克隆抗体结合物的玻璃纤维膜的制备：将胶体金-抗 藻毒素单克隆抗体结合物稀释至0.5-2μg/mL，放入10mm×300mm玻璃纤维膜， 浸泡10-20分钟，37℃烘干，4-8℃保存，粘贴在背衬一端的注样区；
检测线：在硝酸纤维素膜上喷涂浓度为100-500μg/mL藻毒素-牛血清白蛋 白做检测线；
质控线：喷涂浓度为50-200μg/mL羊抗鼠Ig G；
封闭硝酸纤维素膜：用1％牛血清白蛋白封闭硝酸纤维素膜。
2、根据权利要求1所述的检测试纸盒，其特征是硝酸纤维素膜厚度为120 μm，蛋白质负载量5-20μg/cm2。
3、根据权利要求1所述的检测试纸盒，其特征是聚氯乙烯或聚乙烯背衬厚 度为100μm。

技术领域\n一种藻毒素金标检测试纸盒及其制备方法，属于生物工程产品技术领域。\n背景技术\n藻毒素(Microcystins，简称MCYST或MC)已成为环境水体中被普遍关注 的污染物之一，中国科学院《2002年科学发展报告》中专门论述了淡水中“水华” 造成的最大危害是饮用水源受到威胁。藻毒素通过食物链影响人类的健康，蓝藻 “水华”的次生代谢产物MC能损害肝脏，具有促癌效应，直接威胁人类的健康 和生存。100多年来，藻毒素引起的人畜中毒事件引起了世界范围内的关注，加 拿大，英国，美国，澳大利亚，南非等国都有报道。我国环境白皮书公布的《环 境问题的现状资料》中资料十：达赉湖“祸水”揭秘，指出近30年来达赉湖地区 的人畜中毒死亡事件都是“微囊藻毒素”引起的。国内外许多文献都报道了藻毒 素与原发性肝癌的相关性。\n由于目前缺乏防止藻类“水华”发生的有效措施，因此要预防和消除藻毒素 对人畜的危害，监测和控制藻毒素在饮用水中的限量是行之有效的方法，国家《生 活饮用水水质卫生规范》中规定MC-LR的限值为0.001(mg/L)，而要保证饮用水 中藻毒素的限值，建立快速，灵敏的藻毒素分析方法至关重要。\n藻毒素是一种七肽，为单环结构，1位是D-丙氨酸，2，4位是可变的左旋氨 基酸基团，6位是γ连接的D-氨基酸，3位是特殊的氨基酸：β连接的D-红细胞 -β-甲基天门冬氨酸(MeAsp)，5位是(2S，3S，8S，9S)-3-氨基-9-甲氧基-2， 6，8-三甲基-10-苯基-4，6-二烯酸(Adda)，7位是N-甲基脱氢丙氨酸(Mdha)， 整个结构可写作(-D-Ala-L-D-MeAsp-L-Z-Adda-D-Glu-Mdha)。不同种类的MC 的化学组成主要区别在于2，4位的2种左旋氨基酸的不同和MeAsp、Mdha基团 的甲基化或去甲基化。2，4位氨基酸也是不同亚型的藻毒素的命名依据，最常见 的MC-LR，其中L代表亮氨酸、R代表精氨酸，因此，分析方法的研究也主要针 对MC-LR来建立的。\n目前，国内外检测MC的方法有以下几类。(一)化学分析法：包括薄层色 谱法(TLC)，液相色谱法(LC)，液-质联用法(HPLC-MS)，毛细管电泳法(CE) 以及示差脉冲极谱法。(二)生物法：包括生物鉴定法、微毒素检测法和蛋白磷 酸(PP1/PP2)抑制法。(三)免疫化学法，包括放射免疫法(RIA)，间接竞争酶 联免疫法(idc-ELISA)，直接竞争酶联免疫法(dc-ELISA)，夹心免疫法 (Sandwich-ELISA)。在国内应用较广泛的是高效液相色谱法，最低检测浓度为 0.01μg/mL。这些方法存在样品前处理繁琐、需要检测仪器配合、检测时间较长 和检验人员需要较高的素质以及受过良好的培训、不适合野外操作等缺点。\n发明内容\n本发明的目的是提供一种藻毒素金标检测试纸盒及其制备方法，藻毒素金标 检测试纸条属于生物工程产品，用于环境资源中水资源保护。实际应用中，主要 用于检测自然环境中水体、饮用水和藻类制品中藻毒素(MC-LR)的含量。\n本发明的技术方案：检测原理是样品中的藻毒素(MC-LR)首先与胶体金颗 粒表面的抗MC-LR单克隆抗体反应，如果样品中藻毒素的含量超过限值，胶体 金的抗体位点将不再有剩余，当胶体金颗粒层析经过检测线时，胶体金颗粒将不 会停留在该线的所在位置，继续上行时与控制线上喷涂的羊抗鼠IgG反应，呈现 出胶体金的红色。如果样品中不含藻毒素，或藻毒素含量低于限值，胶体金表面 的抗体将与检测线上的化合物反应呈现出红色，质控线也呈现红色。\n藻毒素金标检测试纸盒的结构是由盒壳体和试纸条所组成，试纸条被封装在 盒壳体内，试纸条用聚氯乙烯或聚乙烯作背衬，在试纸条一端的注样区粘贴吸附 胶体金-抗藻毒素单克隆抗体结合物的玻璃纤维膜；在试纸条中间的测试区粘贴硝 酸纤维素膜，硝酸纤维素膜和玻璃纤维膜连接处有一小段重叠区，玻璃纤维膜的 一小段重叠在硝酸纤维素膜上，在试纸条另一端吸水区粘贴吸水纸；在硝酸纤维 素膜上从注样区到吸水区的方向，依次喷涂藻毒素-牛血清白蛋白作检测线，喷涂 羊抗鼠Ig G作质控线，然后，再用1％牛血清白蛋白封闭硝酸纤维素膜；盒壳体 上面开有注样孔，观测孔，注样孔的位置对应于试纸条注样区的玻璃纤维膜，观 测孔的位置对应于试纸条的测试区，使能观察到检测线和质控线的变色。\n吸附胶体金-抗藻毒素单克隆抗体结合物的玻璃纤维膜的制备：将胶体金-抗 藻毒素单克隆抗体结合物稀释至0.5-2μg/mL，放入10mm×300mm玻璃纤维膜， 浸泡10-20分钟，37℃烘干，4-8℃保存，粘贴在背衬一端的注样区；在背衬中 间检测区粘贴硝酸纤维素膜，在硝酸纤维素膜上喷涂浓度为100-500μg/mL藻 毒素-牛血清白蛋白做检测线，喷涂浓度为50-200μg/mL羊抗鼠Ig G作质控线， 再用1％牛血清白蛋白封闭硝酸纤维素膜；在背衬另一端吸水区粘贴吸水纸；所 得藻毒素金标检测试纸条包封在上面开有注样孔和观测孔的盒壳体内。硝酸纤维 素膜厚度为120μm，蛋白质负载量5-20μg/cm2。聚氯乙烯或聚乙烯背衬厚度 为100μm。试纸条的尺寸约为(55-65)mm×(3-5)mm，检测线和质控线 的宽度为0.5-1mm。\n本发明的有益效果：本发明采用金标检测法，用于检测自然环境中水体、饮 用水和藻类制品中藻毒素的含量。检测时只需将检测样品滴入注样孔中，稍许， 即可在观测区中观察检测线和质控线的变色情况，确定样品中藻毒素含量是否达 标。如果检测线和质控线均呈红色，则样品中藻毒素含量达标，如果检测线不变 色，仅质控线变色，则样品中藻毒素含量超标。与现有测试方法相比，不需要大 型检测仪器，样品不需要前期处理，试纸盒制作方便，检测快速、准确、明显、 灵敏度高。\n附图说明\n图1藻毒素金标检测试纸盒检测示意图。\n图2藻毒素金标检测试纸条结构图。\n1、盒壳体，2、试纸条，3、玻璃纤维膜，4、硝酸纤维素膜，5、检测线，6、 质控线，7、吸水纸，8、注样孔，9、观测孔。\n具体实施方式\n1、抗原MC-KLH的合成：将1mg MC-LR溶解于1mL 0.01M碳酸盐缓冲液 中(pH9.6)，将6mg血蓝蛋白(KLH)溶解于6mL0.01M碳酸盐缓冲液中，将 两种溶液混合均匀，再加入碳化二亚胺(EDC)溶液1mL(1.5mgEDC溶解于1mL 0.01M碳酸盐缓冲液中)，混合均匀，室温反应2小时。将溶液移入透析带中，4 ℃，0.01M磷酸盐缓冲液(PBS)透析液内透析，透析好的溶液分装，-20℃保 存。\n2、MC-LR单克隆抗体的制备\n1)免疫动物：对6-8周的雌性小鼠，首次免疫用0.1mg MC-KLH与等量的 完全福氏佐剂混合均匀，腹腔注射。4周后，再用0.05mg MC-KLH与不完全福氏 佐剂混匀，腹腔注射。此后，间隔两周加强免疫一次，方法同前。12周后， 0.05mgMC-KLH脾内加强免疫。72小时后，杀死小鼠，取脾制备脾细胞悬液。\n2)细胞融合：免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞(Sp2/0)以10∶1混合，用含 20％胎牛血清RPMI-1640培养液清洗细胞，4000kD聚乙二醇(PEG)为融合剂 融合。离心，移去上清液。融合细胞悬浮于含20％胎牛血清的黄嘌呤-氨基蝶呤- 胸腺嘧啶核苷(HAT)培养液中，稀释至适当浓度(2×106脾细胞/mL)，加入预 先制备的96孔细胞培养板(Balb/c小鼠腹腔巨噬细胞为饲养细胞，2×104个/孔)， 放入CO2孵育箱中37℃培养，当镜检杂交瘤克隆生长达1/2视野时，取上清液用 间接竞争ELISA法进行筛选得到适合的杂交瘤细胞。\n3)克隆化：采用准确计数稀释法，得到杂交瘤细胞株。冻存。\n4)单克隆抗体的制备：将培养的杂交瘤细胞离心，弃去上清液，用生理盐 水将杂交瘤细胞悬浮，并将细胞数调至2×106个/mL，每只Balb/c小鼠腹腔注射 1mL，对侧腹腔注射1mL降植烷和不完全福氏佐剂，12天后收集腹水。将腹水 离心(3000rpm，20分钟)收集上清液。用33％饱和硫酸铵和50％饱和硫酸铵分 级沉淀，得到抗MC-LR单克隆抗体。\n3、抗体与胶体金结合原液的制备\n1)胶体金的制备：取0.01％的氯金酸100mL，加热煮沸，然后快速加入1％ 的枸橼酸三钠1.0mL，继续煮沸5分钟。用0.1mol/L K2CO3和0.1mol/L HCl调整 pH至8.0-8.6。\n2)抗体准备：抗MC-LR单克隆抗体用葡聚糖凝胶(Sephadex)G-25脱盐。\n3)抗体与胶体金结合原液的制备：取纯化好的抗MC-LR单克隆抗体加入胶 体金液中，体积比为1∶50，终浓度为30-45μg/mL，室温搅拌均匀。加入10％ 牛血清白蛋白(BSA)，终浓度为0.4％，再加入10％PEG(MW20000)，终浓度 为0.2％，室温搅拌均匀。加入与胶体金-抗体结合物液同体积的10％NaCl，静置 1小时。12000rpm离心60分钟，沉淀溶解于适量0.01M PBS液中，用0.45μm 滤膜过滤，终浓度为20-25μg/mL。用0.01M PBS稀释到所需浓度0.5-2μg/mL， 用于浸泡玻璃纤维膜使之吸附。\n4、抗原MC-BSA的合成：将1mg MC-LR溶解于1mL 0.01M碳酸盐缓冲液 中(pH9.6)，将3mg牛血清白蛋白(BSA)溶解于5mL0.01M碳酸盐缓冲液中， 将两种溶液混合均匀，再加入20mg碳化二亚胺(EDC)，混合均匀，室温反应2 小时。将溶液移入透析带中，4℃，0.01M磷酸盐缓冲液(PBS)透析液内透析， 透析好的溶液分装，-20℃保存。用0.01M PBS稀释到所需浓度100-500μg/mL， 用于喷涂检测线。\n5、羊抗鼠Ig G：购买于上海华美试剂公司。羊抗鼠Ig G用0.01M PBS稀释 到所需浓度50-200μg/mL，用于喷涂质控线。