干扰素在制备用于治疗哺乳动物肿瘤病的药剂中的应用

1.干扰素在制备用于通过与受体动物的口和咽的粘膜接触的给 药方式以每天1500IU到20×106IU的量治疗哺乳动物肿瘤病的 药剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其中所述的肿瘤病是多发性骨髓 瘤、多毛细胞白血病、慢性的骨髓性白血病、低级淋巴瘤、皮 肤T细胞淋巴瘤、癌样肿瘤、宫颈癌、包括卡波西氏肉瘤在内 的肉瘤、肾肿瘤、包括肾细胞癌、肝心包癌、鼻咽癌、血液恶 性病变、结肠直肠癌、恶性胶质瘤、喉乳头状瘤、肺癌、结肠 癌、恶性黑色素瘤在内的癌症，或包括恶性脑肿瘤在内的脑肿 瘤。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其中该药剂包括单剂量的干扰 素。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其中该药剂包括不诱导病理学 反应但足以引发相当于单剂量的治疗反应的多个小剂量的干 扰素。
5.根据权利要求1或2所述的应用，其中该药剂在一段时间里提供 虽不会诱导病理学反应但足以引发相当于单剂量的抗肿瘤反 应的干扰素剂量的连续给药。
6.根据权利要求1或2所述的应用，其中该药剂包括另一种细胞因 子或干扰素诱导剂。
7.根据权利要求1或2所述的应用，其中该药剂适合于每天1× 104IU至20×106IU干扰素的给药。
8.根据权利要求7所述的应用，其中该药剂适合于每天1×104IU 到1×106IU干扰素的给药。
9.根据权利要求8所述的应用，其中该药剂包括另一种用于同时、 分别或相继治疗的治疗剂。
10.根据权利要求9所述的应用，其中所述治疗剂选自细胞生长抑 制剂、抗肿瘤剂和抗血管生成剂。
11.根据权利要求10所述的应用，其中所述哺乳动物是人并且所述 干扰素是人干扰素。
12.根据权利要求11所述的应用，其中所述干扰素是I型干扰素。
13.根据权利要求12所述的应用，其中所述干扰素选自IFN-α、 IFN-β、IFN-ω、复合IFN及其混合物。
14.根据权利要求13所述的应用，其中所述I型干扰素是IFN-α。
15.根据权利要求11所述的应用，其中所述干扰素是II型干扰素。
16.根据权利要求15所述的应用，其中所述II型干扰素是IFN-γ。
17.根据权利要求12所述的应用，其中所述干扰素是重组物。
18.根据权利要求15所述的应用，其中所述干扰素是重组物。

本发明涉及通过口腔粘膜投用干扰素刺激哺乳动物宿主抗病理 学条件的防御机制的方法。具体地说，本发明是适用于治疗肿瘤性 疾病的方法。\n本发明的背景技术\nα干扰素被广泛用于治疗包括多毛细胞白血病、慢性的骨髓性白 血病、低级淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤在内的各种血液恶性病变， 以及诸如肾细胞癌、黑色素瘤、类癌肿瘤和与爱滋病相关的卡波西 氏肉瘤之类的实体瘤(Gtutterman，J.U.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 199491：1198-1205)。通常，α干扰素(IFN-α)的抗肿瘤效果经胃 肠道外注射给药时往往要在数百万单位的高剂量下才能看到。α干 扰素是一种还包括β和ω干扰素的I型干扰素。虽然有许多给药途径 通常可用于I型干扰素给药，包括静脉内、皮下、肌肉内、局部和 损伤部位内注射，但是，一般不使用口服途经给药，因为人们认为 干扰素是一种因蛋白水解酶失活的并且在胃肠道内不能以其天然 形式被吸收的蛋白质。确实许多研究在口服给药之后在血液中没有 检测到干扰素(Cantell and Pyhala，J.Gen.Virol.，1 973 20：97-104； Wills等人，J.IFN Res.，19844：399-409；Gilson等人，J.IFN Res.， 1985 5：403-408)。\n到目前为止已有许多关于作为鼻腔喷雾剂或液体口服制剂给药 的低剂量干扰素在治疗各种病症(特别是感冒)中的效果的报导。 一系列专利说明书描述了使用低剂量口服给药的异源干扰素治疗 牲畜的感染性鼻气管炎(″运输热″)、治疗猫白血病，以及治疗其 他病症，增强疫苗的效力；改善食物利用效率；和预防牛泰勒氏梨 浆虫病。分别参阅美国专利No.4,462,985、澳大利亚专利No. 608519、澳大利亚专利No.583332和美国专利No.5,215,741。另外， 美国专利No.5,017,371揭示了以这种方式用干扰素治疗化疗或放疗 的副作用。在这些专利说明书中，所用的干扰素都是借助Cantell的 方法制备的，加在磷酸盐缓冲盐水中以每磅体重0.01至5IU的剂量给 药的人干扰素。虽然这些说明书中都提议如此低剂量的干扰素经口 咽粘膜，优选以适合与口腔粘膜长时间接触的形式给药对治疗包括 肿瘤在内的各种病症可能是有效的，但有关治疗运输热、猫白血 病、犬细小病毒感染及泰勒氏梨浆虫病以外病症的实验证据在很大 程度上是轶事性的。具体地说，没有在任何适合人类肿瘤的动物模 型中提出这种治疗的适当的对照试验。\n相反，在此公开的发明的基础是用有关经口腔粘膜给药的干扰 素治疗肿瘤疾病的效力的动物模型进行的首次对照研究。\n本发明概述\n本发明提供一种通过口腔粘膜接触给哺乳动物投用治疗有效量 的干扰素以治疗哺乳动物肿瘤疾病的方法。干扰素的给药量小于经 胃肠道外给药时诱发病理反应的量。具体地说，本发明提供一种治 疗多发性骨髓瘤。多毛细胞白血病、慢性的骨髓性白血病、低级淋 巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、癌样肿瘤、宫颈癌、包括卡波西氏肉瘤 在内的肉瘤、肾肿瘤、包括肾细胞癌、肝细胞癌、鼻咽癌、血液恶 性病变、结肠直肠癌、恶性胶质瘤、喉乳头状瘤、肺癌、结肠癌、 恶性黑色素瘤在内的癌症、以及包括恶性脑肿瘤在内的脑肿瘤的方 法。在一个实施方案中，该方法通常可应用于治疗非病毒病原学的 肿瘤。\n口腔粘膜给药可以包括以单次量完成有效量干扰素的给药，或 者可以在足以引发宿主防御剌激作用的期间里，以相当于单次量的 多次较小剂量干扰素完成有效量的给药。同样，可以在足以引发宿 主防御剌激作用的时间里连续地完成相当于单次量的有效剂量干 扰素的给药。\n实践中，该方法的干扰素用药量从大约1500、优选5000IU至大 约20×106IU，更优选从大约1×104IU至20×106IU，最优选从大约1 ×104IU至20×106IU，条件是所选择的剂量不诱导如本文限定的胃 肠道外的病理反应，或者少于经胃肠道外给药时诱导病理学反应的 剂量。这些剂量范围一般是指人体内的均质α干扰素。就另一种类 型的干扰素而言，诱导病理学反应的剂量可能不同于在人内由均质 α干扰素诱导病理学反应的剂量。用特定类型的干扰素治疗病人的 医生将能够很容易地确定适于待治疗病人的剂量范围。\n在另一个实施方案中，本发明提供适合口粘膜给药的药物组合 物，该组合物包括治疗有效量的至少一种干扰素。该组合物可以作 为溶液、片剂、锭剂、凝胶、糖浆、糊剂或控释口腔粘膜给药系统 提供。该组合物可以非必选地包含缓冲剂、稳定剂、增稠剂、吸收 增强剂和增粘剂等。\n在一个实施方案中，该药物组合物是以单位剂量形式提供的， 其中所述单位剂量形式含有大约1500IU，优选5000IU到大约20× 106IU的干扰素，更优选含有大约1×104IU到大约20×106IU的干扰 素，最优选含有大约1×104IU至1×106IU干扰素。\n实践中，本方法可以作为单独的治疗方法，或者作为化疗或放 疗的辅助疗法，或者选用其他细胞因子(白介素-2、12或15)或干 扰素诱导剂。\n本方法是利用选自α、β、γ、ω和共有干扰素(复合IFN)的I 型或II型干扰素，优选重组IFN-α来完成的。\n本发明的详细描述\n现在将仅仅参照下述的定义和实施例详细介绍本发明。本文中 提到的全部专利和出版物均明确地并入，以供参考。\n定义\n本文所说的“干扰素”是指包括那些通常被命名为α、β、γ和ω 的干扰素在内的I型或II型干扰素，以及它们的混合物，包括共有 序列混合物。干扰素可从各种商业来源得到，并且已被批准用于治 疗多种病症。干扰素可以来自天然的来源，但优选的是重组产品。 就本发明的目的而言，术语“干扰素”还包括具有干扰素活性的多 肽或其片段，以及在诸如美国专利No.5,582824、5,593,667和 5,594,107中揭示的，例如为了在不影响其生物学活性性质的条件下 提高稳定性而引入了顺序变体的嵌合或突变形式的干扰素。\n干扰素可以非必选地与干扰素合成和释放的诱导剂同时给药。 诱导剂可以与干扰素一起给药，也可以分别给药。例如，干扰素的 诱导剂包括诸如poly I:C之类的多核苷酸；优选的是使用低分子量 的、可口服给药的诱导剂。适用的诱导剂在本领域中是已知的，例 如双二乙氨乙基芴酮Tilorone(美国专利No.3,592,819；Albrecht等 人，J.Med，Chem.，1974 17：1150-1156)和喹诺酮衍生物Imiguimod (Savage等人，Brit.J.Cancer，1996 74：1482-1486)。\n本发明的方法和组合物可以非必选地与一种或多种其他疗法结 合、用于治疗特定病症，并且值班医生或兽医能够选择适合该条件 的其它疗法。\n在一个实施方案中，本发明提供一种治疗哺乳动物肿瘤病的方 法，该方法包括如上所述的干扰素给药。这种肿瘤病症可能是转移 的癌。\n虽然本发明的方法可以在不用其他药剂同时进行治疗的情况下 使用，但是，预计本发明的这种实施方案在下述情况下将是特别有 用的：\na)作为按标准方法进行外科手术、化学治疗或放射治疗之后的 辅助治疗；\nb)用于治疗对干扰素敏感的肿瘤，本发明的方法可以单独使 用，也可以与常规的化疗或放疗结合起来使用；以及\nc)用于治疗抗干扰素的肿瘤，本发明的方法可以单独使用，最 优选与常规的化疗或放疗结合起来使用。\n上述诸方法的目的是诱导和/或维持疾病的缓解。“与其他治疗 结合”指的是在放疗或其他化疗之前、期间和/或之后完成干扰素给 药。最适宜的方法将决于下文讨论的各种因素。\n具体地说，预期本发明的方法将优先与至少一种选自下列一组 的治疗结合使用，这组方法包括使用抑制细胞生长的药物、一种或 多种具有抗肿瘤活性又具有与干扰素不同的作用机制的细胞因 子、抗血管生成剂及增强干扰素活性的药剂进行的化学治疗。优选 的第二种细胞因子是白介素-1(IL-1)、白介素-2(IL-2)、白介素 -12(IL-12)或白介素-15(IL-15)；优选的血管生成抑制剂是 AGM-1470[(氯乙酰)-氨基甲酸(3R-(3α，4α(2R*，3R*)，5β，6β))-5-甲 氧基-4-(2-甲基-3-(3-甲氧基-2-丁烯基)-1-氧杂螺(2，5)辛-6-基酯]；强 化干扰素药效的方法优选高温或精氨酸丁酯。\n与干扰素结合给药的优选的细胞生长抑制剂包括但不只限于环 磷酰胺、顺式铂氨、卡铂、卡美斯汀(BCNU；N，N-双(2-氯乙基)- N-亚硝基脲)、氨甲喋呤、阿霉素、α-二氟甲基乌氨酸和5-氟尿嘧 啶。\n对这种方法敏感的肿瘤病包括但不只限于对IFN-α经胃肠道外 高剂量给药有反应的癌，例如血液恶性病变，如多发性骨髓瘤、多 毛细胞白血病、慢性的骨髓性白血病、低级淋巴瘤、皮肤T细胞淋 巴瘤，诸如肾细胞癌和黑色素癌之类的实体瘤、癌样肿瘤或与爱滋 病有关的卡波西氏肉瘤，特别是非病毒病原肿瘤。\n在制备本发明的药物组合物时可以使用本领域技术人员熟知的 各种用于IFN的载体和赋形剂。在Remington：The Science and Practice of Pharmacy(19th ed.，Mack Publishing Co.，Easton，PA， 1995)及其较早的版本中教导了有代表性的配制技术。IFN配方可 以包括稳定性增强剂(如美国专利No.4,496,537所介绍的甘氨酸或 丙氨酸)和/或的一种或多种载体(如载体蛋白质)。例如，为了给 人治病，通常使用药品级人血清白蛋白，并且可非必选地使用磷酸 盐缓冲盐水作为稀释剂。在IFN的赋形剂是人血清白蛋白时，人血 清白蛋白可以来源于人血清，也可以是重组源的。在正常情况下所 用的血清白蛋白是同源的。\nIFN可以借助任何使IFN与受体的口粘膜腔接触的方式给药。因 此，人们将清楚地理解，本发明不限于任何具体类型的配方。本说 明书介绍深入口粘膜腔的IFN给药；这可以通过液体、固体、气溶 胶、以及滴鼻剂或喷雾剂来实现。因此，本发明包括但不只限于液 体、气雾剂、糖浆、锭剂、含片和喷雾剂配方。本领域技术人员将 能理解制剂的粒度对气溶胶或喷雾剂的配制可能至关重要，并且知 道适合用于调整粒度的方法。\n一个方面，以每日一次的剂量完成干扰素给药。另一方面，干 扰素也可以在一段时间内以多次低剂量方式给药，以使总效果相当 于单次高剂量的给药。实现这种给药方式的一种途径是借助附着在 或植入到口粘膜腔中并为在一段时间内持续地或受控地释放相当 于单次高剂量干扰素设计的装置提供的。\n有代表性的适合口粘膜给药的干扰素配方包括下列制剂(所有 百分比均为重量百分比)：\n片剂：右旋糖BP 45％；白明胶BP 30％；小麦淀粉BP 11％；羧 甲纤维素钠BP 5％；卵白蛋白BPC 4％；亮氨酸USP 3％；丙二醇BP 2％；和1×106IU的IFN-α2。片剂可以原样使用并让它在口中缓慢地 溶解，也可以溶解在水中并且在需要时含在嘴里与口粘膜保持接 触。\n干扰素软膏可以象在美国专利No.4,615,184中介绍的那样由甘 油45％、羧甲纤维素钠2％、柠檬酸盐缓冲液(PH4.5)25％、加 至100％的蒸馏水，以及1×106IU的IFN-α2制备。干扰素软膏可以粘 附在口颊粘膜上。\n同样，含漱液或糖浆可以借助在市售的嗽口液或止咳糖浆中添 加所需量的干扰素来制备。\n在上文提到的特定剂量范围内，在任何个别病例中最佳治疗方 案取决于所涉及病症的性质、疾病的阶段、前期治疗、正在继续的 其他治疗、该哺乳动物的一般健康状况、治疗对象对干扰素的敏感 性等因素，因此任凭医生或兽医考虑所有这些情况自行处理。疗程 长短当然将随被治疗的病情变化，例如，缓慢生长的癌(如前列腺 癌)的治疗将涉及不同于快速生长的癌(如肝细胞癌)的疗程。\n本文所揭示的有效剂量是经胃肠道外途径给药时在哺乳动物体 内不产生病理学反应的剂量。病理学反应可以是急性的、慢性的或 累积性的，并可以由血液化学，例如白细胞减少、骨髓抑制或其他 组织学参数的变化体现出来。本文所用术语“病理学反应”包括发 烧、不适、或类似流感的症状之类的不良的副反应；血管反应(如 静脉炎)；以及在注射部位的局部炎症。从个体对干扰素敏感性的 差异来看，这些反应在病人群体中有很大不同。一种鉴别经口粘膜 治疗时可接受的低剂量干扰素的简单试验是依据病人的年龄、体 重、症状、病程等因素给病人注射公认可接受的剂量，并确定注射 是否产生在此定义的病理学反应，在注射部位的局部刺激作用是最 容易判断的标准。如果没有不良反应，相同的剂量就可以经口粘膜 给药。如果有不良反应，则应以较低剂量重复实验，直至找到无病 理学反应的剂量为止。\n对于许多病人来说，预期经口粘膜给药的剂量将与按现已批准 的胃肠道外给药议定书已知允许使用的有效剂量差不多是一样 的。因此，就具体的病例而言，可接受的干扰素低剂量可以从每天 大约1500IU，优选5000IU至大约20×106IU。更优选的剂量是从每天 大约1×104IU至大约20×106IU干扰素，最优选从每天从大约1× 104IU到大约1×106IU干扰素，条件是该剂量在经胃肠道外给药时不 诱发病理学反应。在一个实施方案中，总剂量可以在同样时间里以 多次低剂量方式给药，甚至可以从附着在或植入到口粘膜的控释装 置以连续或脉动方式给药。\n干扰素合干扰素配方\n小鼠IFN-α/β\n小鼠IFNα/β(Mu IFN-α/β)是由新城疫病毒(NDV)诱导的 C243-3细胞的培养基制备的，并且象以前介绍的那样(Tovey等人， Proc.Soc.Exp.Biol.and Med；1974 146：809-815)纯化。在这项研究 中使用的制剂具有4×106国际单位(IU)/ml的滴度并且具有5×107 IU/mg蛋白质的比活性，这是象以前介绍的那样(Tovey等人，Proc. Soc.Exp.Biol.and Med；1974 146：809-815)在受疱疹性口腔炎病毒 (VSV)攻击的小鼠929细胞上检测的结果。该制剂比照美国国立 卫生研究所(NIH)的小鼠IFNα/β国际基准制剂(G-002-9004-5411) 进行标准化处理。\n人IFN-α1-8\n重组的人IFN-α1-8(Hu IFN-α1-8；BDBB批号CGP35269， Ciba-Geigy，Basel，Switzerland)象以前介绍的那样(Meister等人；J. Gen，Virol；1986 67：1633-1643)制备并纯化的。在研究中使用的制 剂象以前介绍的那样(Tovey等人；Nature，1977 267：455-457)在受 VSV攻击的同源的人WISH细胞上具有70×106IU/ml的滴度，而在异 源的鼠L929细胞上具有1×106IU/ml的滴度。该制剂比照NIH人IFN- α国际基准制剂(G-023-901-527)和小鼠IFNα/β标准(G-002- 9004-5411)进行标准化。该IFN制剂的比活性为2×108IU/mg蛋白 质。\n重组小鼠干扰素-α\n重组小鼠干扰素-α购自Life Technologies公司。在这项研究中 使用的制剂(批号HKK404)在受VSV攻击的小鼠L929细胞上检测 时具有具有6×106IU/ml的滴度和6×108IU/mg蛋白质的比活性 (Tovey等人；Proc.Soc.Exp Biol Med.，1974 146：406-415)。\n重组小鼠干扰素-β\n重组小鼠干扰素-β购自R&D Systems公司。在这项研究中使用 的制剂(批号1976-01S)在受VSV攻击的小鼠L929细胞上检测时具 有具有3.2×104IU/ml的滴度和8×106IU/mg蛋白质的比活性(Tovey 等人；Proc.Soc.Exp Biol Med.，1974 146：406-415)。\n重组小鼠干扰素-γ\n重组小鼠干扰素-γ购自R&D Systems公司。本研究所用的制剂 (2580-03SA)在受VSV攻击的L929细胞上检测时具有2×105IU/ml 的滴度和1×107IU/mg蛋白质的比活性(Tovey等人；Proc.Soc.Exp Biol Med；1974 146：406-415)。\n所有的干扰素制剂同时在相同的鉴定中滴定，并比照美国国立 卫生研究所(NIH)的小鼠干扰素α/β国际基准制剂(G-002-9004- 5411)进行标准化处理。\n小鼠干扰素α/β和重组小鼠干扰素两者均在给药前用 FerimmuneTM赋形剂重新配制。\n赋形剂\n干扰素制剂用含有牛血清蛋白质(BSA)的磷酸盐缓冲盐水 (PBS)稀释。将牛血清血蛋白成分V(RIA级，无免疫球蛋白； 药品批号A7888；Sigma，VSA)以100μg/ml的最终浓度溶解在PBS 中(pH7.4)并过滤除菌(0.2μ，Millex-GV，Millipore，USA)。\n在本文中介绍的实验中，使用专有赋形剂稀释干扰素制剂。所 用的赋形剂(FerimmuneTM，Pharma Pacific)是以片剂形式供应的， 其组成如下：\n    ％w/w     mg/片 右旋糖(葡萄糖)BP**     44.67***     55.84 明胶BP**     30.06     37.58 小麦淀粉BP**     11.31     14.14 羧甲纤维素钠BP**     4.96     6.20 卵白蛋白BPC**     4.03     5.04 亮氨酸USP     3.00     3.75 丙二醇BP     1.88     2.35 葡聚糖40** (作为葡聚糖40注射BP)     0.06     0.08 磷酸钠BP     0.03     0.04 氯化钠BP     0.01     0.01 酸式磷酸钠BP     0.01     0.01 总计     100.02     125.04\n**在无水基础上计算的\n***推导自：\n右旋糖(葡萄糖)BP(无水的)       44.64％\n葡萄糖BP(作为葡聚糖40注射剂)   0.03％\n将一片溶解于1.5ml磷酸盐缓冲盐水中，以16,000g离心15分钟， 然后无菌过滤(0.2μ，Millex-GV，Millipore，USA)，并在使用前在4℃ 下贮存。每天在使用前制备赋形剂。\n干扰素递送系统\n初步的实验结果表明用P20 Eppendorf微量移液管将5μl结晶紫 施加到正常成年小鼠的每个鼻孔中，这将导致染料几乎立即分布到 口咽腔的整个表面上。在施加染料后约30分钟，口咽腔的染色仍很明 显。采用同样方式施加带125I-标记的重组干扰素α1-8，获得基本上 相似的结果。所以，这种给药方法被用在所有的后续实验中。\n就本说明书中介绍的动物实验目的而言，人们将会清楚地理 解，有关IFN给药途径的表述“口粘膜”或“口咽”或“鼻内/口” 或“鼻内加口”或“in/or”都是指深入鼻腔的IFN制剂给药，以使它 迅速分布到口粘膜腔内，即受体动物的口和咽部内，以便与该腔的 粘膜衬接触。\nFriend红白血病细胞\nE.Affabris，Rome博士获得了Friend红白血病细胞(FLC)的抗 IFN-α/β克隆3C18，并且作了详细介绍(Virology，1982，120：441- 452)。借助活体内继代移种法保留这些细胞。简单地说，借助腹 膜内注射(ip)给DBA/2小鼠接种大约100LD50的3C18细胞，一周后 从小鼠腹腔中收获肿瘤细胞并计数，然后再次用100LD50的3C18细 胞给其他小鼠接种。用这种方法重复继代移种60至100次。业已发 现，在第60至第100次活体内继代移种所用的3C18细胞对肝和脾脏 具有高转移性(Gresser等人，Int.J.Cancer，1987，39：789-792)。 在有IFN-α/β存在的条件下活体外培养活体内继代移种的细胞证 实了抗干扰素性的表型(Belardell等人，Int.J.Caner，1982 30：813- 820)。\n本发明的干扰素组合物对在我们的实验室中分离的L1210淋巴 淋瘤细胞的L1210R6克隆(Gresser等人.，1974，干扰素和细胞分化. IX.抗干扰素的L1210细胞：特征和来源，J.Nat.Cancer Inst.，52： 553-559)和来源于接种过化学致瘤剂1-2二甲基苯并蒽的小鼠的EL4 可移植肿瘤(Gorer，P.A.，1950，Br.J.Cancer，4：372-381)也是活性 的。\n动物\n在这项研究中所用的小鼠是从无特异病原体的群体(IFFA CREDO，France)获得的。这些小鼠按照EEC标准圈养在无特异病原 体的动物试验室内(位于Institut FederatifCNRS，Villejuif)。\n干扰素的生物检定\n按照常规方法检定干扰素。简单地说，样品(20μ1)用80μl包 含2％热灭活的胎牛血清(FCS)(Gibco，France)的Eagle氏极限基 本培养基MEM(Gibco，France)稀释，并且用多道移液管(Finnpipete， Labsystem，50-300μl)添加到微量滴定板(Falcon，批号3072)的每 个孔中。将WISH或L929细胞(2×104细胞/孔)添加到包含2％FCS 的100μl MEN中并在含5％CO2的空气气氛(Forma 3029 CO2孵箱) 中在37℃下孵化过夜。然后用装有10倍物镜的Olympus IM GLDW倒 置显然微镜检查细胞的毒性征象。然后，从1∶10稀释开始以包含 2％FCS的总体积为200μl的Eagle氏MEM对未呈现可检出毒性的样 品进行连续的加倍稀释，其方法是用多道移液管将100μl稀释材料归 入每孔包含100μl新鲜的含2％FCS的Eagle氏MEM的微板上。同时还 制备NIH人IFN-α的参考标准(G-023-901-527)或NIH Mu IFN-α/β 的参考标准(G-002-9004-5411)的适当的连续加倍稀释液。然后， 在适当的环境中用100μl包含2％FCS的Eagle氏MEM将WISH或L929 细胞(2×104细胞/孔)添加到每块板上，并在含有5％CO2的空气环 境中在37℃下保温过夜。然后检查细胞单层的毒性征象并且没有任 何显著的毒性，将培养物抽吸出来并用200μl含有2％FCS和100 TCID50的VSV(WISH细胞为2×10-4VSV23，或L929细胞为10-5 VSV23)的Eagle氏MEM替代。然后，将这些板在包含5％CO2的空 气气氛中在37℃下保温过夜。然后，用Olympus IM VL WD倒置显微 镜检查细胞单层有无特异病毒的细胞病变作用。干扰素的滴度是由 给出50％抗特异病毒细胞病变效应的稀释度的倒数确定的，并且以 国际参考单位/毫升(IU/ml)表示。\n实施例1：经口粘膜给药的干扰素在受Friend红白血病细胞攻击的小 鼠体内的抗肿瘤活性\n为了确定IFN-α经鼻内/口(in/or)途径给药是否提高受高转移性 FLC细胞攻击的小鼠的存活率，在第0天用1×105个FLC在静脉内 (iv)攻击数组7-8周令的雄性DBA/2小鼠(每组6只)。\n每组小鼠用104IU加在10μl BSA-PBS中的多种小鼠IFN-α亚型 (Mu IFN-α)的混合物或除省略病毒诱导剂外以同样方式生产并纯 化的等体积的IFN模拟制剂经in/or途径治疗，每天两次，连续治疗10 天。在与纯化的Mu IFN-α制剂进行平行检测时，模拟的IFN制剂不 呈现可检测的IFN活性。结果示于表1。\n                                     表1\n  组   治疗    攻击后存活天数     平均存活天数   1   模拟Mu IFN-α    9，9，10，10，10，10     9.6±0.2   2   Mu IFN-α104 IU    28，31，36＞100＞100     31.7±2.3**\n**只就死亡的动物进行计算\n每天两次104IU的Mu IFN-α经口粘膜给药显著地增加了注射FLC 的小鼠的存活时间。事实上，5只小鼠中有2只被有效地治愈，因为 FLC攻击后仍存活达100天。关于受2×104LD50的FLC感染并经口粘 膜给药用103IU重组Mu IFN-β或103IU重组Mu IFN-γ进行治疗的数组 10只成年DBA/2小鼠的对照试验结果是类似的。\n实施例2：用注射了Friend红白血病细胞的小鼠进行的较大批量的经 口粘膜给药的低剂量干扰素-α抗肿瘤活性试验\n为了证实实施例1的结果，进行了较大批量的试验。第0天给150 只8周令雌性DBA/2小鼠静脉注射1×104 FLC(2×104FLC LD50)。 以10μl体积经in/or给药途径用指定类型和剂量的IFN给小鼠进行治 疗，每天两次，连续治疗10天。每个治疗组中有10只小鼠。结果扼 要地示于表2。\n                                   表2   组     治疗   剂量     赋形剂     平均存活天数   1     无   -     无     9.5±0.2   2     模拟Mu IFN-α   -     BSA/BS     9.6±0.2   3     Mu IFN-α   104IU     BSA/BS     29.4±25.6％*   4     Mu IFN-α   103IU     BSA/PBS     11.6±0.2   5     Mu IFN-α   102IU     BSA/BS     10.3±0.2   6     Hu IFN-α1-8   104IU     BSA/BS     18.2±0.8   7     Hu IFN-α1-8   103IU     BSA/BS     13.1±0.8   8     Hu IFN-α1-8   102IU     BSA/BS     11.±0.5\nIU：国际参考单位\nBSA/PBS：溶解在PBS中的BSA，100μg/ml，pH7.4\nMu IFN-α：鼠IFN-α亚型的天然混合物\nHu IFN-α：单一的重组人IFN-α异型\n*：在这组中一些动物在治疗后100天仍然活着\n在静脉注射FLC的小鼠中，经in/or途径给药的IFN-α呈现显著的 抗肿瘤活性。某些经IFN治疗的小鼠确实可以看作是治愈了，因为 它们在4至5个FLC细胞就足以杀死动物的系统中在接种100,000个 FLC之后仍能存活100天以上。\n在这个模型中，单一重组IFN-α亚种的纯制剂、IFN-α1-8、多 种IFN-α亚型的天然混合物、Mu IFN-α、重组鼠IFN-β和重组鼠IFN-γ 在经in/or途径给药时均呈现显著的抗肿瘤活性，这明确地意味着观 察到的经口粘膜给药的IFN制剂的抗肿瘤活性确实是由于这些制剂 中的IFN成分。\n实施例3：干扰素的给药途径对抗肿瘤活性的影响\n经in/or途径给药的IFN的效果与经常规途径给药的IFN的效果进 行比较。在第0天给8周令雌性DBA/2小鼠静脉注射1×105个FLC(2 ×104FLC LD50)。用按指定途径给药的104IU的Mu IFN-α(在实 施例2中确定的最佳剂量)给小鼠进行治疗，每天两次，连续治疗 10天。每个治疗组有6只小鼠，并且在每种情况下Mu IFN-a的赋形 剂都是加在PBS中的BSA。结果扼要地示于表3。\n                         表3   组     治疗     途径     平均存活天数   1     无     9.6±0.2   2     Mu IFN-α     鼻内/口     30±25.85％*   3     Mu IFN-α     口     18.5±2.0   4     Mu IFN-α     胃     13.5±1.3   5     Mu IFN-α     皮下     23.5±1.6   6     Mu IFN-α     肌内     23.7±1.8   7     Mu IFN-α     静脉内     25.0±1.2   8     Mu IFN-α     腹腔内     26.7±4.1\nIU：国际参考单位\nBSA/PBS：加在PBS中的BSA，100μg/ml，pH7.4\n*：该组中某些动物在接种FLC细胞后100天仍然存活\n经口粘膜(或in/or)途经给药如果不是更有效至少是与通常使用 的胃肠外途径(如静脉注射(iv)、肌肉注射(im)和皮下注射(sc))同 样有效的。事实上in/or途径与腹腔注射(ip)同样有效，后者被认为是 在治疗静脉注射FLC的小鼠时最有效的给药途径。相反，直接经口 腔实施同样剂量的IFN给药似乎比鼻内和口腔结合给药的效果差， 而通过导管直接将IFN导入动物的胃中效果则差得更多。\n实施例4：口粘膜给药的干扰素对细胞的蛋白质表达式的影响\n已知IFN-α在蛋白质与其细胞表面受体结合后诱导许多细胞的 蛋白质表达式。有人认为这些蛋白质提供有用的IFN作用标志。\n我们评价了通过in/or途径给药的IFN对三种IFN诱导的蛋白质 (即I类MHC抗原、LY 6A/E抗原和2’-5’-寡腺苷酸合成酶)表达式 的影响。\n在经腹腔给药仅20IU Mu IFN-α就在外围血液单核细胞和粒 细胞上显著增加H-2-Kd抗原表达式的条件下，经in/or途径用高达 20,000IU的Mu IFN-α治疗DBA/2小鼠(H-2 Kd)并不显著地增加外 围血液淋巴细胞、单核细胞或粒细胞上的H-2-Kd表达式。单核细胞 上的表达式确实略微受到抑制。\n同样，通过in/or途径用高达20.000IU的Mu IFN-α治疗小鼠对 Ly6A/E抗原的表达式没有显著的影响，而该抗原表达式在经胃肠道 外途径用I型IFN治疗后在各种淋巴样细胞的表面上被显著增强 (Damout等人.，J.Immunol.，1986，137：201-210)。通过in/or途径用200 或20,000 IU的Mu IFN-α或Hu IFN-α1-8获得相似的结果。\n用只有20IU的Mu IFN-α经腹腔注射治疗Swisss小鼠或DBA/2 小鼠，结果是在外围血液单核细胞或脾细胞两者中2′-5′-寡腺苷酸合 成酶的活性显著增加。相反，在同一实验中通过in/or途径用高达 20,000IU的Mu IFN-α治疗小鼠没有显著地增加2′-5′-寡腺苷酸合成 酶活性的表达式。另外，经in/or途径用200或20,000IU的Mu IFN-α 或MU IFN-α1-8进行治疗在开始IFN治疗后长达10天的时间里任 何时候对2′-5′-寡腺苷酸合成酶的活性都没有显著影响。\n实施例5：口粘膜给药后干扰素的生物利用率\n为了检验IFN的生物利用率和药物动力学，用125I可能标识到最 高比放射性的高单次剂量重组IFN-α来治疗药物-血液体积比最有 利于这些研究的小鼠。\n将70×106IU Hu IFN-α1-8的纯制剂重新溶解在1.4ml的PBS 中，并且象Mogensen等人介绍的那样(Int.T.Cancer，1981，28：575- 582)采用Hunter和Greenwood介绍的改良氯胺T法(Nature，1962， 194：495-496)进行碘处理。\n125I标记的Hu IFN-α1-8(批号CGP35269-1)在受VSV攻击的人 体WISH细胞上检测时呈现2×107IU/ml的生物学活性，而在受VSV 攻击的小鼠L929细胞上检测时呈现1×106IU/ml的生物学活性。\n6至7周令的雌性Swiss鼠用相当于1×106鼠IU的2×107IU 125I Hu IFN-α1-8(1.0369×107cpm/小鼠)经iv、ip注射或经in/or途径治 疗。在指定的时间点，每组杀死3只鼠，收集血液并确定体积。分 离并收集动物的肾、肝、肺、脾和胃/食管，打上印迹，并称重，精 确到±1.0μg。利用γ-计数器分别确定每个样品的放射性。然后，借 助离心(800g×10分钟，4℃)分离全血，收获血清，记数并在-80 ℃下冷冻。然后，如上所述利用标准的生物检定法在人体WISH细胞 和小鼠L929细胞上检测血清的IFN/含量。然后，借助亲和层析法分 离存在于血清样品中的放射性物质，并借助SDS-PAGE法进行分 析。\n在每只鼠静脉注射1.0369×107cpm带125I标记的Hu IFN-α1-8之 后5分钟，在动物的外围血液中检测到非常高水平的放射性(＞2× 106cpm/ml)。在第15分钟和30分钟，存在于全血中的放射性两逐 步降低。腹腔注射1.0369×107cpm的125I HU IFN-α1-8之后5分钟， 在动物的外围血液中检测到的放射性的水平大约比静脉注射后检 测到的低20倍。在注射后第15和30分钟的放射性水平逐步增加。在 经in/or途径完成125IIFN-α1-8给药后第5、10或15分钟在动物血液中 检测到的放射性水平显著低于在腹腔注射相同剂量带放射标记的 IFN之后的给定时刻经定时间检测到的放射性水平。就所有三种给 药途径而言，经in/or完成带125I标记的IFN-α1-8给药后，在血清中检 测到的放射性水平比在全血中检测到的高。与同样体积的血清相 比，每毫升全血中检测到的放射性水平较低反映出在去掉全血中细 胞成分之后计数的血清有效体积较大。\n采用上述的标准生物检定法检测研究中所有的小鼠血清样品以 确定有生物活性的IFN存在，结果表明在所有试验的时间点上，静 脉或腹腔注射125IMu IFN-α1-8的所有动物的血清中都有容易检测 的有生物活性的IFN。反之，在经in/or途径完成IFN给药后在任何试 验的时间点在所有动物的血清中都没有检测到带生物活性的IFN， 尽管在这些动物的血清中有较高水平的放射性存在。\n为了确定在经125IMu IFN-α1-8治疗的动物血清中检测到的放 射性物质是否确实代表天然IFN，样品用蛋白质A-G琼脂糖进行免疫 沉淀，以便将存在于样品中的免疫球蛋白沉淀出来，用亲和纯化的 多克隆抗干扰素-α的抗体处理后再次进行免疫沉淀。然后，对样品 进行上述的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。\n对静脉或腹腔注射125I MU IFN-α1-8后血清中放射性物质进 行的SDS-PAGE分析揭示出一条均匀的迁移带，其中电泳迁移率与 未注射125IMU IFN-α1-8的完全一致。估计该物质的表现分子量约 为20000道尔顿，它与天然的Hu IFN-α1-8的分子量完全相符。完全 相符。反之，来自经in/or用125I Mu IFN-α1-8治疗的小鼠的血清样品 无一包含任何表观分子量与天然IFN的分子量相似的物质，既使在 每个凝胶上加入完全相同量的放射性物质。\n带放射标记物质的组织分布揭示：在静脉注射125I Mu IFN-α1- 8后5分钟，动物的肾脏中有非常高水平的放射性，在肝、肺和脾脏 中也有高水平的放射性。随后发现存在于这四个器官中的放射性水 平在15和30分钟逐渐降低。相反，在15和30分钟时，胃中的放射性 水平逐渐增高，达到与静脉注射后30分钟时动物血清中存在的放射 性差不多的水平。\n借助腹腔注射完成125I Mu IFN-α1-8给药导致在15分钟内受检 的所有组织中放射性均达到峰值水平，接下来在第30分钟降低。类 似地，经in/or途径完成125I Hu IFN-α1-8给药导致在15分钟后被研究 的所有组织中的放射性均达到峰值水平，30分钟时存在的放射性水 平有些下降。经in/or途径完成125I Hu IFN-α1-8给药后存在于胃/食管 中的放射性水平比在任何其他器官中检测到的水平高一个数量 级，而且显著高于借助静脉或腹腔途径完成同样剂量的带放射标记 的Hu IFN-α1-8给药后存在于这些组织中的放射性水平。\n实验例6鼻内/口内给药后干扰素的药物动力学\n为了准确地测定Hu IFN-α1-8的药物动力学，以每只小鼠1.0369 ×107cpm的剂量用125I HU IFN-αα1-8经iv、ip或in/or途径给小鼠治 疗，并在24小时期间内的一系列时间点测定在全血和血清中存在的 放射性水平。\n静脉注射后存在于小鼠血液中的125I标记的Hu IFN-α1-8的药物 动力学曲线十分接近对数清除曲线。这个结果与以前利用密切相关 的分子(即重组人αA/D(Bg1))进行的小鼠研究(Bohoslawed等 人；J.IFN Res.，1986，6：207-213)的结果相符。根据浓度时间曲线 下的面积计算出的生物可利用物质的量也与人αA/D的那个量相 似。静脉注射125I HU IFN-α1-8后观察双相对程清除曲线(其为通 过肾脏清除的物质的特征)，结果与实施例6的结果一致。腹腔注 射后，带125I标记的IFN-α1-8的药物动力学与以前报导的肌肉注射 IFN的结果十分相似。\n静脉或腹腔注射带125I标记的IFN-α1-8后，在所有动物的血清 中存在很容易检测到的有生物活性的IFN。\n因为Friend红白血病细胞(FLC)经静脉注射后对肝和脾脏都表 现出很高的恶性程度和转移性，所以Friend红白血病模型构成非常 严格的抗肿瘤活性临床前试验。使用该模型得到的结果确实是采用 胃肠道外途径注射IFN-α治疗人类肿瘤的基础。因此，在这项研究 进行的全部试验中，所有末经治疗的和用对照制剂治疗的动物均在 10至11天死亡。如果不作治疗，仅仅注射4或5个FLC细胞就会杀死 小鼠。相反，某些经口粘膜途径用鼠IFN-α治疗的动物在接种105 个FLC后仍然存货100天以上，并且可以认为它们已被治愈。\n的确，根据以前的工作判断，经口粘膜途径给药的IFN-α似乎 比经胃肠道外给药的环磷酰胺、5-氟尿嘧啶或氨甲喋呤更为有效， 后一途径仅使注射FLC的动物存活时间增加几天(Gresser等人，J. Natl.Caner Inst.，1988，80：126-131)。顺式铂氨、长春新碱、阿霉素、 博来霉素或表鬼臼毒吡喃葡糖苷等其他药物则对这种肿瘤无效 (Gresser等人，J.Natl.Caner Inst.，1988，80：126-131)。\n同样，经口粘膜途径给药的IFN-α在抗FLC方面似乎比全身给 药的IL-1β、IL-2和TNF-α等其他细胞因子更为有效，这些细胞因子 在该模型中只表现出很小的活性。\n以前的工作已显示，在该模型中胃肠道外给药的IFN是最有活 力的抗肿瘤药物之一，而且即使肿瘤已经转移到肝中才开始IFN治 疗也是有效的(Gresser等人；Intl.J.Caner，1987，39：789-792)。目 前的结果表明IFN经口粘膜途径给药同样有效，甚至更有效。\n在淋巴瘤确诊后开始治疗时，每天将IFN-α与单次剂量的环磷 酰胺一起注射与只用其中任何一种药剂治疗的动物相比显著地增 加了患淋巴瘤的AKR小鼠的存活期(Gresser等人；Eur.J.Cancer， 1978，14：97-99)。在各种临床前动物肿瘤模型中也已报导了成功地 用IFN-α/β和BCNU、顺式铂氨(cis-DDP)、氨甲喋呤、阿霉素和α- 二氟甲基乌氨酸进行联合治疗。还报导了采用5-氟尿嘧啶(5-FV) 和IFN的联合疗法在治疗转移性结肠癌时是十分有益的(Ernstoff等 人；Journal of Clinical Oncology，1989，7：1764-1765)。然而，其他 一些已报导的研究则显示当IFN治疗与环磷酰胺(Marguet等人，Int， J.Cancer，1983，31：223-226；Lee等人，Biochern.Pharmacol.，1984 33： 4339-3443)、阿霉素(Blackwill等人，Cancer Res.，1984 44：904-908) 或5-FU(Marquet等人，1985 109：156-158)，即那些已证明与胃肠 道外IFN治疗联合使用可发挥有利作用的药物结合反而降低了抗肿 瘤活性。使用本文描述的方法可以很容易地试验出IFN与其他化学 疗法的组合。\n白介素-1(IL-1)与IFN-α/β结合的疗法对注射了FLC的小鼠可 产生协同抗肿瘤效果(Belardell等人，Int.J.Cancer，1991 49：274- 278)。同样的疗法对Eb淋巴瘤的转移性变体(p11-R-Eb)也发挥 显著的抗肿瘤效果，而单独使用其中任何一种药剂都没有效果 (Gabriele等人，Invasion Metastasis，1993 13：147-162)。在所有受试 的细胞因子中，已发现IL-1在与I型IFN胃肠道外给药治疗结合时是 最有效的。\n将血管生成抑制剂AGM-1470[(氯乙酰)-氨基酸(3R-(3α，4α (2R*，3R*)，5β，6β))-5-甲氧基-4-(2-甲基-3-(3-甲氧基-2-丁基)环氧乙 基-1-氧杂螺(2，5)辛-6-基脂]与IFN-α/β一起给药的联合疗法与单独用 其中任何一种药剂的疗法相比显著地增加了抗肿瘤效果(Brem等人， J.Pediatric Surgery，1993 28：1253-1257)。\n业已发现，高体温将提高IFN-α/β对Lewis肺癌的抗肿瘤作用 (yerushalmi等人，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，1982 169：413-415)。精 氨酸丁脂也已表明可增强IFN-α的抗肿瘤作用(Chany and Cerutti， Int，J.Cancer，1982 30：489-493)。对于给定类型和剂量的IFN比较经 口粘膜途径给药与系统给药(静脉注射)两者所获得的保护程度， 结果表明在某些病例中IFN经胃肠道外给药比口粘膜给药或多或少 地更有效一些，而在另一些病例中则不然。\n生物标志试验研究的结果非常清楚地表明三种受试的生物标志 (I类MHC抗原、Ly6A/E抗原和2′-5′-寡腺苷酸合成酶活性)都没有 充分地反映出经口粘膜途径给药的IFN-α所呈现的非常显著的抗肿 瘤活性。\n继腹腔内(ip)注射少至仅20IU的IFN-α之后开始的所有试验中 观察到三种IFN诱导的全部蛋白质的表达式中都有非常显著的增 加，而多达20,000IU的IFN-α经口粘膜途径给药后却没有任何可测 量的效果，两者之间的反差是显著的。\n虽然我们不能排除在较早的或中间的时间点上有可能观察到对 一种或另一种生物标志的影响，但是，这种情况似乎是不可能的， 因为IFN影响这些蛋白质的基因代码的转录，因此人们在IFN治疗后 只有经过很长的时间才可能看到对这些生物标志的影响。\n另外，虽然我们不能排除在用IFN-α经口粘膜途径治疗后观察 到对许多其他IFN诱导的蛋白质之一的全身性影响，但这似乎不可 能，因为这将意味着差动调节某些IFN诱导的基因的表达式。然而， 完全有可能在IFN-α经口粘膜途径给药后在局部(例如在鼻淋巴细 胞中)观察到对IFN生物标志的影响。\n与对所研究的生物标志没有可检测的影响相符，即使在用高达 20,000IU的IFN-α治疗的动物中也没有观察到对任何在IFN经口粘 膜给药治疗期间所监测的血液学或血液化学参数的一致影响。\n在带125I标记的IFN-α1-8经口粘膜给药之后在动物的全血和血 清中都发现容易检测到的带放射性标记的物质。这些结果与以前研 究的结果(即在口服大量的未带标记的IFN后在动物的血清中仍未 检测出IFN)恰好相反。但是，经口粘膜给药后在全血和血清中检 测出的放射性物质是无生物活性的。此外，SDS-PAGE分析的结果 表明这种物质是低分子量的，并且很可能反映继IFN在胃和小肠中 消化之后对降解产物的吸收作用。在口粘膜给药后带放射性标记的 物质的组织分布的分析结果表明胃中的放射性水平明显地高于受 检验的任何其他器官。我们的结果十分清楚地表明：即使口粘膜给 药后带生物活性的IFN不被吸收，这种疗法仍能在体内发挥有统计 意义的抗肿瘤活性。\n虽然不希望使观察到的有益作用拘泥于任何已提出的机制，但 我们的结果意味着经口粘膜给药的IFN借助目前尚不明确的新机制 发挥其抗肿瘤细胞的作用，这种机制不包括外源给药的IFN的直接 作用，或内源性IFN的诱导作用。没有可检水平的循环IFN或没有可 检水平的受试的三种生物标志都支持这一观点。似乎这种机制至少 可以部分地借助刺激鼻咽腔和口腔周围丰富的淋巴样组织发挥作 用。因为我们已证明经口粘膜给药的IFN在效力上至少与全身给药 的IFN相差无几，所以我们的试验结果强有力的支持在治疗肿瘤病 时借助口粘膜途径完成IFN给药。这对于IFN的临床应用可能有重要 意义。\n本领域技术人员可以明确看出，虽然为了清晰和便于理解已对 本发明作了相当详尽的描述，但是不脱离说明书中公开的本发明的 精神和范围可以对本文描述的实施方案和方法作出各种修饰和改 动。