植物内淀粉合酶的过量表达

1.一种用于与来自相应未遗传修饰的野生型稻植物细胞的淀粉相比增加遗传修饰的稻植物细胞的淀粉磷酸盐含量至150至500％的方法，其中
a)稻植物细胞通过导入编码可溶性淀粉合酶II的外来核酸分子而受到遗传修饰，并且
b)这种可溶性淀粉合酶II被过量表达；
其中所述可溶性淀粉合酶II由SEQ ID NO.1内所示的核苷酸序列的编码区编码或由SEQ ID NO：2内所示的氨基酸序列组成。
2.一种其淀粉由权利要求1的方法加以修饰的稻植物产生的稻淀粉，具有在70℃和
80℃之间的DSC T-起始温度。
3.权利要求2所述的稻淀粉，其中DSC T-起始温度在72℃和79℃之间。
4.衍生的稻淀粉，包含权利要求2或3所述的稻淀粉。
5.一种组合物，包含权利要求2至4中任一项所述的稻淀粉。
6.一种米粉，包含权利要求2或3所述的稻淀粉。
7.一种组合物，包含权利要求6所述的米粉。
8.一种加工的稻粒，所述稻粒包含权利要求2或3所述的稻淀粉。
9.权利要求8的稻粒，其为烹煮的。
10.一种组合物，包含至少一种权利要求8或9所述的稻粒。

植物内淀粉合酶的过量表达\n[0001] 本发明涉及与来自相应未遗传修饰的野生型植物细胞的淀粉相比，用于增加遗传修饰的植物细胞内淀粉的磷酸盐含量的方法，其中植物细胞通过导入编码可溶性淀粉合酶II的外来核酸分子受到遗传修饰，并且这种淀粉合酶II得到过量表达。\n[0002] 此外，本发明涉及具有改良质量特性的稻淀粉和米粉，涉及包含这种稻淀粉的稻粒和在其上长有这些稻粒的稻植物。\n[0003] 稻是对超过半数的世界人口最重要的食物。在某些国家，稻米占据食物总摄入量的约80％。世界范围的年生产量是5.50亿吨稻米。\n[0004] 稻颖果由76％淀粉和约7-8％的蛋白质组成。它仅含有1.3％的脂肪和多种痕量元素(0.6％)如磷、铁和镁。\n[0005] 经济上最重要的稻物种是稻(Oryza sativa)，其基本品种可以分成两组：\n[0006] “印度”组，该组仅包括长粒米，和\n[0007] “日本”组，该组包含中等粒米和短粒米。\n[0008] 长粒米(其米粒在烹煮时分散的稻品种)主要来自印度或爪哇；短粒米(如“短米”，即其谷粒在烹煮时粘稠的稻品种)主要来自日本。来自中国和东南亚的品种介于以上二者之间。\n[0009] 而在所有品种内，存在两种主要类型：半透明米粒或不透明米粒。这些米粒主要在淀粉组成上不同：半透明米的淀粉由约20％直链淀粉和多达80％的支链淀粉组成，而不透明米的淀粉则实际上仅由支链淀粉组成。\n[0010] 支链淀粉具有特异性的蔟状结构并由四类酶：可溶性淀粉合酶(SS)、淀粉分支酶(SBE)、淀粉去分支酶(SDE)和ADP葡萄糖焦磷酸酶的多种亚基或同种型合成(Nakamura2002，Plant Cell Physiol.43(7)：718-725)。 \n[0011] 烹煮特性和口感特性主要由稻胚乳的直链淀粉含量决定。具有低含量直链淀粉的品种在烹煮后潮湿且粘稠，而具有高含量直链淀粉的米粒在烹煮时变干蓬松(H.ten Have，Hoffmann Mudra Plarre(HMP)1985：Lehrbuch der Züchtung landw.Kulturpflanzen，第2卷，第110-123页)。\n[0012] 谷粒质量不仅对消费者是重要的，而且也对制粉工业重要；谷粒特性如谷粒大小、谷粒形状和谷粒质量是重要特征，因为它们影响米粉产量和破损谷粒百分数(ten Have1985，同上)。\n[0013] 米粉是味道相对中性的并且因此非常适合作为用于淡味产品的基质或作为掺合物。由于米粉的低致敏性，它还非常适用于婴儿配方食品或作为过敏患者的膳食。\n[0014] 除油、脂肪和蛋白质之外，多糖是来自植物的最重要的可再生原料。除纤维素以外，作为高等植物内最重要的贮藏物质之一的淀粉在多糖中是极为重要的。\n[0015] 多糖淀粉是化学均一的单元(葡萄糖分子)的聚合物。然而，多糖形成具有不同形式分子的高度复杂的混合物，其在聚合程度和葡萄糖链的分支发生率和链长度方面不同，并且还可以受到衍生化，例如磷酸化。因此，淀粉不构成均一的原料。尤其，直链淀粉与支链淀粉不同，其中直链淀粉是基本上不分支的α-1，4-糖苷键连接的葡萄糖单元的聚合物，支链淀粉则是不同分支的葡萄糖链的复杂混合物。分支因额外的α-1，6-糖苷键存在而形成。在用于工业淀粉生产的常见植物例如玉米、小麦或马铃薯内，所合成的淀粉具有约\n20％-25％直链淀粉和约70％-75％支链淀粉。\n[0016] 淀粉的功能性特性不仅极大地受直链淀粉/支链淀粉比和磷酸盐含量的影响，还受分子量、侧链分布样式、离子含量、脂类及蛋白质含量、淀粉粒平均粒度、淀粉粒形态学等影响。本文中可以提到的重要功能特性是例如溶解度、退化性能、水结合能力、成膜特性、粘度、糊化特性、冻融稳定性、酸稳定性、凝胶强度等。\n[0017] 仅大致知道引起淀粉合成的基础生物化学合成途径。然而，存在一系列这样的步骤，在其中导致淀粉颗粒合成和淀粉合成的详细机制迄今未被阐明并因此仍是研究的主题。\n[0018] 目前不可能仅通过植物育种而影响植物内共价结合的淀粉磷酸盐的含量。\n[0019] 一种对植物育种方法的替代是通过重组方法定向修饰产生淀粉的植物。然而，前提是鉴定并表征参与淀粉合成和/或参与淀粉修饰的酶并分离编码这些酶的核酸分子，以及随后在转基因植物内的功能分析。\n[0020] 在植物细胞内，淀粉合成在质体内发生，其中质体在光合活性组织内是叶绿体并且在非光合活性的淀粉贮藏组织内是造粉体。在淀粉合成中发挥作用的重要酶是R1蛋白质(＝α-葡聚糖水合二激酶，E.C.2.7.9.4；Lorberth等(1998)Nature Biotechnology16：473-477)、淀粉合酶和分支酶(＝BE；见例如，Ponstein等，Plant Physiol.29(1990)，234-241；Kossmann 等，1991，Mol.Gen.Genet.230，39-44；Safford 等，\n1998，CarbohydratePolymers35，155-168；Jobling 等 1999，The Plant Journal18(2)：\n163-171)。分支酶催化a-1，6-分支导入线性a-1，4-葡聚糖。在淀粉合酶中，多种同种型已经得到描述，它们均通过转移来自ADP-葡萄糖的葡萄糖基残基至a-1，4-葡聚糖而催化聚合化反应。\n[0021] 关于多种植物物种内分离的天然淀粉的概述可以在Kossmann和Lloyd(2000，Critical Reviews in Plant Sciences19(3)：171-226)内找到，在所述植物物种中观察到在淀粉生物合成内发挥作用的酶的变异。\n[0022] 淀粉合酶(EC2.4.1.21)可以分成两类：淀粉颗粒结合的淀粉合酶(“颗粒结合性淀粉合酶I”；GBSS I)和可溶性淀粉合酶(“可溶性淀粉合酶”；SSS，也称作”SS”)。这种区分在每种情况下不是界限分明的，因为某些淀粉合酶既以淀粉颗粒结合形式存在又以可溶性形式存在(Denyer等，Plant J.4(1993)，191-198；Mu等，Plant J.6(1994)，151-159)。\n[0023] 与导致直链淀粉合成的GBSSI不同，仍很少知道淀粉生物合成中多种类型可溶性淀粉合酶的确切酶功能。\n[0024] 生物化学表征导致鉴定分子量在约60至约180kDa之间的可溶性淀粉合酶蛋白质。克隆编码淀粉合酶的cDNA有可能区分由于序列同源性和由于(可溶性)淀粉合酶的功能性特征而受到定义的不同类型。\n[0025] 迄今，8类淀粉合酶已经在高等植物内得以鉴定(尤其由Li等(2003)Funct.Intergr.Genomics3：76-85)：\n[0026] -淀粉-颗粒结合性淀粉合酶I(颗粒结合性淀粉合酶I＝GBSS I)(稻：例如Okagaki(1992)Plant Mol Biol.19：513-516；马铃薯：van der Leij等(1991)Mol.Gen Genet.228：240-248；玉米：例如Kloesgen等(1986)Mol.GenGenet.203：237-244)；\n[0027] -可溶性淀粉合酶I(＝SSI；稻：Baba等(1993)Plant Physiol.103：565-573；\n马铃薯：Kossmann等(1999)Planta208：503-511；玉米：Knight等(1998)Plant J.14：\n613-622)；\n[0028] -可溶性淀粉合酶II(＝SSII；豌豆：Dry等(1992)Plant J.2：193-202，马铃薯：Edwards等(1995)Plant J8：283-294，玉米：Harn等，(1998)Plant Mol.Biol.37(4)：\n639-649；小麦：Walter等(1996)Genbank登录号U66377；稻：Yamamoto和Sasaki(1997)Plant Mol.Biol.35：135-144和大麦：Li等(2003)，Funct.Integr.Genomics3：76-85)；\n[0029] -可溶性淀粉合酶III(＝SSIII；马铃薯：Abel等(1996)Plant J10：981-991：饲用豌豆：GenBank登录号AJ225088)；\n[0030] -可溶性淀粉合酶IV(＝SSIV；小麦：GenBank登录号AY044844)；\n[0031] -可溶性淀粉合酶V(＝SSV；饲用豌豆：GenBank登录号VUN006752；拟南芥(Arabidopsis)：GenBank登录号AL021713；玉米：WO97/26362)和\n[0032] -dull(Gao等(1998)Plant Cell10：399-412；\n[0033] -可溶性淀粉合酶VI(＝SSVI；玉米：WO01/12826)。\n[0034] 共价结合的淀粉磷酸的含量会取决于植物物种而变化。例如某些玉米突变体合成淀粉磷酸盐含量增加的淀粉(蜡质玉米为0.002％和高直链淀粉玉米为0.013％)，而常规玉米品种仅含有痕量的淀粉磷酸盐。在小麦中也找到少量淀粉磷酸盐(0.001％)，而在燕麦和粟内未检测到淀粉磷酸盐。在稻突变体(蜡质稻0.003％)中存在的淀粉磷酸盐比传统稻品种(0.013％)少。在合成块茎贮藏淀粉或根部贮藏淀粉的植物中检测到明显量的淀粉磷酸盐，如木薯(0.008％)、甜马铃薯(0.011％)、竹芋(arrowroot)(0.021％)或马铃薯(0.089％)。在每一情况下，淀粉磷酸盐含量百分数基于淀粉干重并已经通过Jane等测定(1996，Cereal Foods World41(11)，827-832)。在SSI反义马铃薯上的研究表明其磷酸盐含量增加高于野生型达30-70％(WO96/15248)。\n[0035] WO00/08184描述其中淀粉合酶III(＝SSIII)活性及分支酶I(＝BEI)活性均降低的植物。与来自野生型植物的淀粉相比，来自此类植物的淀粉具有升高的磷酸盐含量。\n在国际专利申请WO02/34923内描述了因来自马铃薯的RI基因过量表达而具有增加的R1蛋白质活性和增加的淀粉磷酸盐含量的小麦植物。\n[0036] 磷酸盐在已经由植物合成的淀粉(天然淀粉)内的分布通常因如此事实得以区分，即约30％至40％的磷酸盐残基共价地在葡萄糖分子C3位置上结合并且约60％至\n70％的磷酸盐残基共价地在葡萄糖分子的C6位置上结合(Blennow等，2000，Int.J.of Biological Macromolecules 27：211-218)。相反，化学磷酸化的淀粉还具有在葡萄糖分子C2位置上结合的磷酸盐残基，因为化学反应以非定向方式进行。\n[0037] WO03/023024公开了具有高达69.5℃的DSC T-起始温度和高达73.6℃的DSC峰值温度的稻淀粉；分析了日本组及印度组的总计约400个稻品种的这些特征。\n[0038] Umemoto等(2002，Theor.Appl.Genet.104：1-8)描述了对日本品种(Nipponbare)与印度品种(Kasalath)之间回交杂交品系的分析。他们从其结果中得出结论：负责日本品种与印度品种之间不同的凝胶化起始温度(DSCT-起始)的基因座alk(t)、gel(t)和acl(t)可能是淀粉合酶同种型SSIIa。\n[0039] WO03/023024描述了已经转入来自印度形式IR36的淀粉合酶SSIIa(SSIIa)基因的日本品种(Kinmaze)的稻转化体(#78-1)。显示了在支链淀粉侧链图谱上的所得变化，结果指示了从日本品种图谱至印度品种图谱的迁移(WO03/023024内的图22)。\n[0040] WO03/023024未描述稻淀粉或米粉的磷酸盐含量、直链淀粉含量或流变特性。\n[0041] 由SSIIa引起在支链淀粉侧链图谱上的变化与淀粉的DSC T-起始温度间的关系在最近出版的论文中再次得到证实(Nakamura等，(2005)PMB；58(2)：213-27)，参考对转化体和对应“受体”及“供体”品系的值(图6B)。图6B显示对于所产生SSIIa转化体的淀粉的DSC T-起始的温度。DSC T-起始温度毫无例外地比70℃高。该文中详述的最高T-起始值是69.5℃，还如WO03/023024(第21-24页)内所述。\n[0042] 因此，WO03/023024和Nakamura等(2005)均没有教授借以可产生DSC T-起始温度超过70℃的稻淀粉的途径。\n[0043] 然而，较高的DSC T-起始温度迄今为止是受欢迎的，因为它是改良的淀粉热稳定性的重要特征并且也是因热效应所致在结晶体结构上的变化的重要特征。\n[0044] 因此，本发明的目标是提供具有新特性、尤其具有改良的热稳定性的稻淀粉和米粉以及制备它们的手段和方法。\n[0045] 迄今不知道增加可溶性淀粉合酶II的基因表达怎样影响植物内的淀粉特性。高磷酸盐含量是需要的，因为这产生淀粉的改良物理化学特征并且因此产生淀粉的新应用。\n[0046] 因此，本发明的又一个目标是提供借以能够在体内增加植物淀粉的磷酸盐含量的方法。\n[0047] 这些目标通过使用在专利权利要求书内详述的用途形式而实现。\n[0048] 本发明涉及与来自相应未遗传修饰的野生型植物细胞的淀粉相比(100％)，用于增加遗传修饰的植物细胞的淀粉的磷酸盐含量至150-500％的方法，其中\n[0049] a)植物细胞通过导入编码可溶性淀粉合酶II的外来核酸分子而受到遗传修饰，并且\n[0050] b)这种可溶性淀粉合酶II得到过量表达。\n[0051] 在本发明的上下文中，术语“淀粉的磷酸盐含量”理解为意指与淀粉的葡萄糖单体共价结合的磷酸基团。\n[0052] 在本发明的上下文中，术语“淀粉的磷酸盐含量增加”理解为意指与来自相应野生型植物细胞的淀粉(100％)相比，在C6位置上磷酸盐含量增加至150-500％，优选地至\n160-400％并且尤其优选地至170-380％。\n[0053] 在本发明的上下文中，术语“在C6位置上磷酸盐含量”理解为意指如此磷酸基团的含量，其中所述的磷酸基团结合在淀粉的葡萄糖单体的碳原子位置“6”上。原则上，葡萄糖单元的位置C3和C6可以在淀粉内被体内磷酸化。在本发明的上下文中，位置C6上的磷酸盐含量(＝C-6-P含量)借助下文所述的目视酶测定法(Nielsen等，1994，Plant Physiol.105，111-117)通过测定葡萄糖-6-磷酸而确定；(测定在位置C6上的磷酸盐含量(C-6-P含量))。\n[0054] 本发明中非常令人吃惊的是与野生型(100％)相比，有可能增加磷酸盐含量至明显大于150％。\n[0055] 在本发明的上下文中，淀粉的磷酸盐含量升高是在体内实现，而不是在体外例如通过使预提取的淀粉化学磷酸化而实现。因此，本发明的优点是可以省去用于化学磷酸化的化学剂。\n[0056] 在本发明的上下文中，术语“遗传修饰的植物细胞”意指植物细胞受到遗传修饰，所述的遗传修饰导致与相应未遗传修饰的野生型植物细胞的可溶性淀粉合酶II(＝SSII)活性相比，SSII活性增加。\n[0057] 在本发明的上下文中，术语“野生型植物细胞”意指充当用于本发明方法的原材料的植物细胞，即除已经导入并导致可溶性淀粉合酶II(＝SSII)活性增加的遗传修饰之外，它们的遗传信息与遗传修饰的植物细胞的遗传信息相对应。\n[0058] 在本发明的上下文中，术语“相对应”意指当比较多个对象时，彼此相互加以比较的所讨论对象维持在相同条件下。在本发明的上下文中，在野生型植物细胞上下文中的术语“相对应”意指彼此相互加以比较的植物细胞在相同条件下培养并且它们优选地具有(在培养中的)相同年龄。\n[0059] 术语“培养年龄”理解为意指(植物)生物在营养培养基内度过或生长的时间段。\n这可以是例如从播种至收获的时间段或植物细胞在组织培养基内受到培养直至某个发育期期间的时间段。在本发明的上下文中，这意指彼此相互加以比较的植物细胞在相同培养条件下度过相同的发育时间段。\n[0060] 在本发明的上下文中，术语“外来核酸分子”理解为意指这样的分子，所述分子不天然地于相应野生型植物细胞内、或不天然地在相应野生型植物细胞内以具体空间排列而存在、或者该分子位于植物细胞基因组里此分子不天然存在于其中的位置内。外来核酸分子/多核苷酸优选地是由如此不同元件组成的重组分子，其中所述不同元件的组合或具体空间排列不天然存在于植物细胞内。这可以通过例如Southern印迹分析进行验证。\n[0061] 在本发明的上下文中，术语“得到过量表达”意指与相应的未遗传修饰的野生型植物细胞相比，遗传修饰的植物细胞内SSII蛋白质的酶活性增加。为了本发明的目的，术语“得到过量表达”还进一步意指天然地没有任何可检测到的SSII活性的植物或植物细胞在根据本发明受到遗传修饰(即其中将编码可溶性淀粉合酶II的外来核酸分子导入植物细胞基因组)后，具有可通过酶谱法检测的SSII活性。细胞内SSII蛋白质的酶活性增加优选地借助如下文所述的酶谱法来测定(“通过活性凝胶测定SSII活性”)。\n[0062] 在本上下文中，SSII活性增加意指与相应未遗传修饰的细胞相比，SSII活性增加到至少200％、特别地到350-2000％、优选地到600-1500％并且尤其优选地到700-1200％。\n在本发明的上下文中，“SSII活性增加”还意指没有可检测到的SSII活性的植物或植物细胞在根据本发明受到遗传修饰(即其中将编码可溶性淀粉合酶的外来核酸分子导入植物细胞基因组)后，具有可检测到的SSII活性。\n[0063] 在本发明的上下文中，术语“可溶性淀粉合酶II”理解为意指II类可溶性淀粉合酶蛋白质(ADP-葡萄糖1，4-a-D-葡聚糖4-a-D-葡萄糖糖基转移酶；EC2.4.1.21)。可溶性淀粉合酶催化其中底物ADP-葡萄糖的葡萄糖残基转移至a-1，4连接的葡聚糖链而形成a-1，4-键(ADP-葡萄糖+{(1，4)-a-D-葡糖基}(N)＜＝＞ADP+{(1，4)-a-D-葡糖基}(N+1))的糖基化反应。\n[0064] SSII蛋白质的结构显示具有特异性结构域的序列。在“N”末端，SSII蛋白质具有用于转运至质体的信号肽。在羧基末端后是氨基端区和催化结构域(Li等，2000，Plant Physiology123，613-624)。基于多种SSII蛋白质的一级序列比较(http://hits.isb-sib.ch/cqi-bin/PFSCAN)的其它分析已经揭示SSII蛋白质具有三个特定结构域。这些结构域包含由Seq ID No.1内所示的小麦SSII基因序列的核苷酸bp1190至1279(＝区域1)、bp1493至1612(区域2)和bp2147至2350(区域3)编码的氨基酸。\n[0065] 在本发明的上下文中，SSII蛋白质因此理解为意指这样的可溶性淀粉合酶，它的氨基酸序列与Seq ID No.3内所示的区域1具有至少86％、优选至少93％并且尤其优选\n100％的同一性，以及与Seq ID No.4内所示的区域2具有至少83％、优选至少86％并且尤其优选100％的同一性，以及与Seq ID No.5内所示的区域3具有至少70％、优选至少82％、优选86％、特别优选98％并且尤其优选100％的同一性。\n[0066] 在本发明的上下文中，术语“同一性”理解为意指与其它蛋白质的氨基酸相一致的氨基酸的百分数(同一性)。同一性优选地借助计算机程序确定。当彼此加以比较的序列具有不同长度时，以如此方式确定同一性以至于较短序列与较长序列共有的氨基酸数目决定同一性百分数。同一性可以通过公共可获得的已知计算机程序例如ClustalW(Thompson等，(1994)Nucleic Acids Research 22：4673-4680)常规地确定。\n[0067] ClustalW由欧洲 分子生 物学实 验室(Meyerhofstrasse1，D69117，海 德堡 ) 的 Julie Thompson(Thompson@EMBL-Heidelberg.DE) 和 TobyGibson(Gibson@EMBL-Heidelberg.DE)对公众开放。ClustalW还可从多个互联网网页中下载，尤其IGBMC(Institut de Génétique et de BiologieMoléculaire et Cellulaire，B.P.163，\n67404 Illkirch Cedex，法国；ftp://ftp-igbmc.u-strasbg.fr/pub/)和EBI(ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/software/)，以及EBI的全部镜像互联网网页(欧洲生物信息研究所，Wellcome Trust Gemone Campus，Hinxton，Cambridge CB101SD，UK)。\n[0068] 优选地使用ClustalW计算机程序1.8版来确定本文中所述蛋白质与其它蛋白质之间的同一性。将设置如下参数：KTUPLE＝1、TOPDIAG＝5、WINDOW＝5、PAIRGAP＝\n3、GAPOPEN ＝10、GAPEXTEND ＝ 0.05、GAPDIST ＝ 8、MAXDIV ＝ 40、MATRIX ＝ GONNET、ENDGAPS(OFF)、NOPGAP、NOHGAP。\n[0069] 优选地使用ClustalW计算机程序1.8版来确定例如本文中所述核酸分子的核苷酸序列与其它核酸分子的核苷酸序列之间的同一性。将设置如下参数：KTUPLE＝2、TOPDIAGS＝4、PAIRGAP＝5、DNAMATRIX：IUB、GAPOPEN＝10、GAPEXT＝5、MAXDIV＝40、TRANSITIONS：未加权。\n[0070] 在本发明的上下文中，术语“增加SSII活性”意指与相应未遗传修饰的野生型稻植物或野生型稻植物细胞相比，增加SSII活性至少100％、特别是200％-2000％，优选\n400％-1400％并且尤其优选500％-900％。在本发明的上下文中，SSII活性使用下文所述方法(“通过活性凝胶测定SSII活性”)检测。在本发明的上下文中，“增加SSII活性”还意指没有可检测到的SSII活性的植物或植物细胞在根据本发明受到遗传修饰(其中将编码可溶性淀粉合酶的外来核酸分子导入植物细胞基因组)后，显示可检测到的SSII活性。\n[0071] 在优选的实施方案中，本发明的方法还是其中外来核酸分子采取异源的可溶性淀粉合酶II的编码区形式的一种方法。\n[0072] 在本发明的上下文中，“异源的可溶性淀粉合酶II”理解为意指这样的可溶性淀粉合酶II，它不天然存在于植物细胞内，但是它的编码性DNA序列通过重组方法(例如细胞的转化)被导入细胞。在本上下文中，编码性DNA序列源于除所转化的植物细胞或植物以外的植物物种，或不处在自身启动子的控制下。编码性DNA序列优选地源于除所转化的植物细胞或植物以外的植物属。\n[0073] 在本发明的上下文中，术语“植物属”理解为意指生物系统的分级水平。属包含一个或多于一个的物种。属的实例是小麦属(Triticum L.(小麦))。属内的全部物种具有双名名称，其除包含属名以外，还含有种名。因此，普通小麦(Triticum aestivum L.)(普通面包小麦)是小麦属的一个种。\n[0074] 在本发明的上下文中，术语“SSH基因”理解为意指编码“可溶性淀粉合酶II”的核酸分子或多核苷酸(DNA，cDNA)。在又一个实施方案中，SSII基因源自单子叶植物。在优选的实施方案中，SSII基因源自小麦。\n[0075] 在又一个优选实施方案中，本发明的方法是其中使用来自单子叶植物的可溶性淀粉合酶II的一种方法。在尤其优选的实施方案中，SSII由SEQID No.1内所示的核苷酸序列的编码区编码或具有SEQ ID No.2内所示的氨基酸序列。\n[0076] 其淀粉由本发明方法加以修饰的遗传修饰植物可以属于任何植物物种，即属于单子叶植物和双子叶植物。植物优选地是农用作物植物形式，即由人培育的用于营养目的或用于技术、尤其工业目的植物或它们的细胞。本发明的方法优选地在淀粉贮藏植物(例如豌豆、马铃薯、甜马铃薯、木薯、玉米和稻)内应用。\n[0077] 在尤其优选的实施方案中，本发明的方法在稻植物上实施。\n[0078] 本发明还涉及DSC T-起始温度在70℃和80℃之间的稻淀粉。\n[0079] 稻胚乳淀粉的热特征和米粉的热特征可以通过差示扫描量热法(＝DSC)分析。这些热特征显示为具有值DSC T-起始(＝最低凝胶化温度)和DSC T-峰值(＝最高凝胶化温度)的凝胶化温度。\n[0080] 在本发明的上下文中，术语“DSC T-起始温度”因此理解为意指代表淀粉样品或粉末样品开始相变的温度。其特征在于基线的投射和在峰的上升侧越过拐点的切线。\n[0081] 令人惊讶地是本发明的稻植物合成DSC T-起始温度在70℃和80℃之间、特别在\n77℃和80℃之间的淀粉。本发明的稻淀粉特别具有在72和79℃之间、优选在74℃和79℃之间、极特别优选在76℃和78℃之间DSC T-起始温度。\n[0082] 在又一个实施方案中，本发明的稻淀粉具有升高的DSC峰值温度(DSCT-峰值)。\n[0083] 令人惊讶地是本发明的稻植物合成DSC T-峰值温度在80℃和87℃之间、优选在\n81℃和86℃之间的淀粉。尤其优选DSC T-峰值温度在82℃和83℃之间的本发明稻淀粉。\n[0084] 在本发明的上下文中，术语“DSC T-峰值温度”理解为意指这样的温度，在该温度上DSC曲线已经达到最大值并且曲线的一阶微分是零。\n[0085] 在本发明的上下文中，“DSC T-起始”和“DSC T-峰值”温度由下文所述方法(“通过差示扫描量热法对米粉/淀粉的热分析”)定义。\n[0086] 本发明稻淀粉的DSC T-起始温度升高到如此度数的事实令本领域技术人员非常惊讶，特别是因为发明稻淀粉的淀粉磷酸盐含量同时升高。这是因为迄今已经推测增加的磷酸化程度导致淀粉颗粒内的双螺旋和晶序不稳定，这将导致降低的DSC T-起始温度(Safford等，(1998)CarbohydratePolymers35：155-168)。磷酸化程度高的天然淀粉通常在与可比较的低磷酸盐含量淀粉相比的明显较低温度上丧失它们的结晶性。\n[0087] 然而，在种类众多的热加工步骤和应用中需要使用粒状稻淀粉。因此特别有利的是本发明稻淀粉令人吃惊的高DSC T-起始温度或峰值温度，也即在本发明米粉的RV分析期间令人吃惊的高成糊温度，因此这种特性有可能在升高的加工温度上保持淀粉颗粒的结构。\n[0088] 在又一个实施方案中，本发明的稻淀粉具有在位置C6(C-6-P)上每毫克水解淀粉\n0.70nmol与2.5nmol磷酸盐之间的磷酸盐含量。\n[0089] 在优选的实施方案中，本发明的稻淀粉具有在位置C6上每毫克淀粉0.9nmol与\n2.3nmol磷酸盐之间的磷酸盐含量。在尤其优选的实施方案中，位置C6的磷酸盐含量在每毫克淀粉1.5nmol与2.0nmol磷酸盐之间。\n[0090] 此外，本发明延伸至包含本发明稻淀粉的衍生的稻淀粉。\n[0091] 在本发明的上下文中，术语“衍生的稻淀粉”意指其特性在从植物细胞中分离后例如借助热加工、化学加工、酶加工或机械性加工而已经改性的本发明稻淀粉。\n[0092] 本发明的稻淀粉比常规淀粉更适合作为制备衍生的稻淀粉的原材料，原因在于它们因较高的淀粉磷酸盐含量而含有更高比例的活性官能团，并且因为本发明的稻淀粉比含有可比较的磷酸盐含量的淀粉具有更高成糊温度或更高热稳定性。\n[0093] 本发明因此还涉及产生本发明的衍生的稻淀粉的方法，其中本发明的稻淀粉随后受到改性。尤其，本发明的衍生的稻淀粉采取的形式是经热和/或用酸处理的淀粉。\n[0094] 在又一个实施方案中，衍生的稻淀粉采取的形式是淀粉醚，尤其是淀粉烷醚、O-烯丙基醚、羟烷基醚、O-羧甲基醚、含氮的淀粉醚、含磷酸的淀粉醚或含硫的淀粉醚。\n[0095] 在又一个实施方案中，衍生的稻淀粉采取的形式是交联淀粉。\n[0096] 在又一个实施方案中，衍生的稻淀粉采取的形式是淀粉接枝聚合物。\n[0097] 在又一个实施方案中，衍生的稻淀粉采取的形式是氧化淀粉。\n[0098] 在又一个实施方案中，衍生的稻淀粉采取的形式是淀粉酯，特别是通过使用有机酸引入淀粉的淀粉酯。这些淀粉酯尤其优选地采取磷酸酯、硝酸酯、硫酸酯、黄原酸酯、乙酸酯或柠檬酸酯的形式。\n[0099] 本发明的衍生的稻淀粉适用于制药工业、食品领域和/或非食品领域内多种应用。用于制造本发明衍生淀粉的方法是本领域技术人员已知的并且在一般文献中被充分描述。对衍生淀粉制造的综述可在Orthoefer(Corn，Chemistry and Technology，1987年，编者Watson和Ramstad，第16章，第479-499页)内找到。稻淀粉的衍生化作用还在例如Shih和Daigle(2003，Nahrung 47(1)：64-67)内描述。\n[0100] 本发明还涉及本发明的稻淀粉用于制备衍生淀粉的用途。\n[0101] 处于天然形式或衍生形式下的本发明稻淀粉适于食品领域或非食品领域内的多种应用。另一个实施方案包含本发明的衍生性稻淀粉在工业领域内的用途。由于本发明稻淀粉具有小的粒度，本发明的稻淀粉还特别适用于制造照相纸。\n[0102] 本发明还延伸至包含本发明稻淀粉的组合物。\n[0103] 在又一个实施方案中，本发明延伸至包含本发明稻淀粉的米粉。\n[0104] 在又一个实施方案中，本发明的米粉具有在72℃和81℃之间、优选在74℃和80℃之间、特别在77℃和80℃之间的DSC T-起始温度的淀粉。尤其优选DSC T-起始温度在\n76℃和79℃之间的本发明米粉。\n[0105] 在又一个实施方案中，本发明的米粉具有在81℃和90℃之间，优选在82℃和86℃之间的DSC T-峰值温度的淀粉。尤其优选DSC T-峰值温度在82℃和85℃之间的本发明米粉。\n[0106] 在又一个实施方案中，本发明的米粉在RVA(快速粘度分析仪)分析内具有在75℃和90℃之间、优选在78℃和88℃之间、特别在83℃和86℃之间并且尤其优选在80℃和\n85℃之间的RVA PT成糊温度。\n[0107] 在本发明的上下文中，术语“成糊温度”(RVA PT)意指根据RVA分析在粘度发展开始时所测量的值是这样的温度，在该温度上加热过程期间的粘度曲线离开基线并且粘度在\n0.1分钟时间内改变超过36cP。\n[0108] 在本发明的上下文中，“RVA PT成糊温度”以“通过快速粘度分析仪(RVA)分析米粉”的方法加以测定。\n[0109] 与来自相应野生型稻植物的米粉相比，本发明的米粉具有升高的成糊温度(RVA PT)。\n[0110] 在本发明的上下文中，术语“升高的成糊温度(RVA PT)”意指与来自相应野生型稻植物的米粉的成糊温度相比，成糊温度(RVA PT)高5℃至15℃，特别是6℃至14℃，优选\n8℃至12℃。\n[0111] 在又一个实施方案中，本发明米粉的特征是在达到成糊温度与达到峰值粘度之间缩短的时间段。\n[0112] 在本发明的上下文中，术语“在达到成糊温度与达到峰值粘度之间缩短的时间段”(峰时间-成糊时间)意指在根据如下文所述RVA分析的时间方面的差异等于40秒至\n130秒，尤其优选50-100秒并且尤其优选60-75秒。\n[0113] 在又一个实施方案中，本发明涉及制备本发明米粉的方法，其中将本发明的稻米、优选本发明的精米研磨。用于精制及研磨稻米的方法是技术人员已知的并例如在Fitzgerald等(2003，J.of Agrocult.And FoodChemistry 51：2295-2299)或在Ramesh等(1999，Carbohydrate Polymers 38：337-347)内描述。\n[0114] 技术人员知道”稻米”意指稻植物成熟的受精的花。\n[0115] 本发明还延伸至本发明的米粉用于制备食物和/或动物饲料的用途。\n[0116] 本发明还涉及包含本发明米粉的组合物。\n[0117] 在又一个实施方案中，本发明延伸至包含本发明稻淀粉的稻粒。\n[0118] 在优选的实施方案中，稻粒的形式是加工的米粒。\n[0119] 技术人员理解加工意指将粗稻(稻谷)转换成糙米或精米；加工方法是技术人员已知的并且尤其在Fitzgerald等(2003，J.of Agrocult.and FoodChemistry51：\n2295-2299)或在Ramesh等(1999，Carbohydrate Polymers38：337-347)内描述。\n[0120] 在本发明的又一个实施方案中，本发明的稻粒可以用于烹煮。\n[0121] 在又一个实施方案中，稻米具有在烹煮后改变的特性。\n[0122] 在本发明的上下文中，“在烹煮后改变的特性”理解为意指与质量有关的米粒特征(例如烹煮后米粒、特别是已烹煮的米在冷却后或在加热后的质构或米粒硬度及粘度)的改变。\n[0123] 在优选的实施方案中，根据本发明的米粒具有-10g至-200g，优选地-12g至-150g，尤其优选地-15g至-130g(以g张力度量)的粘度。\n[0124] 技术人员理解术语“粘度”意指在烹煮期间的水摄取及加热效应和米粒的均一性以及烹煮后必然伴有的米粒与其它米粒或其它表面(例如叉、筷子等)的黏附。在本发明的上下文中，粘度将理解为意指如方法“测定烹煮特征和烹煮的米粒的质构”内所述，在事先压缩最佳烹煮的米粒之后，通过质构仪测量的最大反向力(张力)。在本上下文中，高的负值意指高于较低负值的粘度。在本发明的上下文中，“最佳烹煮的米粒”理解为意指在达到最小烹煮时间(如由Juliano1984；J.of Tex.Studies15：357-376描述，当90％的稻米不再具有白色中心时)后再烹煮2分钟的米粒。\n[0125] 在本发明中，粘度在最佳烹煮的米粒，即已经在4℃贮藏22小时并随后加温至室温的米粒，或在4℃贮藏(22小时)后已经在烤箱内于80℃再加热5分钟或在4℃贮藏(22小时)后已经借助微波炉再加热5分钟(600W/3分钟)的米粒上测量。\n[0126] 技术人员理解再加热意指对已经使用微波炉、烤箱、水浴或热柜烹煮的稻米再加热1次到4次，并且在再加热期间例如通过置于室温而冷却；优选地，再加热理解为意指单次再加热途径。\n[0127] 由于“粘度”是稻米的重要品质参数，故本发明的米粒提供有利的用途。这尤其包括在半成品应用的领域，其中所述的半成品在生产时仅得到短暂烹煮，随后再次被干燥并仅在它们最终消费(例如在家用、或在流动餐室内)之前才得到再加热或煮沸，而对风味和均一性无任何不利影响。\n[0128] 在本上下文中的又一个品质参数是在水中煮沸时米粒尺度在纵轴方向上的延伸。\n形状上的这种变化是重要的视观品质参数，尤其在长粒米的情况下。在本发明的又一个实施方案中，本发明的米粒通过如此的事实区分，即它们具有从1.50至1.90、尤其优选从\n1.55至1.80并特别优选从1.60至1.70的延伸率(ER)。\n[0129] 在本发明的又一个实施方案中，本发明的米粒与相应野生型稻植物的米粒相比具有增加的延伸率。\n[0130] 在本发明的上下文中，增加的延伸率理解为意指增加5％至25％，优选10％至\n20％，尤其优选4％至18％的延伸率。\n[0131] 在本上下文中，“延伸率”理解为意指已烹煮米粒粒长与未烹煮米粒粒长的比率。\n粒长如所述在方法“测量因烹煮所致的米粒尺度上的变化”内以mm度量；测量优选地使用游标卡尺实施。\n[0132] 在又一个实施方案中，本发明的米粒具有从2.8至6.2，优选从3.5至5.5并且尤其优选从4.0至5.0的CDC值。\n[0133] “CDC值”(CDC＝尺度变化系数)理解为意指因烹煮所致沿长度的尺度变化对沿宽度的尺度变化的比率，即烹煮状态下的粒长(Lc)对未烹煮状态下粒长(Lu)的比率相对于烹煮状态下的粒宽(Wc)对未烹煮状态下的粒宽(Wu)比率＝(Lc/Lu)/(Wc/Wu)。\n[0134] 本发明的又一个主题涉及包含至少一种本发明稻粒的组合物。\n[0135] 本发明还包含其上长有至少一种本发明稻粒的和/或包含本发明稻淀粉的稻植物。\n[0136] 在又一个实施方案中，本发明包含遗传修饰的稻植物细胞和稻植物，其中与相应未遗传修饰的野生型稻植物或野生型稻植物细胞相比，遗传修饰导致增加的可溶性淀粉合酶II(SSII)活性。\n[0137] 还令人惊讶的是与来自相应的野生型植物细胞或野生型植物的稻淀粉相比，本发明的稻淀粉具有某些侧链的改良分布。\n[0138] 在本发明的又一个实施方案中，已经显示与来自相应野生型稻植物的稻淀粉相比，具有从20至25dp(＝聚合程度)的支链淀粉侧链的含量增加5-35％。\n[0139] 在本发明的上下文中，术语“有从20至25dp(＝聚合程度)的支链淀粉侧链的含量”意指与来自相应野生型稻植物细胞或野生型稻植物的支链淀粉的具有20-25DP的侧链含量相比，增加具有20-25DP的支链淀粉的侧链含量5％-35％，优选6％-30％，尤其优选\n8％-24％。\n[0140] 在本发明的又一个实施方案中，具有从6至10的支链淀粉的侧链含量降低。\n[0141] 在本发明的上下文中，术语“降低具有从6至10的支链淀粉的侧链含量”意指与来自相应野生型稻植物细胞或野生型稻植物的支链淀粉的具有6-10DP的侧链含量相比，降低具有6-10DP的支链淀粉的侧链含量20％-60％，优选25％-55％，尤其优选30％-55％。\n[0142] 在本发明的上下文中，侧链分布的测量通过下文所述的方法(“加工米粉/淀粉以便通过高压阴离子交换色谱分析支链淀粉的侧链分布”)实施。短侧链的百分数通过测定全部侧链总数内特定侧链的百分数而测定。全部侧链总数通过测定HPLC色谱内代表从聚合程度DP6-48的峰下总面积而测定。全部侧链总数内特定侧链的百分数通过测定HPLC色谱内代表该侧链的峰下面积相对于总面积的比率而测定。为了测定峰面积，例如可以使用来自Dionex，USA的程序Chromelion6.60。\n[0143] 在本发明的上下文中，术语“野生型稻植物”意指充当用于本发明稻植物的原材料的稻植物，即除所导入的导致可溶性淀粉合酶II(＝SSII)活性增加的遗传修饰之外，它们的遗传信息与遗传修饰的稻植物的遗传信息相对应。\n[0144] 优选地，术语“野生型稻植物”指品种M202，这是具有值为25.2％的S-型支链淀粉的稻品种，该品种的谷粒已经在2005年11月17日保藏在NCIMB Ltd.保藏单位，Ferguson Building，Craibstone Estate，Bucksburn，Aberdeen，Scotland，AB219YA，United Kingdom，编号NCIMB41352。\n[0145] 在本发明方法的上下文中，遗传修饰优选地包含导入至少一种编码可溶性淀粉合酶II(SSII)的外来核酸分子至植物细胞的基因组内，所述的导入至少一种外来核酸分子引起如此事实，即从遗传修饰的植物细胞中及从该植物细胞内再生的植物里可得到的淀粉因为已经导入的SSII表达而与来自相应未遗传修饰的野生型植物细胞内的淀粉相比，具有在C6位置上增加的磷酸盐含量。\n[0146] 在本发明的又一个实施方案中，至少一种外来核酸分子的导入导致本发明的稻淀粉合成。\n[0147] 在优选的实施方案中，本发明的稻植物和稻植物细胞是其中外来核酸分子是异源可溶性淀粉合酶II的编码区的那些稻植物和稻植物细胞。\n[0148] 多种技术是可获得用于导入DNA至植物宿主细胞的。这些技术包含使用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)作为转化介质以T-DNA转化植物细胞、原生质体融合、注射、DNA的电穿孔、通过生物射弹法导入DNA和其它可能技术。\n[0149] 通过基于农杆菌转化的载体对单子叶植物的转化已经例如在Chan等，1993，Plant Mol.Biol.22：491-506；Hiei 等，1994，Plant J.6：271-282；Deng 等，1990，Science in China 33：28-34；Wilmink 等，1992，Plant Cell Reports11：76-80；May 等，1995，Bio/Technology13：486-492；Conner和 Domisse，1992，Int.J.Plant Sci.153：550-555并 在Ritchie等，1993，Transgenic Res.2：252-265内描述。用于转化单子叶植物的备选系统是：通过生物射弹法的转化(Wan和Lemaux，1994，Plant Physiol.104：37-48；Vasil等，\n1993，Bio/Technology11：1553-1558；Ritala 等，1994，Plant Mol.Biol.24：317-325；\nSpencer等，1990，Theor.Appl.Genet.79：625-631)、原生质体转化、电穿孔部分透化的细胞以及通过玻璃纤维导入DNA。已对多种禾谷类物种的成功转化已经例如对大麦(Wan和Lemaux，同上；Ritala等，同上；Krens等，1982，Nature 296：72-74)、对小麦(Nehra等，\n1994，Plant J.5：285-297)、稻(Ishida等，1996，Nature Biotechnology14(6)：745-750)和玉米(Koziel等(1993)，Biotechnology11：194-200)作了描述。\n[0150] 再生本发明方法所产生的遗传修饰的植物细胞导致产生这样的遗传修饰的植物，其中所述植物的遗传信息与相应非遗传修饰的野生型植物的遗传信息对应并且该植物含有导入的用于增加可溶性淀粉合酶II的活性的相同遗传修饰，其中所述的可溶性淀粉合酶II已经存在于本发明方法所产生的遗传修饰的植物细胞内。\n[0151] 在优选的实施方案中，本发明涉及来自日本组(粳稻)的稻植物，所述的日本组包含短粒稻品种和中粒稻品种，例如糯稻(glutinous rice)、短粒稻、日本糯稻(mochi rice)、nishiki稻、ribe稻、红稻(red rice)、黑稻(black rice)、寿司稻(sushi rice)。\n在本发明尤其优选的实施方案中，来自日本组的稻野生型植物用作产生本发明稻植物的原材料。\n[0152] 在又一个更尤其优选的实施方案中，本发明涉及具有S-型支链淀粉的稻植物。\n[0153] 在稻支链淀粉中，可区分L型和S型。L型支链淀粉主要存在于来自印度组的稻中，而相反，S-型支链淀粉则主要存在于来自日本组的稻内。在本发明的上下文中，通过如此事实区分S-型支链淀粉，即与L型相比，短α-1，4-葡聚糖链(DP＜＝10)的量超过20％的总α-1，4-葡聚糖链(DP＜＝24)(Nakamura 2002，Starch54：117-131)。\n[0154] 在甚至尤其优选的实施方案中，本发明包含遗传修饰的稻植物(粳稻(Oryza sativa var.japonica))即转化体GAOS0353-02301，GAOS0353-01301和GAOS0353-01502。\n转化体M202GAOS0353-01502的种子于2005年11月17日以编号NCIMB41353保藏在NCIMB Ltd.，Ferguson Building，Craibstone Estate，Bucksburn，Aberdeen，Scotland，AB219YA，United Kingdom。\n[0155] 在又一个实施方案中，本发明的米粉比来自相应野生型稻植物的米粉具有更低的表观直链淀粉含量。在本发明的上下文中，表观直链淀粉含量优选地由下文所述的方法“测定表观直链淀粉含量”测定。在优选的实施方案中，本发明米粉的表观直链淀粉含量与来自相应野生型稻植物的米粉内的表观直链淀粉含量相比，降低10％至20％，尤其优选12％至\n18％并且甚至尤其优选13％至15％。\n[0156] 在本发明的又一个实施方案中，所导入的编码可溶性淀粉合酶II的外来核酸分子处在胚乳特异性启动子控制下。与相应野生型植物的胚乳相比，胚乳特异性启动子有可能增加本发明植物的胚乳内编码可溶性淀粉合酶II的外来核酸分子转录物的量。\n[0157] 优选使用用于胚乳特异性表达的启动子，例如来自稻的谷蛋白启动子(Leisy等(1990)Plant Mol.Biol.14：41-50；Zheng等(1993)Plant J.4：357-366)、来自小麦的HMWG启动子(Anderson等(1989)Nucleic AcidRes 17：461-462)、来自小麦的GBSSII启动子(WO02/02785)、USP启动子(B umlein等(1991)Mol.Gen Genetics 225：121-128)、来自豆的菜豆蛋白启动子(Kawagoe和Murai(1992)Plant J2(6)：927-36)、来自玉米的玉米醇溶蛋白基因的启动子(Pedersen等，(1982)Cell29：1015-1026；Quatroccio等，(1990)Plant Mol.Biol.15：81-93)、来自玉米的皱缩-1启动子(sh-1)(Werr等(1985)EMBO J.4：\n1373-1380)或来自稻的谷醇溶蛋白启动子(Qu和Takaiwa(2004)Plant Biotechnology Journal，2：113-125)。\n[0158] 尤其优选使用来自稻的球蛋白启动子(Nakase等(1996)Gene170(2)：223-226)。\n[0159] 在又一个实施方案中，本发明涉及产生本发明的稻植物的方法，其中本发明的稻植物从本发明的稻植物细胞中再生，并且其中于再生后，选择其中可溶性淀粉合酶II的过量表达导致SSII活性增加的那些稻植物。\n[0160] 在本发明的上下文中，术语“选择”意指在群体内，主观选择的性状是这样的标准，其中根据该标准，培育表现这种性状的植物，而弃去未表现所需性状的那些植物。\n[0161] 在本发明的上下文中，受到选择的植物是具有SSII活性增加的性状的那些植物。\n[0162] 本发明还涉及本发明遗传修饰的稻植物的繁殖材料，其含有本发明的稻植物细胞。\n[0163] 在该上下文中，术语“繁殖材料”包含适用于通过营养途径或有性途径产生子代的植物的那些部分。通过营养繁殖的那些部分例如是插枝或愈伤组织培养物。繁殖材料包含例如果实、种子、幼苗、原生质体、细胞培养物等。繁殖材料优选地是含有胚乳的谷粒。\n[0164] 包含遗传修饰的植物细胞的本发明稻植物的稻粒是本发明的又一个主题。\n[0165] 在又一个实施方案中，本发明包含产生本发明的改性稻淀粉的方法，包括从本发明的稻植物和/或从本发明的米粒和/或从本发明的米粉中提取淀粉。提取方法是技术人员已知的并例如在Wang和Wang(2004，Journalof Cereal.Science 39：291-296)或Patindol和Wang(2003，J.Agric FoodChem.51：2777-2784)内描述。\n[0166] 在又一个实施方案中，本发明涉及抗性淀粉，其中与来自野生型植物内的淀粉的可消化性相比，所述抗性淀粉的可消化性降低。\n[0167] 食物的可消化性尤其由食物包含的淀粉类型决定。很多食物成分甚至在抵达胃和小肠的途中就被降解，并在胃和小肠内被降解。然而，一些淀粉仅在大肠内降解并且因此称作抗性淀粉(＝RS)。这些淀粉可以分成四种类型。第一类型(RS1)包括封闭在完整细胞内的淀粉。因此这种淀粉很少接触到消化酶。这适用于例如完整谷物颖果或粗磨的谷物颖果内的淀粉和豆类内的部分淀粉。第二类型(RS2)包括在小肠内不以天然形式被消化的淀粉。在这种情况下其原因在于淀粉粒的结构和淀粉粒内淀粉分子的排列所致。第二类型包括例如生马铃薯、绿色香蕉或直链淀粉丰富的玉米品种(直链淀粉玉米(amylomaize))内的淀粉。第三类型(RS3)包括所谓的回生淀粉。这种类型的淀粉在已加热的含淀粉食物如面包和烹煮的马铃薯冷却后产生。在此期间，一些淀粉分子重排，并且晶态带形成以及不能够接触消化酶(例如直链淀粉)。第四类型(RS4)包括例如通过交联或酯化(乙酰化等)所产生的不可消化的化学改性淀粉。\n[0168] 抗性淀粉的促健康效应尤其由其发酵影响细菌反应、增加粪便重量并导致产生代表大肠粘膜细胞的主要能源供应者的短链脂肪酸组成。此外，在肿瘤抑制中的作用归因于丁酸(进一步细节将尤其在Wisker(2001)，UGB-Forum01：75-77内找到)。\n[0169] 例如在含有高比例全谷粒(及因此RS1)的面包的消费者内葡萄糖和/或胰岛素水平低于由精制谷物组成的面包的消费者内葡萄糖和/或胰岛素水平。已经发现血液葡萄糖的较少增加似乎与众多豆类有关。这显示1型抗性淀粉影响食物对血液葡萄糖具有的效应。除血液葡萄糖和胰岛素之外，糖类对消耗脂肪也非常重要。持续波动的胰岛素水平干扰脂肪的消耗并且还引起增加的饥饿感。为此，可消化性低或下降并且因此仅导致胰岛素水平轻微上升的糖类是有利的。因此在合适产品内的此类淀粉有可能满足有关吸收少量糖类(“低糖”)的膳食的全部要求。\n[0170] 已经预计与野生型淀粉相比，根据本发明方法产生的淀粉显示明显减少的可消化性。当研究分离的淀粉时，这显而易见(图3)。因此，根据本发明方法产生的淀粉表现出有可能在纤维增加的膳食中及“低糖”领域内及其它领域内利用的高营养品质。\n[0171] 本领域技术人员根据消化所需要的时间区分淀粉：用20分钟消化的淀粉称作“快速消化淀粉(RDS)”，用60分钟的淀粉称作“缓慢可消化淀粉(SDS)”并且在120分钟后剩下的淀粉称作“抗性淀粉(RS)”。\n[0172] 令人惊讶的是，分离的淀粉的可消化性减少。优选可消化性与野生型相比减少10至65％的淀粉，特别优选可消化性减少10至55％，极特别优选可消化性减少12至45％并且最特别优选可消化性减少15至30％。\n[0173] 这意指与野生型淀粉相比，本发明的淀粉内抗性淀粉RS百分数增加。RS含量测定为从总淀粉干重(100％)中减去120分钟后自总淀粉中所释放的葡萄糖的百分数的差异(如下文方法15内所述)。在该上下文中，增加意指RS含量增加到100-750％、优选地到150-700％并且尤其优选到200-600％。\n[0174] 在另一个实施方案中，本发明的稻淀粉显示15％-45％、优选17％-40％并最优选\n20％-38％的RS含量。\n[0175] 本发明还包括包含如此淀粉的植物和植物细胞，其中所述的淀粉已经通过本发明方法产生并表现与来自相应野生型植物或野生型植物的淀粉相比，减少的可消化性。\n[0176] 材料和方法\n[0177] 在实施例中使用如下方法。这些方法可以用于实施本发明的方法；它们代表本发明的具体实施方案，但是不使本发明限于这些方法。技术人员知道可以通过修改所述的方法和/或通过将单个方法学部分替换成另外的方法学部分而等效实施本发明。仅一个例外是“测定淀粉结合性葡萄糖-6-磷酸含量”的方法，在本发明的上下文中，该方法仅以下文在14下所述的方式实施。\n[0178] 1)植物材料和栽培\n[0179] 稻植物：粳稻，品种M202。\n[0180] 种 子 在 2005 年 11 月 17 日 保 藏 于 NCIMB Ltd.(National Collection ofIndustrial Bacteria，Ferguson Building，Craibstone Estate，Bucksburn；\nAberdeen，AB219YA，UK)。品种M202-野生型的种子给予保藏号NCIMB41352；转化体M202-GAOS0353-01502的种子给予保藏号NCIMB41353。\n[0181] 稻植物在温室内在如下方案条件下培育：播种：基质：在1.6I玫瑰花盆(制造商：\nH.Meyer，德国)内100％水藓泥炭和100I砂/qm与粘土：180kg/qm的混合物。pH：5.4-6.2；\n谷物肥料：Hakaphos(Compo，德国)14％N-16％P-18％K+2％Mg；2kg/qm；\n[0182] 施肥：3.5g/植物直至开花：NH4NO3(1.75g)和Flory2Basis(制造商：Euflor，德国)：1.75g；3％N-16％P-15％K+5％Mg。\n[0183] 温度：白昼28℃/夜晚：24℃(16小时/8小时)；相对空气湿度：85-95％；\n[0184] 光照：16小时，350μ爱因斯坦/平方米秒。\n[0185] 2)序列的来源和用于转化的构建体\n[0186] 使用来自小麦的序列Ta_SSIIa以转化稻。分离及克隆如WO97-45545内所述实施(此后称为“pTaSS1”)。所用的转化载体AH32-191在实施例1内描述。\n[0187] 3)稻植物的转化及再生\n[0188] 稻植物通过Ishida等(1996，Nature BioTechnology，14(6)：745-750)所述的方法得以转化及再生。\n[0189] 4)稻粒的加工\n[0190] 为产生足够量的研究材料，稻植物在室温条件下培育并在充分成熟时收获。为进一步干燥，成熟(即充分发育的)稻粒在37℃贮藏3-7日。\n[0191] 此后，通过脱壳机(Laboratory Paddy sheller，Grainman，Miami，Florida，USA)从谷壳中释放米粒，并且通过碾制1分钟(Pearlest RicePolisher，Kett，Villa Park，CA)加工得到的糙米以产生精制米。精制米用于完整谷粒的分析(例如碱消值、米粒尺度、粒重等)的原材料。\n[0192] 为研究谷粒组成以及淀粉和米粉的特征，精米通过实验磨粉机(Cyclotec，Sample mill，Foss，丹麦)磨碎以产生米粉。实验磨粉机的原理是磨料仅当达到小于0.5mm粒度时才离开。磨粉过程在全部样品材料离开磨腔时结束。\n[0193] 5)通过Northern印迹分析淀粉合酶II的表达水平\n[0194] 通过Northern印迹分析稻内来自小麦的淀粉合酶II的表达。为此目的，对于每种独立转基因事件，研究三粒未成熟的稻粒(开花后约15日)。通过匀浆方式，将冷冻的稻粒在Retsch磨粉机(型号MM300)内在具有4.5mm钢球的96孔平板内以频率30赫兹振摇\n30秒。此后，通过96孔规模的Promega RNA提取试剂盒，按制造商说明分离RNA(SV96总RNA分离系统，定货号Z3505，Promega，Mannheim)。\n[0195] 每样品2μg RNA形成相同体积并用相等体积的RNA样品缓冲液(65％(v/v)甲酰胺、8％甲醛、13％(v/v)凝胶缓冲液(见上文)、50μg/ml溴化乙啶)处理。加热(10分钟，65℃)并立即在冰上冷却后，使用RNA运行缓冲液(20mM MOPS pH8.0、5mM乙酸钠、1mM EDTA)，使RNA在恒定电流50-80mA在1.2％浓度(w/v)琼脂糖凝胶(20mM MOPS pH8.0、5mM乙酸钠、1mM EDTA、6％(v/v)甲醛)上分离2小时。\n[0196] 此后，将RNA使用10×SSC(1.5M NaCl，150mM柠檬酸钠pH7.0)通过扩散印迹法转移至Hybond N膜上并通过紫外线照射固定在该膜上。\n[0197] 质粒AH32-191(Bp4568-5686)内构成SSII cDNA的5′区域的约1kbSpeI/BspHI片段用于杂交Northern印迹膜。该DNA片段借助来自Roche的随机引发DNA标记试剂盒(订货编号1004760)，使用32P-α-dCTP，根据制造商说明进行放射标记。\n[0198] 在添加放射标记的DNA用于杂交之前，将Northern印迹膜在水浴内与杂交缓冲液(250mM磷酸钠缓冲液pH7.2、1mM EDTA、6％(w/v)SDS、1％(w/v)BSA)在60℃预温育4小时，温和振摇。在温育16小时后，移走杂交溶液，并将膜在水浴内依次与3×SSC和2×SSC(见上文)在60℃洗涤并温和振摇，以除去非特异性结合的DNA分子。为检测标记的RNA，将膜在X射线胶片上在-70℃放射自显影1至3日。\n[0199] 6)通过活性凝胶法测定SSII活性\n[0200] 不成熟稻粒内的不同淀粉合酶活性通过活性凝胶(酶谱)法检测，其中蛋白质提取物在聚丙烯酰胺凝胶内于天然条件下分离并随后与合适的底物温育。形成的反应产物(淀粉)在凝胶内通过Lugol′s溶液(2％(w/v)KI；0.2％(w/v)I2)染色。\n[0201] 单个不成熟的稻粒(开花后约15日，从开花期开始日起测量)在液氮内速冻并在\n150-200μl冷的提取缓冲液(50mM Tris/HCl pH7.6、2.5mMEDTA、2mM DTT、4mM PMSF、0.1％(w/v)糖原、10％(v/v)甘油)内匀浆。在离心(15分钟，13000g，4℃)后，将清亮的上清液转移至新鲜反应容器内并将一个等分试样的提取液用于通过Bradford的方法(1976，AnalBiochem 72：248-254)测定蛋白质含量。\n[0202] 蛋白质提取物通过7.5％浓度的连续聚丙烯酰胺凝胶(7.5％AA/BAA37.5∶1；\n25mM Tris/HCl pH7.6、192mM甘氨酸、0.1％(w/v)APS、0.05％(v/v)TEMED)，使用工作浓度的运行缓冲液(25mM Tris/HCl、192mM甘氨酸)加以分离。凝胶在上样前，在8mA并在4℃实施预电泳30分钟以便除去游离基。对每个样品，施加15μg蛋白质并在4℃电泳2-2.5小时。\n[0203] 此后，凝胶在室温在15ml温育缓冲液(0.5M柠檬酸钠pH7.0、25mM乙酸钾、2mM EDTA、2mM DTT、0.1％(w/v)支链淀粉、50mM三(羟甲基)甲基甘氨酸/NaOH pH8.5、1mM ADP-葡萄糖)内温育过夜并持续振摇。形成的淀粉借助Lugol′s溶液染色。\n[0204] 为通过酶谱法测定SSII活性增加的程度，将遗传修饰的株系的蛋白质提取物进行逐步稀释并根据以上所述方法使用。用Lugol′s溶液染色酶谱后，活性增加的程度通过目视比较不同稀释物与未稀释野生型的SSII带的密度而确定。\n[0205] 7)从米粉中提取稻淀粉\n[0206] 从 米 粉 中 提 取 稻 淀 粉 由 类 似 于Wang 和 Wang(2004；Journal of CerealScience39：291-296)所述的方法实施。\n[0207] 10g米粉与40ml0.05％(w/v)NaOH在振荡器上室温温育16-18小时。此后，将混悬液转移至Warring搅拌器以完成消化，并低速混合15秒然后高速45秒。为除去较粗糙的成分(例如细胞壁)，使混悬液通过125μm筛目的筛子和随后通过63μm筛目的筛子。在\n1500转/分钟离心15分钟后(Microfuge3.OR；Heraeus)，倾析上清液并使用铲子移走位于沉淀表面的蛋白质层。沉淀的剩余部分在0.05％(w/v)NaOH内重悬，并且重复上文所述方法。此后，沉淀重悬于水中，并且使用HCl调整混悬液的pH至6.5-7。用水(总共3次)洗涤获得的稻淀粉，每个洗涤步骤包含离心沉淀(1500转/分钟，15分钟，室温)、弃去上清液并重悬于新鲜水内。在最后洗涤步骤之前，再次检查pH并根据需要用HCl调整至pH7。将最后洗涤步骤后的稻淀粉沉淀重悬于丙酮内并进行离心沉淀，并且弃去上清液。在将沉淀再次重悬于丙酮内后，将混悬液倾入培养皿并在通风柜内室温干燥至少18小时。\n[0208] 在最后步骤中，在研钵内研磨稻淀粉以产生直接用于全部后续分析的精细粉末。\n[0209] 8)加工米粉/淀粉用于通过高压阴离子交换色谱而研究支链淀粉侧链分布[0210] 对于每种样品，将10mg米粉或稻淀粉在2ml Eppendorf杯内称重并用250μl90％(v/v)DMSO处理。样品在60℃振摇溶解后，添加375μl水并将混合物在95℃温育1小时。\n300μl的16.7mM乙酸钠，pH3.5和0.5U来自假单胞菌(Pseudomonas sp.)的异淀粉酶(Megazyme；Bray，爱尔兰)添加至200μl反应混合物内。在37℃温育24小时后，再添加\n0.5U异淀粉酶，并且再继续温育24小时。\n[0211] 对于色谱，将100μl反应混合物用水1∶5稀释并随后经Ultrafree-MC滤管(Millipore)过滤。注射约90μl的滤液。\n[0212] 色谱：\n[0213] 方法：\n[0214] HPLC系统：GP50Dionex梯度泵\n[0215] ED50Dionex电化学检测器/PAD\n[0216] AS50自动进样器\n[0217] 柱温箱\n[0218] 柱：Dionex CarboPac PA1004×250mm(P/N046110)，\n[0219] 具有保护柱PA1004×50mm(P/N046115)\n[0220] 设备设置：\n[0221] \n[0222] HPAEC程序：\n[0223] 压力.低限＝50\n[0224] 压力.高限＝3500\n[0225] ％A.Equate＝″NaOH0.15M″\n[0226] ％B.Equate＝″醋酸钠1.0M″\n[0227] ％C.Equate＝″在NaOH0.15M内的酸酸钠1.0M″\n[0228] ％D.Equate＝″Millipore水″\n[0229] ECD.数据收集速率＝1.0\n[0230] 波形时间＝0.00，电位＝0.05\n[0231] 波形时间＝0.20，电位＝0.05，积分＝开始\n[0232] 波形时间＝0.40，电位＝0.05，积分＝结束\n[0233] 波形时间＝0.41，电位＝0.75\n[0234] 波形时间＝0.60，电位＝0.75\n[0235] 波形时间＝0.61，电位＝-0.15\n[0236] 波形时间＝1.00，电位＝-0.15\n[0237] 池＝开\n[0238] 洗液体积＝500\n[0239] 等待冲洗状态\n[0240] 针高度＝2\n[0241] CutSegmentVolume＝10\n[0242] 注射速度＝4；\n[0243] 循环＝0\n[0244] 等待温度＝否\n[0245] 等待样品准备完毕\n[0246] 0.000流速＝1.00\n[0247] ％B＝0.0\n[0248] ％C＝0.0\n[0249] ％D＝0.0\n[0250] 曲线＝5\n[0251] 上载\n[0252] 进样\n[0253] 等待\n[0254] ECD自动为零\n[0255] ECD_1.AcqOn\n[0256] 流速＝1.00\n[0257] ％B＝0.0\n[0258] ％C＝0.0\n[0259] ％D＝0.0\n[0260] 曲线＝5\n[0261] 5.000流速＝1.00\n[0262] ％B＝11.0\n[0263] ％C＝0.0\n[0264] ％D＝0.0\n[0265] 曲线＝5\n[0266] 流速＝1.00\n[0267] ％B＝11.0\n[0268] ％C＝0.0\n[0269] ％D＝0.0\n[0270] 曲线＝4\n[0271] 130.000流速＝1.00\n[0272] ％B＝35.0\n[0273] ％C＝0.0\n[0274] ％D＝0.0\n[0275] 曲线＝4\n[0276] 132.000流速＝1.00\n[0277] ％B＝0.0\n[0278] ％C＝100.0\n[0279] ％D＝0.0\n[0280] 曲线＝5\n[0281] 133.000流速＝1.00\n[0282] ％B＝0.0\n[0283] ％C＝100.0\n[0284] ％D＝0.0\n[0285] 曲线＝5\n[0286] 142.000流速＝1.00\n[0287] ％B＝0.0\n[0288] ％C＝0.0\n[0289] ％D＝0.0\n[0290] 曲线＝5\n[0291] 143.000流速＝1.00\n[0292] ％B＝0.0\n[0293] ％C＝0.0\n[0294] ％D＝95.0\n[0295] 曲线＝5\n[0296] 152.000流速＝1.00\n[0297] ％B＝0.0\n[0298] ％C＝0.0\n[0299] ％D＝95.0\n[0300] 曲线＝5\n[0301] ECD_1.AcqOff\n[0302] 结束\n[0303] 数据评估使用Dionex Chromeleon v6.60(Dionex Corporation，Sunnyvale，California，USA)执行。“2004年3月的6.60版“指导及用户手册”可以从Dionex获得或从主页(http://www.dionex.com)下载。\n[0304] 为了相互比较图谱，将已鉴定的不同麦芽寡糖的峰对每一图谱进行均值归一化(全部峰面积的总和＝1)。评估基于如Dionex Chromeleon v.6.60内所述用于“对数基线”的“力共同基线”。为如此评估，将对数基线紧挨第一侧链峰之前并直达测量路径的最短图谱的最末可估值峰放置；这形成用于对全部图谱计算最末可估值峰的格式。\n[0305] 9)测定已烹煮米粒的烹煮特征和质构\n[0306] 使用已经如在4)“米粒的加工”下所述加工的精制米粒以便测定烹煮特征。在烹煮之前，测定米粒尺度和粒重。烹煮以20∶1的水-米比率进行。\n[0307] 将水煮至沸腾，加入米，并减少热输入量以至于水轻微沸腾(在此期间，每隔3分钟搅动米)。最短烹煮时间通过如Juliano(1984；J.ofTex.Studies15：357-376)所述的玻璃板试验测定。为了测定，在每一例子中，将10粒米以1分钟间隔夹在两片玻璃板之间。在\n90％的米粒不再显示白色中心的时间点上达到最短烹煮时间。通过再延长烹煮过程2分钟而达到最佳烹煮时间。米粒通过筛子得到粗滤并在室温冷却。此后，再次测定已烹煮米粒的米粒尺度及重量。用新烹煮的米粒(烹煮后约1小时)，在已于4℃贮藏22小时并随后再加热至室温的米粒，或在4℃贮藏(22小时)并随后使用烤箱或微波炉再加热的米粒上测定质构。为在烤箱内再加热烹煮的米粒，将烹煮的米粒放入已经用铝箔密封的铝盘内以避免水分丧失。铝盘在烤箱内在80℃温育20分钟。米粒在微波炉内的再加热于合适的微波炉容器内在360瓦上实施3分钟。在两种再加热过程后，将米粒在室温贮藏30分钟以确保测量期间米粒的均一温度。\n[0308] 使用直径2.5cm的圆环状探头的质构仪TAXT2(Stable Micro Systems，Godalming，UK)和(从Champagne等(1998)Cereal Chem.75(2)：181-186中改良)双压缩试验作为测量方法，测量来自以上所述实验中的已烹煮稻米的质构。为了测量，稻米在第一轮中被压缩，随后解压缩并再次压缩，连续记录米粒施加至探头的力(压力或拉力)。在每一例子中待分析的每种样品在3粒米上测量10次，米粒以如此方式放在探头下以至于米粒既不相互接触，也不超过探头的边缘。记录的参数是已烹煮米粒的硬度(H)(在第一压缩步骤期间的最大力)和粘度(-H)(在第一压缩步骤期间的最小力)，见图2。单独评估一个样品的全部量值并随后建立所讨论参数的平均值。\n[0309] 10)测量因烹煮所致的米粒尺度的变化\n[0310] 使用来自Systat(Erkrath，德国)的软件”SigmaScan Pro”版本5.0.0测量米粒尺度(长度、宽度和面积)。为了测量，在每一例子中，扫描30颗(未烹煮和烹煮的)米并且形成的图像通过该软件评估。记录或计算如下参数：\n[0311] Lu-未烹煮米的粒长Wu-未烹煮米的粒宽\n[0312] Lc-烹煮米的粒长Wc烹煮米的粒宽\n[0313] L/W比＝Lu/Wu或L/Wc\n[0314] ER-延伸率＝Lc Lu\n[0315] CDC-尺度变化系数＝(Lc-Lu)/(Wc-Wu)\n[0316] 11)通过差示扫描量热法(＝DSC)对米粉/淀粉的热分析\n[0317] 约10mg(干重)的米粉或稻淀粉在不锈钢盘(Perkin Elmer，“大体积不锈钢盘”[03190218]，体积60μl)内于过量的双蒸水(优选30μl)内称重并且将该盘牢牢密封。样品在金刚石型DSC仪器(Perkin Elmer)内从20℃至150℃以热速率10℃/分钟加热。使用空的密封不锈钢盘作为对照。该系统使用确定量的铟进行校正。\n[0318] 通过来自Pyris(Perkin Elmer，7.0版)的软件程序分析数据。通过分析单个峰的一级相变至T-起始(℃)、T-峰(℃)、T-结束(℃)和dH(J/g)(标准是平直基线)加工可估值的原始数据。\n[0319] DSC T-起始的特征在于基线的投射和在峰的上升侧越过拐点的切线。DSC T-起始表征相变的开始。\n[0320] 最大温度DSCT-峰值指DSC曲线已经达到最大值的最大温度(即曲线的一阶微分是零的温度)。\n[0321] 对于Pyris内所用的功能(计算-峰面积)，手工输入起始温度和终末温度用作基线拟合。\n[0322] 12)测定表观直链淀粉含量\n[0323] 表观直链淀粉含量由来自Juliano(1971，Cereal Science Today16(10)：\n334-340)的改良方法测定。\n[0324] 对于每一样品，在100ml Erlenmeyer烧瓶内(两次)称重50mg米粉并将其随后用1ml95％浓度乙醇和9ml1M NaOH湿润。\n[0325] 以对米粉样品的相同方式平行处理具有确定量的纯直链淀粉的烧瓶，以建立标准曲线。烧瓶进行短暂溶胀以混合样品并随后在沸水浴内温育20分钟，温和振摇。在室温冷却5-10分钟后，用水补足体积至100ml。\n[0326] 100μl等分试样用1ml试验溶液(10mM乙酸、0.004％(w/v)I2；0.04％(w/v)KI)处理，充分混合并且在620nm上对相应空白值测定吸收率。直链淀粉含量借助用于建立校正曲线的直链淀粉标准物加以计算。\n[0327] 13)通过快速粘度分析仪(RVA)分析米粉\n[0328] 本项分析的原理基于使水和米粉的混悬液接受定义的温度和剪切方法处理，在此期间连续记录混悬液的粘度。所用的测量仪器是来自NewportScientific(Macclesfield，UK)的具有相应软件”Thermocline for Windows”，2.3版的RVA Super3。\n[0329] 为了分析，将3g米粉(作为样品材料的纯干重进行称重，校正为0％水分)在分析容器内称重，用25ml水处理，并且将分析容器引导至已经提供搅拌器后的仪器内。\n[0330] 施加如下的温度和剪切曲线：\n[0331] \n[0332] 在测量结束后，确定如下参数：\n[0333] 峰值粘度(测量时间2分钟至7分钟期间的最高粘度)\n[0334] 低谷粘度(测量时间7分钟至12分钟期间的最低粘度)\n[0335] 终粘度(在测量结束时的粘度)\n[0336] 破损值＝峰值粘度-低谷粘度\n[0337] 回值＝终粘度-低谷粘度\n[0338] 成糊温度(在0.1分钟时间间隔期间粘度变化超过36cp的温度)\n[0339] 峰值时间(达到峰值粘度的时间)。\n[0340] 14)测定C6位置上的磷酸盐含量(C6-P含量)\n[0341] 在淀粉内，葡萄糖单元的位置C3和C可以被磷酸化。为测定淀粉的C6-P含量(Nielsen等，1994，Plant Physiol.105：111-117的改良方法)，50g米粉在95℃于\n500μl0.7M HCl内水解4小时，连续振摇。此后，样品在15,500g离心10分钟，并且将混浊物从上清液内通过滤膜(0.45μM)除去。20μl清亮的水解产物与180μl咪唑缓冲液(300mM咪唑，pH7.4；7.5mMMgCl2，1mM EDTA和0.4mM NADP)混合。测量在光度计内在340nm处实施。在已经记录基础吸收率后，通过添加2单位葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(来自肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)，Boehringer Mannheim)启动酶反应。吸收率变化的原因是葡萄糖-6-磷酸与NADP等摩尔地转换成6-磷酸葡萄糖酸和NADPH，在以上提及的波长上记录NADPH的形成。该反应受到监测直至达到平台期。该测量的结果给出在水解产物内的葡萄糖-6-磷酸含量。水解的程度从相同水解产物相对于所释放的葡萄糖的含量而确定。水解的程度用于建立葡萄糖-6-磷酸含量与来自新鲜重量内已水解淀粉的百分数的联系。为此目的，10μl水解产物用10μl0.7M NaOH中和并随后用水1∶100稀释。4μl这种稀释物用196μl测量缓冲液(100mM咪唑pH6.9；5mM MgCl2、1mM ATP、0.4mM NADP)处理并用于测定基础吸收率。反应通过添加2μl酶混合物(测量缓冲液内的己糖激酶1∶10；\n来自酵母的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶1∶10)并且在340nm处监测直至达到平台期。测量的原理与第一次反应的原理相对应。\n[0342] 本次测量的结果给出在水解期间从原材料内存在的淀粉中已经释放的葡萄糖的量(单位mg)。\n[0343] 此后，将两次测量的结果彼此建立联系以便表示为每毫克已水解淀粉的葡萄糖-6-磷酸盐含量。与建立葡萄糖-6-磷酸的量与样品鲜重的联系不同，本计算仅建立葡萄糖-6-磷酸的量与淀粉内如此部分的联系，其中所述的部分已经被充分水解以产生葡萄糖并可以因此还视作葡萄糖-6-磷酸的来源。\n[0344] 15)测定抗性淀粉含量(可消化性)\n[0345] 抗性淀粉含量通过以Englyst等(1992，Europ.J.of Clinical Nutrition，46/2：\n33-50)所述方法为基础并具有如下所述修改的方法而测定。\n[0346] 酶溶液通过在37℃于8ml水内10分钟提取1.2g胰酶(Merck)而制备。在离心(3000转/分钟；室温，10秒)，5.4ml上清液与84U淀粉糖苷酶(Sigma-Aldrich，Taufkirchen)混合并用水补足至终体积7ml。平行地，将每份样品(鲜重)10mg稻淀粉在\n2ml反应容器内与0.75ml乙酸钠缓冲液(0.1M乙酸钠，pH5.2；4mM CaCl2)混合并在37℃温育5分钟以使混合物温暖。\n[0347] 淀粉的消化通过向每种混合物添加0.25ml酶溶液而启动。对照混合物含有水以替代所添加酶溶液。100μl等分试样在20、60和120分钟后取出并直接添加至4倍体积乙醇内，因而使酶灭活。这种稀释物用于测量葡萄糖含量。\n[0348] 为此目的，2μl稀释的样品与200μl测量缓冲液(100mM咪唑/HClpH6.9、5mM MgCl2、1mM ATP、2mM NADP)混合，并在340nm处测量样品的吸收率。葡萄糖的转化通过添加\n2μl酶混合物(10μl己糖激酶、10μl葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、80μl测量缓冲液)而启动，并且随后在340nm处测定NADP向NADPH的等摩尔转换直至达到平台期。在测量的葡萄糖量与(从鲜重减去水含量中计算的)淀粉干重之间的联系产生在适当时间后作为葡萄糖释放的样品的比例。\n[0349] 抗性淀粉的量计算如下：\n[0350] RS[％]＝100×释放的葡萄糖(mg)/淀粉干重(mg)\n[0351] 实施例\n[0352] 实施例1：IIa用于在稻内表达小麦淀粉合酶Il的载体\n[0353] 使用稻转化载体IR103-123(在WO05/030941内描述)和质粒CF31-191(在WO97/45545内以pTaSS1名称描述)。稻转化载体IR103-123的作用是通过来自稻的球蛋白启动子使靶基因胚乳特异性表达。在第一步骤a)中，载体IR103-123用限制酶EcoRV和XhoI进行线性化。质粒CF31-191含有来自普通小麦的淀粉合酶II(SSII)的cDNA。在第二步骤a)中，使用限制酶Ecl136II和XhoI从质粒CF31-191中切下SSII的cDNA。连接在步骤a)内已线性化的载体IR103-123与在步骤a)内获得的质粒CF31-191的片段，产生载体AH32-191。\n[0354] 实施例2：产生具有增加的SSII活性的遗传修饰的稻植物\n[0355] 为产生具有增加的SSII活性(SSII)的遗传修饰的稻植物，质粒AH32-191的T-DNA如Ishida所述(1996，Nature Biotechnology14(6)：745-750)通过农杆菌转移至稻植物内。SSII活性增加通过酶谱法测定。\n[0356] 图1显示与野生型相比，三种用于测定SSII活性的遗传修饰的稻品系的酶谱。所用的材料是从野生型和相应遗传修饰系的不成熟谷粒(开始开花后15日)中提取的量相同的总蛋白质。将来自遗传修饰系的蛋白质提取物逐步稀释，并且活性增加的程度通过目视比较这些泳道内与野生型泳道内SSII带的密度而确定。系GAOS0353-01502的SSII活性高达野生型的谷粒内SSII活性的10倍，而系GAOS0353-01301的SSII活性高达野生型的谷粒内SSII活性的6倍并且系GAOS0353-02301的SSII活性高达野生型的谷粒内SSII活性的2倍。\n[0357] 实施例3：来自具有不同SSII活性水平的不同转基因系的稻淀粉的特征[0358] 稻粒从如实施例2内所产生的植物内收获并随后通过上述方法(“4)加工稻粒”)加工以产生米粉。米粉内的淀粉成分随后通过上述方法(“7)测定C6位置上磷酸盐含量(C6-P含量)”)对C6位置上的磷酸盐含量进行分析。\n[0359] 表1：SSII活性增加的稻淀粉的特征\n[0360] \n[0361] 表1：与野生型(wt)相比，SSII活性增加的稻淀粉的特征。所示数据显示SSII活性(作为野生型的倍数)和淀粉结合性葡萄糖-6-磷酸(C-6-P)的含量。\n[0362] 可以看到淀粉合酶II的活性水平与C6位置上的磷酸盐含量相关。系\nGAOS0353-01301的SSII表达表达增加6倍，而C-6-P含量与野生型相比几乎加倍。最明显的效应由系GAOS0353-02501显示，它的SSII表达增加10倍，而C-6-P含量与野生型(100％)相比增加超过350％。\n[0363] 实施例4：具有不同SSII表达水平的不同遗传修饰系的稻粒、稻淀粉和米粉的特性列表\n[0364] 表2：与野生型相比，来自具有改良SSII表达的稻粒内稻淀粉的特性：\n[0365] \n[0366] 给出的数据是不成熟稻粒内的SSII活性(作为野生型的倍数)、显现超过野生型的改性淀粉内的支链淀粉侧链淀粉的范围(AP-SC)、磷酸盐含量(C6P)和以℃和％为单位的稻淀粉DSC值(与野生型相比)。(n.d.＝未检测)。\n[0367] 与野生型相比，作为SSII活性水平函数的来自遗传修饰系的淀粉的C6位置磷酸盐含量显著增加。\n[0368] 表3：与野生型相比，来自具有改良SSII表达的稻粒中的米粉的特性：\n[0369] \n[0370] 给出的数据是不成熟稻粒内的SSII表达(作为野生型的倍数)、以℃和以野生型百分数(％)为单位的米粉DSC值的变化。\n[0371] 遗传修饰系的表观直链淀粉含量仅显示轻微的改变；它们均比野生型的表观直链淀粉含量略低。\n[0372] 作为SSII活性函数的米粉的热稳定性和从米粉中分离的淀粉的热稳定性在不同遗传修饰系内逐渐增加(比较图1和表1和2)。SSII活性增加10倍的系显示最大程度的DSC T-起始和DSC T-峰值增加。以野生型为基础，数据在每种情况下是约120％。\n[0373] 实施例5：与野生型(WT)相比，不同遗传修饰的稻系在活性水平和支链淀粉侧链方面的比较。\n[0374] 表4显示与野生型相比的不同遗传修饰的稻的支链淀粉侧链分布。所示的曲线是已分析葡聚糖的链长度(单位DP＝聚合程度)对全部已测试DP总数内特定DP的百分数作图的结果。\n[0375] 表4：与野生型(WT)米粉相比，遗传修饰系的支链淀粉的侧链曲线分布，以不同聚合程度分成四组。\n[0376] \n[0377] 可以看到增加SSII活性伴随着支链淀粉侧链分布上不相关联的变化。SSII活性的增加导致DP6-10之间的侧链逐步不同程度地减少以及DP20-25的侧链增加。\n[0378] 实施例6：已烹煮米粒的质构\n[0379] 不同遗传修饰系的米粒和相对应野生型的米粒烹煮持续至多到所讨论的最佳烹煮时间(见方法“测定已烹煮米粒的特征”)。质构在烹煮后已于4℃贮藏22小时(表5a，所示数据是每份样品10个量值(在每种情况下3粒米)的平均值)的米粒上或在新鲜烹煮的米粒(烹煮后约1小时)上或已经在冷却下贮藏(4℃，22小时)并随后在烤箱或微波炉内再加热的米粒(表5b)上进行测定。\n[0380] 表5a：烹煮后4℃贮藏22小时的米粒的质构\n[0381] \n[0382] 已烹煮米粒的粘度随着SSII活性的增加而下降(表5a)。在GAOS0353-02301系内粘度减少约一半，在GAOS0353-01301系内粘度减少约3倍，并且在GAOS0353-01502系内粘度减少约13倍。\n[0383] 表5b：新鲜烹煮或再加热的米粒的质构\n[0384] \n[0385] 汇总在烹煮及(4℃贮藏22小时后)在烤箱或微波炉内再加热之后测定已烹煮米粒的粘度的数据。在每种加工变例中，GAOS0353-01502的粘度明显低于野生型的粘度。\n[0386] 实施例7：测定未烹煮米粒和已烹煮米粒的米粒尺度\n[0387] 遗传修饰系和相对应野生型的未烹煮米粒和已烹煮米粒的米粒尺度使用SigmScan软件测定。结果和从所述结果中衍生的参数示于表6a和6b内。\n[0388] 表6a：测定未烹煮米粒和已烹煮米粒的米粒尺度的数据汇总\n[0389] \n[0390] \n[0391] 所示数据是30个独立量值的平均值(L＝粒长；W＝粒宽；u＝未烹煮；c＝烹煮；\nER＝延伸率(Lc/Lu)：CDC＝尺度变化系数(Lc/Lu)/(Wc/Wu))。\n[0392] 表6b：与野生型相比的米粒尺度的相对变化\n[0393] \n[0394] 全部数据均为百分数：％变化＝(样品-野生型)/野生型*100)。\n[0395] 在已烹煮米粒的米粒尺度方面，稻内增加的SSII活性导致米粒在烹煮期间沿纵轴显著较高地延伸。从增加的延伸率(ER)和增加的长度/宽度比(Lc/Wc)中，这是显而易见的。活性增加2倍的系(GAOS0353-02301)在上述参数上再次显示较少程度的变化，而SSII活性增加6倍(GAOS0353-01301)或10倍(GAOS0353-01502)的系具有更明显的表现。\n[0396] 实施例8：通过快速粘度分析仪(RVA)分析米粉的物理化学特征\n[0397] 如方法“通过RVA分析米粉”内所述，对来自不同遗传修饰系的米粉和来自相应野生型的米粉分析它们的物理化学特征。\n[0398] 在定义的温度和剪切程序内记录米粉/水混悬液的粘度。不同系的曲线和分析数据在表7a+b内显示。\n[0399] 表7a：在测定米粉的粘度特征中所得数据的汇总，其中所述的米粉由来自具有不同SSII活性的稻粒制成。\n[0400] \n[0401] 表7b：与野生型相比的RVA的相对变化\n[0402] \n[0403] \n[0404] (全部数据均为百分数)％变化＝(样品-野生型)/野生型*100\n[0405] 来自野生型和遗传修饰系的米粉的粘度曲线在多个参数上不同。遗传修饰的样品在明显较晚的时间点上开始成糊，这可以从增加的“成糊温度”中看出。随后粘度发展进行得非常迅速直至峰值粘度，如可以从遗传修饰的样品的较短“峰值时间”中看出。全部其它粘度参数(峰值、低谷、终点)在遗传修饰的样品的例子中比野生型的例子内低。必须提到的是超过野生型的变化的程度与SSII活性的水平相关。具有最高SSII活性的系(GAOS0353-1502)显示最低的峰粘度、低谷粘度和终粘度，具有超过10℃的值，这是成糊温度上的最高差异。\n[0406] 另一个非常明显的方面是遗传修饰的样品的粘度快速发展，这在成糊起始时间与峰值粘度时间间极其短暂的间隔上反映。这个参数再次显示对SSII活性增加程度影响的明显依赖性。\n[0407] 实施例9：分离的淀粉的可消化性\n[0408] 与野生型相比，转化体GAOS353-2501和GAOS353-1301的淀粉显示明显减少的可消化性。\n[0409] 相对于野生型，在转化体GAOS353-1301的例子中分离的淀粉的酶降解在20分钟后是53％，在60分钟后是67％并且在120分钟后是84％。\n[0410] 相对于野生型，在转化体GAOS353-2501的例子中分离的淀粉的酶降解在20分钟后是39％，在60分钟后是49％并且在120分钟后是68％(图3)。\n[0411] 表8：稻淀粉的RS含量\n[0412]