一种联合检测HIV-1+2抗体和P24抗原的磁性免疫层析试纸条及其制备方法

1、一种联合检测HIV-1+2抗体和P24抗原的磁性免疫层析试纸条，其特征在于：该 试纸条是将包被膜、结合了HIV-1+2抗原及P24抗体的磁颗粒垫、样品垫、吸水垫依次 相互交错2mm地粘贴在底板上，然后在上层覆盖透明塑料密封膜组装而成，其中所述的 包被膜上预包被有HIV-1+2抗体检测线及HIV P24抗原检测线和质控线。
2、根据权利要求1所述的联合检测HIV-1+2抗体和P24抗原的磁性免疫层析试纸条， 其特征在于：所述的样品垫是经过样品垫处理液预处理的纤维素膜，所述的样品垫处理 液是含有1％-5％酪蛋白和0.1％-1％的聚乙烯醇，以及0.01-0.2％吐温-20的0.02M， pH7.0-7.6的磷酸盐缓冲溶液。
3、根据权利要求1所述的联合检测HIV-1+2抗体和P24抗原的磁性免疫层析试纸条 的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
A、抗原的制备：选用基因工程技术制备的商品化HIV-1+2重组配对抗原，对 20mM，pH7.0-7.6的PBS 4℃透析过夜；
B、抗体的制备：选用商品化的高效价P24配对单抗，对20mM pH7.0-7.6的PBS 4℃ 透析过夜；
C、磁颗粒的制备：选用直径为100-300nm的超顺磁颗粒，使用碳二亚胺和琥珀酰亚 胺共价偶联的方式将链亲和素标记到磁颗粒上，选用预活化生物素进行HIV-1+2 抗原/P24抗体的标记，将标记好的生物素化抗原/抗体以1∶2-1∶10的比例(体 积比)与链亲和素化磁颗粒混合，确保链亲和素化磁颗粒过量；
D、将制备好的磁颗粒使用定量喷液装置以25μl/cm-50μl/cm的量喷涂于磁颗粒垫 上；
E、包被膜的制备：使用0.02mM，pH7.0-7.6的PBS，分别将HIV-1+2包被抗原和P24 包被抗体以及生物素化牛血清白蛋白稀释到0.5-2mg/ml的浓度，使用定量喷液装 置分别将二者以0.5-1.0cm的间隔喷印于硝酸纤维素膜上，晾干后于封闭液中浸 泡10分钟后于25-35℃烘干8小时，加入干燥剂封存备用；
F、样品垫的处理：将样品垫放入样品垫处理溶液中浸泡处理1小时后取出25-35℃ 烘干8小时；
G、试纸条的组装：在透明塑料底板上依次相互交错2mm贴上包被膜、磁颗粒垫、样 品垫、吸水垫，然后在上层覆盖透明塑料密封膜得到试纸板，根据要求的宽度切 割即得到试纸条。
4、根据权利要求3所述的联合检测HIV-1+2抗体和P24抗原的磁性免疫层析试纸条 的制备方法，其特征在于所述的步骤C包括以下三步：
1)链亲和素化磁颗粒的制备：使用含有0.1％Tween-20的50mM，pH4.5-5.0的醋酸钠 缓冲液洗涤磁颗粒，加入碳二亚胺和琥珀酰亚胺使二者终浓度均为20mmol/L，室温 反应1小时，使用含有0.1％Tween-20的50mM，pH4.5-5.0的醋酸钠缓冲液充分洗涤 磁颗粒后加入链亲和素使链亲和素与磁颗粒的分子比例为5∶1(摩尔比)，室温反应 3小时，加入含有0.5％BSA的0.02M，pH7.0-7.6的PBS室温封闭30分钟，使用含 有0.1％Tween-20的50mM，pH4.5-5.0的醋酸钠缓冲液洗涤磁颗粒，然后使用含有 1％PVP，1％casein，0.5％Tween-20，5％蔗糖的50mM，pH8.2-9.0的硼酸保存缓冲液复 溶磁颗粒，4℃保存备用；
2)生物素化HIV-1+2抗原和P24抗体的制备：将HIV-1+2抗原和P24抗体对0.02M， pH7.0-7.6的PBS 4℃透析过夜，调整浓度为2mg/ml，将预活化生物素使用二甲基 亚砜溶解，终浓度为50mM，以20∶1的分子比例向抗原或抗体溶液中加入所需量的 生物素溶液，室温反应1小时，对0.02M，pH7.0-7.6的PBS 4℃透析过夜，加入 等体积甘油后-20℃保存备用；
3)生物素化抗原/抗体与链亲和素化磁颗粒的混合，以0.5μl/mg磁颗粒的量向链亲 和素化磁颗粒溶液中加入生物素化HIV-1+2抗原，以0.25μl/mg磁颗粒的量加入生 物素化P24抗体，充分混匀后使用保存缓冲液以1∶5-1∶20的比例(体积比)将混 合物稀释待喷涂玻璃纤维垫使用。
5、根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述的步骤D中，磁颗粒的喷涂 方法是：将制备好的磁颗粒使用定量喷膜装置以50μl/cm的量均匀喷涂于玻璃纤维上， 冷冻干燥后加入干燥剂封存备用。
6、根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述的步骤E中，包被膜的制备 方法是：用包被缓冲液将HIV-1+2抗原和P24抗体稀释为0.5mg/ml，生物素化BSA稀释 为1mg/ml，使用定量喷膜装置以1ul/cm的量将三者以0.6cm的间隔喷印于硝酸纤维素膜 上，室温晾干30分钟后于封闭液中浸泡10分钟后于25-35℃烘干8小时，加入干燥剂封 存备用。

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