一种从食用菌中提取的核苷酸混合物及其制备方法和应用

1.一种从食用菌中提取核苷酸混合物的方法，其特征在于该方法包括以下步骤： a.提取核酸：食用菌或食用菌下脚料加水磨成匀浆，调节pH9-12，微波提取，过滤，调节pH7，得提取液；
b.浓缩纯化核酸：提取液经离心分离、中空纤维超滤膜富集分离、浓缩，浓缩液调节pH，在蛋白等电点静置过夜，离心，上清液调节pH，在核酸等电点静置过夜，离心，取沉淀物，洗涤，干燥，得核酸；
c.酶解：核酸加水溶解，加入5’-磷酸二酯酶进行酶解成5’-核苷酸；
d.收集核苷酸：利用阴离子交换树脂分离富集核苷酸，得到食用菌核苷酸混合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
（1）食用菌或食用菌下脚料制浆：食用菌或食用菌下脚料加水，料：水重量比为1：3~6，磨成匀浆状物，备用；
（2）核酸提取：
a.上述匀浆状物以1mol/L NaOH调节pH 11，加入NaCl使其浓度达4%，用微波提取，提取功率为300W，时间为30min，提取1~2次，所得提取液300目过滤，离心15min，再用1mol/L HCl调节pH为7，得到提取液；
b.提取液经滤膜孔径为5000道尔顿的中空纤维超滤膜分离，控制压力为0.2MPa，温度为25℃，膜通量为60～140ml/min，核酸被截留；
c.所得核酸截留液用6mol/L HCl调pH 4.2，4℃静置过夜，离心，得上清液； d.所得上清液再用6mol/L HCl调pH 2.0，4℃静置过夜，离心，得到初步纯化的核酸沉淀物；
e.所得沉淀用50%乙醇冲洗，离心，60℃，0.09Mpa，真空干燥2h，得到核酸干品； （3）核酸酶解
称取上述制得的核酸干品，加蒸馏水，超声波辅助溶解，制成浓度为0.2wt%的核酸溶液，加入一定量5’-磷酸二酯酶酶液，酶解条件为：酶解时间3h、温度40℃、pH 5.8、酶底比为1300U/g；酶解结束，100℃灭酶10min，离心即得核苷酸混合物溶液；
（4）核苷酸富集分离
a.核酸经酶解成核苷酸混合物溶液后，调样液浓度为0.75mg/mL，用1mol/LNaOH调节pH为10.0；
b.步骤a所得样液上阴离子交换树脂柱，控制上样速度1mL/min，上样液体积为树脂体积的8倍；
c.对上样后的阴离子交换树脂柱依次用3倍体积去离子水，1倍体积0.1mol/LHCl，1倍体积0.2mol/LHCl，1倍体积0.3mol/LHCl进行洗柱，然后用0.4mol/LHCl+2%NaCl洗脱，收集0.4mol/LHCl+2%NaCl洗脱液；
d.步骤c所得0.4mol/LHCl+2%NaCl洗脱液经透析袋透析，0.09MPa，60℃，真空浓缩干燥得核苷酸混合物制品。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于食用菌选自双孢蘑菇
（Agaricusbisporus）、金针菇（Flammulina velutipes）、香菇（Lentinus velutinus）、杏鲍菇（Pleurotuseryngii）、平菇（Pleurotus ostreatus）中的一种或多种。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于阴离子交换树脂为大孔强碱性阴离子交换树脂。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于大孔强碱性阴离子交换树脂型号为D201GF。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于核苷酸混合物含有5’-胞苷酸、5’-腺苷酸、5’-鸟苷酸、5’-尿苷酸。

一种从食用菌中提取的核苷酸混合物及其制备方法和应用 \n技术领域\n[0001] 本发明属于食品加工领域，涉及一种从食用菌中提取的核苷酸混合物及其制备方法和应用。 \n背景技术\n[0002] 核苷酸类物质对甜味有增效作用，对咸、酸、苦味及腥味、焦味有掩盖和消除作用，对肉味则有增效作用，特别是核苷酸对氨基酸类鲜味物质有强烈的助鲜作用，氨基酸类鲜味物质含量在阈值以下时其鲜味是潜在性的，只要添加少量5’-核苷酸，就能使其提到阈值以上，发挥其增鲜效果。核苷酸对谷氨酸(MSG，味精)的鲜味有强大助鲜作用，12％鸟苷酸(GMP)：88％MSG，相当于MSG9.9倍的鲜度； \n[0003] 食用菌营养丰富，味道鲜美，具有独特的风味(包括香味和滋味)。食用菌中核酸含量丰富，水解核酸可得到核苷酸。已有的研究表明：双孢蘑菇核酸总量为2.66％；鲍鱼菇为2.93％；凤尾菇4.06％；草菇为3.88％；核苷酸在姬松茸菌丝体中达到5.51mg/g。香菇中四种核苷酸的含量分别为5’-IMP2.82mg/g、5’-GMP7.05mg/g、5’-UMP 4.25mg/g、5’-AMP \n6.51mg/g，平菇子实体中可提取得到了2％以上的核酸。 \n[0004] 目前调味品行业生产的调味核苷酸主要为5’-肌苷酸(IMP)和5’-鸟苷酸(GMP)，一般通过二种方法生产：一是发酵-转化法，利用一些生产菌株发酵生产肌苷、鸟苷后经磷酸化来生成5’-肌苷酸、5’-鸟苷酸；二是通过酵母发酵培养，对酵母破壁提取核酸，然后再通过核酸酶水解处理，经过滤澄清、除蛋白、分离等步骤获得。 \n[0005] 我国食用菌栽培产业发展迅速，已经成为粮、棉、油、果、菜外的第六大农业产业，食用菌产量巨大，而大量的食用菌下脚料没有利用，食用菌中核酸含量高，是制备核苷酸重要的原料来源，利用食用菌及其下脚料开发核苷酸类天然调味料是食用菌深加工的重要方向。 \n发明内容\n[0006] 本发明的目的是利用食用菌及其下脚料制备应用于调味品的天然核苷酸，解决食用菌加工制备核苷酸的工艺、特别是利用食用菌下脚料制备核苷酸的技术问题，扩展了食 用菌及其下脚料的利用途径，提高了食用菌下脚料的利用价值。 \n[0007] 本发明的目的是通过下列技术方案实现的： \n[0008] 1、一种从食用菌中提取的核苷酸混合物，其特征在于该核苷酸混合物是通过下列方法制备得到的： \n[0009] a.提取核酸：食用菌或食用菌下脚料加水磨成匀浆，调节pH9-12，微波提取，过滤，调节pH7，得提取液； \n[0010] b.浓缩纯化核酸：提取液经离心分离、中空纤维超滤膜富集分离、浓缩，浓缩液调节pH，在蛋白等电点静置过夜，离心，上清液调节pH，在核酸等电点静置过夜，离心，取沉淀物，洗涤，干燥，得核酸； \n[0011] c.酶解：核酸加水溶解，加入5’-磷酸二酯酶进行酶解成5’-核苷酸； [0012] d.收集核苷酸：利用阴离子交换树脂分离富集核苷酸，得到食用菌核苷酸混合物。 \n[0013] 所述的核苷酸混合物，该核苷酸混合物是通过下列方法制备得到的： [0014] (1)食用菌或食用菌下脚料制浆：食用菌或食用菌下脚料加水，料∶水重量比为\n1∶3～6，磨成匀浆状物，备用； \n[0015] (2)核酸提取： \n[0016] a.上述匀浆状物以1mol/L NaOH调节pH 11，加入NaCl使其浓度达4％，用微波提取，提取功率为300W，时间为30min，提取1～2次，所得提取液300目过滤，离心(4000r/pm)15min，再用1mol/LHCl调节pH为7，得到提取液； \n[0017] b.提取液经滤膜孔径为5000道尔顿的中空纤维超滤膜分离，控制压力为0.2MPa，温度为25℃，膜通量为60～140ml/min，核酸被截留； \n[0018] c.所得核酸截留液用6mol/L HCl调pH 4.2，4℃静置过夜，离心，得上清液； [0019] d.所得上清液再用6mol/L HCl调pH 2.0，4℃静置过夜，离心，得到初步纯化的核酸沉淀物； \n[0020] e.所得沉淀用50％乙醇冲洗，离心，60℃，0.09Mpa，真空干燥时2h，得到核酸干品； \n[0021] (3)核酸酶解 \n[0022] 称取上述制得的核酸干品，加蒸馏水，超声波辅助溶解，制成浓度为0.2wt％的核酸溶液，加入一定量5’-磷酸二酯酶酶液，酶解条件为：酶解时间3h、温度40℃、pH 5.8、酶底比为1300U/g；酶解结束，100℃灭酶10min，离心即得核苷酸混合物溶液； [0023] (4)核苷酸富集分离 \n[0024] a.核酸经酶解成混合核苷酸后，调样液浓度为0.75mg/mL的核苷酸混合酶解液，用1mol/L NaOH调节核苷酸混合酶解液使其为最适pH10.0； \n[0025] b.步骤a所得样液上阴离子交换树脂柱，控制上样速度1mL/min，上样液体积为树脂体积的8倍； \n[0026] c.对上样后的阴离子交换树脂柱依次用3倍体积去离子水，1倍体积0.1mol/LHCl，1倍体积0.2mol/LHCl，1倍体积0.3mol/LHCl进行洗柱，然后用0.4mol/LHCl+2％NaCl洗脱，收集0.4mol/LHCl+2％NaCl洗脱液； \n[0027] d.步骤c所得0.4mol/LHCl+2％NaCl洗脱液经透析袋透析，0.09MPa，60℃，真空浓缩干燥得核苷酸混合物制品。 \n[0028] 所述的核苷酸混合物，其中食用菌为双孢蘑菇Agaricus bisporus、金针菇Flammulina velutipes、香菇Lentinus velutinus、杏鲍菇Pleurotus eryngii、平菇Pleurotus ostreatus中的一种或多种。 \n[0029] 所述的核苷酸混合物，其中阴离子交换树脂为大孔强碱性阴离子交换树脂，优选型号为D201GF。 \n[0030] 所述的核苷酸混合物，其中核苷酸混合物含有5’-胞苷酸、5’-腺苷酸、5’-鸟苷酸、5’-尿苷酸。 \n[0031] 所述核苷酸混合物的制备方法，该方法包括以下步骤： \n[0032] a.提取核酸：食用菌或食用菌下脚料加水磨成匀浆，调节pH9-12，微波提取，滤布过滤，调节pH7，得提取液； \n[0033] b.浓缩纯化核酸：提取液经离心分离、中空纤维超滤膜富集分离、浓缩，浓缩液调节pH，在蛋白等电点静置过夜，离心，上清液调节pH，在核酸等电点静置过夜，离心，取沉淀物，洗涤，干燥，得核酸； \n[0034] c.定向酶解：核酸加水溶解，加入5’-磷酸二酯酶定向酶解成5’-核苷酸； [0035] d.收集核苷酸：利用阴离子交换树脂分离富集核苷酸，得到食用菌核苷酸混合物。 \n[0036] 所述核苷酸混合物的制备方法，该方法包括以下步骤： \n[0037] (1)食用菌或食用菌下脚料制浆：食用菌或食用菌下脚料加水，料∶水重量比为\n1∶3～6，磨成匀浆状物，备用； \n[0038] (2)核酸提取： \n[0039] a.上述匀浆状物以1mol/L NaOH调节pH 11，加入NaCl使其浓度达4％，用微波提取，提取功率为300W，时间为30min，提取1～2次，所得提取液300目过滤，离 心(4000r/pm)15min，再用1mol/L HCl调节pH为7，得到提取液； \n[0040] b.提取液经滤膜孔径为5000道尔顿的中空纤维超滤膜分离，控制压力为0.2MPa，温度为25℃，膜通量为60～140ml/min，核酸被截留； \n[0041] c.所得核酸截留液用6mol/L HCl调pH 4.2，4℃静置过夜，离心，得上清液； [0042] d.所得上清液再用6mol/L HCl调pH 2.0，4℃静置过夜，离心，得到初步纯化的核酸沉淀物； \n[0043] e.所得沉淀用50％乙醇冲洗，离心，60℃，0.09Mpa，真空干燥2h，得到核酸干品； [0044] (3)核酸酶解 \n[0045] 称取上述制得的核酸干品，加蒸馏水，超声波辅助溶解，制成浓度为0.2wt％的核酸溶液，加入一定量5’-磷酸二酯酶酶液，酶解条件为：酶解时间3h、温度40℃、pH 5.8、酶底比为1300U/g；酶解结束，100℃灭酶10min，离心即得核苷酸混合物溶液； [0046] (4)核苷酸富集分离 \n[0047] a.核酸经酶解成混合核苷酸后，调样液浓度为0.75mg/mL的核苷酸混合酶解液，用1mol/L NaOH调节核苷酸混合酶解液使其为最适pH10.0； \n[0048] b.步骤a所得样液上阴离子交换树脂柱，控制上样速度1mL/min，上样液体积为树脂体积的8倍； \n[0049] c.对上样后的阴离子交换树脂柱依次用3倍体积去离子水，1倍体积0.1mol/LHCl，1倍体积0.2mol/LHCl，1倍体积0.3mol/LHCl进行洗柱，然后用0.4mol/LHCl+2％NaCl洗脱，收集0.4mol/LHCl+2％NaCl洗脱液； \n[0050] d.步骤c所得0.4mol/LHCl+2％NaCl洗脱液经透析袋透析，0.09MPa，60℃，真空浓缩干燥得核苷酸混合物制品。 \n[0051] 所述核苷酸混合物在制备调味品中的应用。 \n[0052] 下脚料是指食用菌采收或加工过程中整理处理所产生的不完整的子实体或碎料等外品及菌柄、菇脚等边角料。 \n[0053] 食用菌或食用菌下脚料制浆前最好能进行选摘，剔除腐烂霉变部分，清洗后沥干。 [0054] 本发明的优点： \n[0055] 本发明提供的制备方法简单可行，用中空纤维超滤膜浓缩富集核酸避免了由于加热导致的核酸非定向降解而造成的核苷酸的损失，同时由于浓缩后的体积减小，便于后续等电点沉淀。中空纤维超滤膜浓缩富集核酸其核酸损失率为10.9％，较真空浓缩核酸损 失率18.8％低。 \n[0056] 本发明采用大孔强碱性阴离子交换树脂富集四种核苷酸，所得到的是四种核苷酸的混合制剂，经过真空浓缩干燥后即得食用菌核苷酸，具有总核苷酸含量高，可直接用于食品添加剂的配制原料，操作中所用试剂均食品安全之列，且工艺操作简单等特点。 [0057] 本发明扩展了食用菌及其下脚料的利用途径，提高了食用菌下脚料的利用价值。 [0058] 附图说明\n[0059] 图1是金针菇4种核苷酸液相色谱图。其中各物质峰依次为：1胞苷酸；2腺苷酸；\n3鸟苷酸；4尿苷酸。 \n[0060] 图2是双孢蘑菇核苷酸色谱图。其中各物质峰依次为：1胞苷酸；2腺苷酸；3鸟苷酸；4尿苷酸。 \n[0061] 图3是四种核苷酸标准样液相色谱图。 \n[0062] 具体实施方式\n[0063] 以下通过实施例对本发明作进一步的说明。 \n[0064] 实施例1：一种食用菌核苷酸的制备-金针菇 \n[0065] (1)称取金针菇Flammulina velutipes下脚料2500g，加入15000ml水，用高速组织捣碎机磨成匀浆。匀浆状物以1mol/LNaOH调节pH 11，并加入NaCl液，使其浓度达4％，微波回流提取30min，提取功率为300W，提取一次，用300目滤布过滤得滤过液，滤液离心(4000r/pm)15min，再用1mol/L HCl调节pH为7，得到澄清透明的核酸提取液。 [0066] (2)步骤(1)提取液进行管式离心机离心(10000r/min)，得澄清透明核酸提取液，弃去沉淀(主要为食用菌下脚料的残渣)，离心后可溶性固形物含量未变，为4.2wt％，但透光率明显上升，由T650＝12.3上升到T650＝73。 \n[0067] (3)步骤(2)清液15L经中空纤维超滤膜(滤膜孔径为5000D)分离，控制压力为\n0.2mPa，温度为25℃，膜通量为60～140ml/min.，操作中如膜通量下降到原来的30％时，适当加入清水，经过不断的循环过滤，分子量相对较大的核酸被截留，达到了浓缩和去除小分子杂质的目的，得到1.7L截留液，使体积浓缩倍数达8.7，浓缩液的核酸截留率为89.1％。 [0068] (4)步骤(3)所得截留液1.7L逐滴加入6mol/L HCl，边搅拌，使pH4.2(蛋白等电点)，低温(4℃)静置过夜。 \n[0069] (5)步骤(4)放置过夜的截留液1.7L离心(4000r/min)15min，得上清液(富含核酸)，沉淀经测定不含核酸，用6mol/L HCl继续调pH为2.0(核酸等电点)，低温(4℃)静 置过夜。 \n[0070] (6)步骤(5)过夜的提取液进行离心(4000r/min)15min，得到初步纯化的核酸沉淀物，而上清液仍含有少量核酸，继续低温(4℃)静置过夜，再离心。 \n[0071] (7)步骤(5)，(6)得核酸沉淀进行真空干燥，温度为60℃，真空度为0.09Mpa，干燥时间为2hr，得到核酸干品5.45g，得率为0.218％，(即100g鲜金针菇可得到0.218g核酸干品)，核酸含量67.1％。 \n[0072] (8)取步骤(7)核酸干品1g，，加蒸馏水500ml，超声波辅助溶解，制成0.2wt％的核酸溶液，加入适量5’-磷酸二酯酶酶液(酶活力13000u/g)，酶底比为1300U/g核酸干品(核酸含量为67.1％)酶解条件为：酶解时间3h、温度40℃、pH 5.8。酶解结束，100℃灭酶\n10min，离心即得混合核苷酸溶液。 \n[0073] (9)步骤(8)得到核苷酸混合酶解液，调样液浓度为0.75mg/mL的核苷酸混合酶解液，并同时用1mol/L NaOH调节核苷酸混合酶解液使其pH10.0。 \n[0074] (10)将经处理的湿树脂D201GF装入玻璃柱(D×H＝1.5cm×15cm)中，步骤(9)所得核苷酸混合酶解液上样，控制流速为1mL/min，上样液体积为树脂体积的8倍。 [0075] (11)对步骤(10)阴离子交换树脂D201GF进行洗脱，先用去离子水3倍体积(树脂体积，下同)洗至流出液中不含有核苷酸，然后依次用0.1mol/LHCl 1倍体积，0.2mol/LHCl1倍体积，0.3mol/LHCl 1倍体积进行洗柱，然后用0.4mol/L HCl+2％NaCl洗脱，收集\n0.4mol/L HCl+2％NaCl洗脱部分，直至0.4mol/L HCl+2％NaCl洗脱液中没有核苷酸检出。 [0076] (12)D201GF离子交换柱层析后，所得洗脱液为富集了核苷酸的混合核苷酸制品，总核苷酸浓度达到4.5mg/ml，比上样前0.75mg/ml增加6倍，总核苷酸回收率达86.2％。将洗脱液真空减压浓缩(0.09mPa，60℃)，得金针菇混合核苷酸制品。此混合核苷酸制品可用于调配核苷酸调味品。 \n[0077] (13)步骤(12)获得的混合核苷酸制品经高效液相色谱检测，色谱条件为： [0078] 色谱柱：Eclipse XDB-C18色谱柱(5μm，150×4.6mm)； \n[0079] 流动相：超纯水∶甲醇∶冰乙酸∶四丁基氢氧化铵＝894.5∶100∶5∶0.5；\n(体积比) \n[0080] 检测波长：260nm；进样量：15μL；柱温：25℃；流速：1.0mL/min。 [0081] 检测色谱图如图1。 \n[0082] 核苷酸分析检测：根据上述方法制备的核苷酸混合物，应用高效液相色谱法进行检测分析，主要是由5’-胞苷酸、5’-腺苷酸、5’-鸟苷酸、5’-尿苷酸四种核苷酸组成；检测 获得的高效液相色谱图中具有由图1中标注的1、2、3、4号吸收峰，1-4号吸收峰分别是：\n1.5’-胞苷酸；2.5’-腺苷酸；3.5’-鸟苷酸；4.5’-尿苷酸。 \n[0083] 实施例2 一种食用菌核苷酸制备-双孢蘑菇 \n[0084] 食用菌核苷酸的组成成分与实例1相同，制备方法包括的步骤与实例1相同。 [0085] 高效液相色谱检测的色谱图如图2，可见核苷酸混合物中包含有5’-胞苷酸、\n5’-腺苷酸、5’-鸟苷酸、5’-尿苷酸四种核苷酸。