一种功能性纳米颗粒复合微球及其制备与应用

1.一种功能性纳米颗粒复合微球，其特征在于，所述功能性纳米颗粒复合微球为功能性纳米颗粒复合PEG微球，所述功能性纳米颗粒复合PEG微球包含功能性纳米颗粒和含有PEG链段的聚合物，所述功能性纳米颗粒复合PEG微球的平均粒径为0.1～1000μm，粒径分布变异系数小于10％；
所述功能性纳米颗粒是下列中的一种或几种：量子点、磁性纳米颗粒、荧光纳米颗粒、金属纳米颗粒、金属氧化物纳米颗粒和半导体纳米颗粒；其中所述量子点是下列中的一种或几种：CdS、HgS、CdSe、CdTe、ZnSe、HgSe、ZnTe、ZnO、PbSe、HgTe、CaAs、InP、InCaAs、CdSe/CdS、CdSe/ZnS、CdSe/ZnSe、CdS/ZnS、Cd/Ag2S、CdS/Cd(OH)2、CdTe/ZnS、CdTe/CdS、CdSe/ZnSe、CdS/HgS、CdS/HgS/CdS、ZnS/CdS、ZnS/CdS/ZnS、ZnS/HgS/ZnS/CdS、CdSe/CuSe、CdSeTe、CdSeTe/CdS/ZnS、CdSe/CdS/ZnS、CuInS2、CuInSe2、CuInS2/ZnS、CuInSe2/ZnS，以及掺杂量子点CdS:Mn、CdS:Mn、CdS:Cu、ZnS:Cu、CdS:Tb、ZnS:Tb；
所述PEG链段接枝于聚合物——聚苯乙烯马来酸酐共聚物；所述功能性纳米颗粒复合微球采用成球前在聚合物上接枝PEG链段，然后与纳米颗粒复合成球的方式制备获得；其制备方法包括膜乳化-乳液溶剂挥发法；
所述PEG链段为聚乙二醇单甲醚。
2.根据权利要求1所述的功能性纳米颗粒复合微球，其特征在于，所述功能性纳米颗粒复合PEG微球经表面改性连有官能团；所述表面改性是下列中的一种或几种：水解、化学接枝或磺化；所述官能团是下列中的一种或几种：羧基、氨基、磺酸根基、硝基、羟基、巯基、氯基或酯基。
3.根据权利要求2所述的功能性纳米颗粒复合微球，其特征在于，所述官能团上还连接有以下连接物中的一种或几种：N-羟基琥珀亚酰胺、生物素、亲和素和抗生蛋白链菌素。
4.一种功能性纳米颗粒复合微球的制备方法，所述功能性纳米颗粒复合微球为功能性纳米颗粒复合PEG微球，所述功能性纳米颗粒复合PEG微球包含功能性纳米颗粒和含有PEG链段的聚合物，所述功能性纳米颗粒复合PEG微球的平均粒径为0.1～1000μm，粒径分布变异系数小于10％，所述功能性纳米颗粒是下列中的一种或几种：量子点、磁性纳米颗粒、荧光纳米颗粒、金属纳米颗粒、金属氧化物纳米颗粒和半导体纳米颗粒；其中所述量子点是下列中的一种或几种：CdS、HgS、CdSe、CdTe、ZnSe、HgSe、ZnTe、ZnO、PbSe、HgTe、CaAs、InP、InCaAs、CdSe/CdS、CdSe/ZnS、CdSe/ZnSe、CdS/ZnS、Cd/Ag2S、CdS/Cd(OH)2、CdTe/ZnS、CdTe/CdS、CdSe/ZnSe、CdS/HgS、CdS/HgS/CdS、ZnS/CdS、ZnS/CdS/ZnS、ZnS/HgS/ZnS/CdS、CdSe/CuSe、CdSeTe、CdSeTe/CdS/ZnS、CdSe/CdS/ZnS、CuInS2、CuInSe2、CuInS2/ZnS、CuInSe2/ZnS，以及掺杂量子点CdS:Mn、CdS:Mn、CdS:Cu、ZnS:Cu、CdS:Tb、ZnS:Tb；
所述PEG链段接枝于聚合物——聚苯乙烯马来酸酐共聚物；其特征在于，所述制备方法包括膜乳化-乳液溶剂挥发法；成球前在聚合物上接枝PEG链段，然后与纳米颗粒复合成球；
所述PEG链段为聚乙二醇单甲醚。
5.根据权利要求1-3任意一项所述的功能性纳米颗粒复合微球在检测样品中一种或多种目标物中的应用。
6.一种基于功能性纳米颗粒复合微球的生物检测探针，其特征在于，所述生物检测探针包括根据权利要求1-3任意一项所述的功能性纳米颗粒复合PEG微球和偶联在所述功能性纳米颗粒复合PEG微球表面的探针分子；所述探针分子选自下列中的一种或几种：蛋白质、蛋白质片段和核酸。
7.根据权利要求6所述的生物检测探针在检测样品中一种或多种目标物中的应用。

一种功能性纳米颗粒复合微球及其制备与应用\n技术领域\n[0001] 本发明涉及微纳米材料制备与应用领域，尤其涉及功能性纳米颗粒复合微球及其应用。\n背景技术\n[0002] 功能性纳米颗粒复合微球是指通过某种方法将功能性纳米颗粒与微球结合在一起所得到的一种功能性复合微球。现阶段通过各种途径制备的纳米颗粒具备各种特殊的光、电、磁及生物学等特性，因此在与微球结合后往往会将这些特性赋予到微球本身。而微球也为这些纳米颗粒提供了支承载体和有效保护。同时，微球自身的化学和物理性能如光敏感性、pH响应性、温度敏感性、吸附特性以及表面活性官能团也为纳米颗粒在各种复杂领域的应用提供可能。具备不同特殊功能的纳米颗粒复合微球在生物医药、工业催化、化工合成、电子信息、建筑材料等领域具有巨大的应用潜力。\n[0003] 现阶段，功能性纳米颗粒复合聚合物微球已被应用于各个领域：Nie研究小组通过采用溶胀渗透法将半导体纳米颗粒量子点包埋进多孔微球，利用微球表面羧基官能团将DNA链段连接在微球表面作为探针，进行了DNA特异性检测。Jun Lin小组制备上转换颗粒@水凝胶核壳结构微球NaYF4:Yb3+/Er3+@Hydrogel，并利用荧光上转换纳米颗粒的荧光性能实现近红外激发细胞成像，同时在壳层中封装药物并利用水凝胶的pH响应性达到药物控释的目的。Chunhui Deng小组合成磁性聚合物复合微球Fe3O4@SiO2@PMMA，并将其成功用于生物分子核酸和蛋白的磁分离富集，该技术在质谱分析等领域具有重要应用价值。\n[0004] 其中，在诸如靶向成像、药物靶向控释、免疫检测、免疫磁分离等应用领域需要微球具有抑制非特异性吸附从而提高应用的效果。各种天然聚合物如壳聚糖，白蛋白被证明能充当有效的非特异性抑制剂。然而天然聚合物具有明显的缺陷，即可能含有无法预知的病毒，而且在很多情况下其非特异性吸附抑制效果不佳。因此合成聚合物刷子(polymer brushes)充当非特异性吸附抑制剂受到越来越多的关注。\n[0005] 目前尚未见纳米颗粒复合微球表面非特异性吸附的相关报道。\n发明内容\n[0006] 有鉴于现有技术的缺陷，本发明提供了一种功能性纳米颗粒复合微球，所采用的技术方案如下：\n[0007] 一种功能性纳米颗粒复合微球，所述功能性纳米颗粒复合微球为功能性纳米颗粒复合PEG微球，所述功能性纳米颗粒复合PEG微球包含功能性纳米颗粒和含有PEG链段的聚合物，所述功能性纳米颗粒复合PEG微球的平均粒径为0.1～1000μm，粒径分布变异系数小于10％。PEG即聚乙二醇；粒径分布变异系数是衡量各颗粒粒径变异程度的一个统计量。\n[0008] 进一步地，所述功能性纳米颗粒是下列中的一种或几种：量子点、磁性纳米颗粒、荧光纳米颗粒、金属纳米颗粒、金属氧化物纳米颗粒和半导体纳米颗粒；所述量子点是下列中的一种或几种：CdS、HgS、CdSe、CdTe、ZnSe、HgSe、ZnTe、ZnO、PbSe、HgTe、CaAs、InP、InCaAs、CdSe/CdS、CdSe/ZnS、CdSe/ZnSe、CdS/ZnS、Cd/Ag2S、CdS/Cd(OH)2、CdTe/ZnS、CdTe/CdS、CdSe/ZnSe、CdS/HgS、CdS/HgS/CdS、ZnS/CdS、ZnS/CdS/ZnS、ZnS/HgS/ZnS/CdS、CdSe/CuSe、CdSeTe、CdSeTe/CdS/ZnS、CdSe/CdS/ZnS、CuInS2、CuInSe2、CuInS2/ZnS、CuInSe2/ZnS，以及掺杂量子点CdS:Mn、CdS:Mn、CdS:Cu、ZnS:Cu、CdS:Tb、ZnS:Tb。\n[0009] 进一步地，所述PEG链段接枝于下列聚合物中的一种或几种：聚苯乙烯、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸乙酯、聚酰胺、聚丙烯腈、聚碳酸酯、聚己内酯、聚氨酯、聚乳酸、壳聚糖、白蛋白、胶原、聚苯乙烯马来酸酐共聚物、聚乙酸乙酯、聚苯乙烯丙烯酸共聚物、聚苯乙烯甲基丙烯酸共聚物或聚苯乙烯-甲基丙烯酸甲酯共聚物，聚(苯乙烯-二乙烯基苯-甲基丙烯酸)和马来酸酐-1-十八烯共聚物。所述的含有PEG链段的聚合物可以是以下两种可能：其一为成球前在聚合物上接枝PEG链段，然后与纳米颗粒复合成球；其二为先将聚合物和纳米颗粒复合成球，然后在微球表面接枝PEG链段。\n[0010] 进一步地，所述PEG链段包括分子量在500～10000Da范围内的PEG或PEG衍生物，所述PEG衍生物包括单功能PEG、均一型双功能PEG、异(基)双功能PEG、多臂PEG、Y型结构PEG、枝状结构PEG或其混合物。\n[0011] 进一步地，所述功能性纳米颗粒复合PEG微球经表面改性连有官能团；所述表面改性是下列中的一种或几种：水解、化学接枝或磺化；所述官能团是下列中的一种或几种：羧基、氨基、磺酸根基、硝基、羟基、巯基、氯基或酯基。\n[0012] 进一步地，所述官能团上还连接有以下连接物中的一种或几种：N-羟基琥珀亚酰胺、生物素、亲和素和抗生蛋白链菌素。\n[0013] 进一步地，所述制备方法包括溶胀法、微流控法和膜乳化-乳液溶剂挥发法。溶胀法：即事先合成具备孔结构的交联微球，之后微球在良溶剂中被溶胀，表面微孔得到扩张，此时加入功能性纳米颗粒，在浓度差或疏水作用下功能性纳米颗粒通过孔结构渗透进微球并吸附在微球内壁，当外部溶剂去除后，微球收缩，从而将功能性纳米颗粒包埋进入微球。\n微流控法：若制备的功能性纳米颗粒复合微球所用的纳米颗粒和聚合物均为疏水性的，则事先将聚合物和纳米颗粒溶于非极性有机溶剂中，该聚合物流体在微流控通道中被一定流速的水相打碎而乳化形成液滴，形成的液滴经溶剂挥发而固化成球。膜乳化-乳液溶剂挥发法：若制备的功能性纳米颗粒复合微球所用的纳米颗粒和聚合物均为疏水性的，则事先将聚合物和纳米颗粒溶于非极性有机溶剂中作为分散相，而含表面活性剂的水溶液作为连续相，将分散相和连续相置于具有刚性多孔膜两侧，分散相在一定氮气压力作用下通过多孔膜上均一的微孔结构被压入到连续相中而形成均匀液滴，这时，连续相内稳定剂会吸附在液滴表面，而起到降低表面张力、稳定液滴的作用，随后形成的液滴经溶剂挥发而固化成球。\n[0014] 所述功能性纳米颗粒复合微球在检测样品中一种或多种目标物中的应用。\n[0015] 一种基于功能性纳米颗粒复合微球的生物检测探针，所述生物检测探针包括根据权利要求1-7任意一项所述的功能性纳米颗粒复合PEG微球和偶联在所述功能性纳米颗粒复合PEG微球表面的探针分子；所述探针分子选自下列中的一种或几种：蛋白质、蛋白质片段和核酸。\n[0016] 所述生物检测探针在检测样品中一种或多种目标物中的应用。\n[0017] 以下将结合附图对本发明作进一步说明，以充分说明本发明的目的、技术特征和技术效果。\n附图说明\n[0018] 图1是实施例4的复合PEG微球扫描电镜照片；\n[0019] 图2是实施例8的复合PEG微球激光共聚焦显微镜照片；\n[0020] 图3是实施例9的生物检测探针检测肿瘤标志物AFP的结果，以及与基于非PEG微球生物探针的检测结果的对比；\n[0021] 图4是图3的局部放大图。\n具体实施方式\n[0022] 下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。\n[0023] 复合微球表面羧基的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)活化、探针分子的连接、抗原如甲胎蛋白(AFP)的藻红蛋白标记等操作均为临床免疫检测诊断的基本操作，具体可参照《临床免疫学检验实验指导》，作者：吕世静，出版社：中国医药科学出版社。\n[0024] 实施例1：PEG接枝聚合物的制备(一)\n[0025] 将1g聚苯乙烯马来酸酐共聚物(PSMA)和2g分子量为1000的聚乙二醇单甲醚(mPEG1000)溶于20ml二甲基甲酰胺(DMF)中，并加入100mg催化剂对甲苯磺酸，常温溶解2h混合均匀后，在氮气保护下加热至100摄氏度反应12h。反应完成后加入无水乙醚将所得聚合物PSMA-PEG沉淀出来，反复离心洗涤三次后将聚合物冷冻干燥待用。\n[0026] 实施例2：PEG接枝聚合物的制备(二)\n[0027] 将1g聚苯乙烯丙烯酸共聚物和5g分子量为5000的端羧基聚乙二醇单甲醚(mPEG-COOH)溶于30ml氯仿，加入数滴浓硫酸在N2保护条件下加热冷凝回流12h，反应完成后加入无水乙醚将聚合物沉淀出来，反复离心洗涤三次后将聚合物冷冻干燥待用。\n[0028] 实施例3：PEG接枝聚合物的制备(三)\n[0029] 将马来酸酐/1-十八碳烯交替共聚物(PMAO)与10g分子量为2000一端氨基封端PEG(mPEG-NH2)溶于30ml氯仿，搅拌24h后，加入无水乙醇将聚合物沉淀出来，并除去未反应的PEG分子，反复离心洗涤三次后将聚合物冷冻干燥待用。\n[0030] 实施例4：复合PEG微球粉末的制备(一)\n[0031] 本例中所使用的膜乳化装置为压力式膜乳化装置，购自日本SPG technology公司；具体过程是将实施例1中的PSMA-PEG和发射波长518nm的CdS/ZnS量子点溶于甲苯中，聚合物浓度为1.5g/mL，量子点浓度为2nM/L，以之作为分散相。采用孔径为5μm的SPG多孔膜，利用压力为15KPa的氮气将分散相挤压过膜，进入含有乳化剂SDS浓度为1wt.％的水连续相，连续相的流速是0.35m/s，得到液滴粒径均一的水包油乳液。于25℃和350rpm磁力搅拌下进行搅拌挥发，待溶液中甲苯完全挥发后，对得到的量子点标记荧光微球悬浮液进行离心收集。之后经去离子水离心洗涤3次，无水乙醇离心洗涤3次，冷冻干燥得到量子点复合微球的固体粉末。\n[0032] 经扫描电镜观察，所制备的量子点复合荧光微球为表面光滑的球形颗粒，平均粒径为7.1μm，粒径分布变异系数CV为9.7％左右，单分散性较好，见附图1。\n[0033] 实施例5：复合PEG微球粉末的制备(二)\n[0034] 本例中所使用的为自制带T型接头的微流控装置，具体过程为将实施例2中的PEG接枝聚苯乙烯丙烯酸共聚物和Fe3O4溶于氯中，聚合物浓度为1g/mL，Fe3O4浓度为1nM/L，以之作为分散相；将含浓度为0.5wt.％乳化剂PVA和浓度为0.5wt.％SDS的水溶液作为连续相，并将分散相从不同通道注入在T型接口处汇合、乳化。分散相流速为30mL/h，连续相的流速是1L/h，得到液滴粒径均一的水包油乳液。于25℃和350rpm磁力搅拌下进行搅拌挥发，待溶液中氯仿完全挥发后，对得到的磁珠悬浮液进行磁分离收集。之后经洗涤3次，无水乙醇洗涤3次，冷冻干燥得到磁珠的固体粉末。\n[0035] 经扫描电镜观察，所制备的量子点复合荧光微球为表面光滑的球形颗粒，平均粒径为300μm，粒径分布变异系数CV为8.7％左右，单分散性较好。\n[0036] 实施例6复合PEG微球粉末的制备(三)\n[0037] 将实例3中的PMAO-PEG和激发波长为980nm的NaYF4稀土纳米颗粒溶于甲苯中，PMAO-PEG共聚物浓度为2g/mL,NaYF4稀土纳米颗粒浓度为1nM/L，以之作为分散相。采用孔径为3μm的SPG多孔膜，利用压力为20KPa的氮气将分散相挤压过膜，进入含有乳化剂SDS浓度为1wt.％的水连续相，连续相的流速是0.40m/s，得到液滴粒径均一的水包油乳液。于25℃和350rpm磁力搅拌下进行搅拌挥发。待溶液中甲苯完全挥发后，对得到的稀土纳米颗粒复合荧光微球悬浮液进行离心收集。之后经去离子水离心洗涤3次，无水乙醇离心洗涤3次，冷冻干燥得到稀土纳米颗粒复合荧光微球的固体粉末。\n[0038] 经扫描电镜观察，所制备的量子点复合荧光微球为表面光滑的球形颗粒，平均粒径为4.1μm，粒径分布变异系数CV值为6.2％左右，单分散性较好。\n[0039] 实施例7复合PEG微球粉末的制备(四)\n[0040] 先制备多孔聚合物微球，第一步为制备种子聚苯乙烯(PS)微球，即将2g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)溶于100g连续相中(无水乙醇与乙二醇甲醚的混合溶剂)；然后加入含有油溶性引发剂AIBN的苯乙烯单体，在速度120rpm的磁力搅拌下，通氮气15分钟后升温到70℃，氮气保护反应12小时。最后将得到的种子聚苯乙烯(PS)微球悬浮液用4000rpm离心分离，用去离子水和乙醇各冼涤三次，冷冻干燥后保存待用。\n[0041] 将0.2g PS种子微球和0.1mL氯代十二烷(CD，作为活化剂)分别加入到25mL溶有\n0.25wt.％的十二烷基硫酸钠(SDS)水溶液中，各自超声分散5分钟后将二者混合，之后再超声10分钟后于30℃磁力搅拌下溶胀12小时。再将溶有0.06g BPO的混合单体(包括苯乙烯单体，功能性单体甲基丙烯酸MAA，交联剂二乙烯基苯DVB)加入到50mL溶有0.25wt.％SDS的水溶液中，超声分散15分钟，之后与活化的种子微球溶液混合溶胀12小时。然后再加入PVA，浓度为整体溶液的1wt.％,通氮气15分钟后升温至70℃，氮气保护反应12小时。将反应后得到的微球悬浮液用4000rpm离心分离，用去离子水和乙醇各冼涤三次，之后冷冻干燥得到表面羧基化的聚苯乙烯微球。最后在索式提取器中，用二氯甲烷对微球进行48小时的抽提，待微球内的线形PS分子被抽提出来后，即得到多孔的单分散聚(苯乙烯-二乙烯基苯-甲基丙烯酸)(PSDM)微球。\n[0042] 将0.5mL 10.0nM的TiO2的三氯甲烷溶液加入到1mL含有107个PSDM多孔微球的三氯甲烷溶液之中，之后瓶口密封，在400rpm磁力搅拌下对微球溶胀2小时。然后去除封口，于室温下继续对溶液进行搅拌，随着溶液中三氯甲烷的挥发，溶液内部的量子点逐渐被浓缩，TiO2在微球内外浓度差的作用下不断渗透进入到微球的孔结构之中，待溶液内三氯甲烷完全挥发后停止搅拌。利用二甲苯、乙醇、水分别对微球进行4000rpm离心洗涤，以去除掉残留在微球外部的量子点，最后离心收集到的微球经真空冻干后以固体粉末状态进行保存待用。\n[0043] 将所得到的TiO2/PSDM微球表面羧基在EDC活化下，连接上N一羟基琥珀亚酰胺，然后再连接分子量为1000一端氨基封端的PEG和分子量为2000两端氨基封端的PEG，两种PEG分子摩尔比为3：1。\n[0044] 经扫描电镜观察，所制备的量子点复合荧光微球为表面光滑的球形颗粒，平均粒径为6μm，粒径分布变异系数CV为5.7％左右，单分散性较好。\n[0045] 实施例8复合PEG微球粉末的制备(五)\n[0046] 将实施例1中的PSMA-PEG和发射波长为680nm的CuInS2/ZnS量子点和Fe3O4磁性纳米颗粒溶于甲苯中，PSMA-PEG浓度为2g/mL，量子点浓度为1nM/L，Fe3O4磁性纳米颗粒浓度为\n1nM/L，以之作为分散相。采用孔径为5μm的SPG多孔膜，利用压力为20KPa的氮气将分散相挤压过膜，进入含有乳化剂SDS浓度为1wt.％的水连续相，连续相的流速是0.40m/s，得到液滴粒径均一的水包油乳液。于25℃和350rpm磁力搅拌下进行搅拌挥发。待溶液中甲苯完全挥发后，对得到的量子点标记荧光微球悬浮液用磁力进行分离收集。并用去离子水离心洗涤3次，无水乙醇离心洗涤3次，冷冻干燥得到表面带有羧基的量子点/Fe3O4复合荧光磁性微球的固体粉末。经电镜扫描观察，制得的量子点/Fe3O4复合荧光磁性微球为表面光滑的球形颗粒，平均粒径为6.8μm，粒径分布变异系数CV为9％左右，单分散性较好。\n[0047] 经激光共聚焦观察，微球内部量子点分布均匀，见图2。\n[0048] 实施例9基于功能性纳米颗粒复合PEG微球的生物检测探针(一)\n[0049] 将实施例8所制备的量子点/Fe3O4复合PEG微球的表面羧基在EDC化下，连接上N-羟基琥珀亚酰胺，然后再连接甲胎蛋白抗体AFP-Ab作为探针分子。量子点复合荧光微球在表面连接AFP-Ab后形成特异性检测甲胎蛋白AFP的生物检测探针。将这种生物检测探针投入到含有甲胎蛋白AFP中的样品中反应后，再将探针上连接的目标物甲胎蛋白AFP用异硫氰酸荧光素标记。最后反应后的生物检测探针在激光激发下发出荧光信号，通过微球内部量子点荧光信号和探针分子上所连接的目标物的标记荧光信号强度对样品内的甲胎蛋白AFP进行定性与定量分析。同时，进行对照组实验，对照组实验所采用的是羧基化的聚苯乙烯-马来酸酐微球(非PEG微球)，其内部纳米颗粒浓度及生物探针实验均保持一致。检测结果见附图3，从图中可以看出，两种微球均能对甲胎蛋白进行高灵敏的定量检测，而PEG微球探针检测灵敏度约高一个数量级，其在低浓度下标记荧光信号强度明显更低，表明其抑制非特异性吸附的效果。\n[0050] 实施例10基于功能性纳米颗粒复合PEG微球的生物检测探针(二)\n[0051] 将实施例6所制备的稀土纳米颗粒复合PEG微球在EDC活化下，连接上序列为5’-TCA AGG CTC AGT TCG AAT GCA CCA TA-3’的DNA链段作为探针分子，形成特异性检测DNA的生物检测探针。将这种生物检测探针投入到含有5’-TAT GGT GCA TTC GAA CTG AGC CTT GA-3’的DNA链段的样品中反应后，再将探针上所连接的目标物，即序列为5’-TAT GGT GCA TTC GAA CTG AGC CTT GA-3’的DNA链段用Cascade蓝标记。最后经处理过的稀土纳米颗粒复合微球在红外激光激发下发出荧光信号，通过微球内部稀土纳米颗粒荧光信号和探针分子上所连接的目标物的标记荧光信号对5’-TAT GGT GCA TTC GAA CTG AGC CTT GA-3’的DNA链段进行定性与定量分析。\n[0052] 实施例11基于功能性纳米颗粒复合PEG微球的生物检测探针(三)\n[0053] 将实施例3所制备的量子点复合PEG微球的表面羧基在EDC活化下，连接上N-羟基琥珀亚酰胺。然后，518nm量子点复合微球进一步连接抗甲胎蛋白抗体AFP-Ab作为检测探针分子。518nm量子点复合微球在表面连接甲胎蛋白抗体AFP-Ab后形成特异性检测甲胎蛋白AFP的生物检测探针。680nm量子点复合微球连接抗癌胚抗原抗体CEA-Ab作为检测探针分子。680nm量子点复合微球在表面连接抗体CEA-Ab后形成特异性检测癌胚抗原CEA的生物检测探针。将这两种生物检测探针一起投入到同时含有甲胎蛋白AFP和癌胚抗原CEA中的样品中反应后，将探针上连接的目标物再用藻红蛋白标记。反应后的生物检测探针在激光激发下发出荧光信号，微球内部量子点荧光在518nm的为AFP检测结果，微球内部量子点荧光在\n680nm的为CEA检测结果，再通过探针分子上所连接的目标物的标记荧光强度对样品内AFP和CEA各自进行定量分析。\n[0054] 针对上述实施例1-8，需要说明的是，上述实施例并非穷举，所属技术领域的技术人员应当知道，所述的功能性纳米颗粒还可以是半导体纳米颗粒，金属纳米粒子；所述的功能性纳米颗粒还可以是以下量子点：HgS、CdSe、CdTe、ZnSe、HgSe、ZnTe、ZnO、PbSe、HgTe、CaAs、InP、InCaAs、CdSe/CdS、CdSe/ZnS、CdSe/ZnSe、CdS/ZnS、Cd/Ag2S、CdS/Cd(OH)2、CdTe/ZnS、CdTe/CdS、CdSe/ZnSe、CdS/HgS、CdS/HgS/CdS、ZnS/CdS、ZnS/CdS/ZnS、ZnS/HgS/ZnS/CdS、CdSe/CuSe、CdSeTe、CdSeTe/CdS/ZnS、CdSe/CdS/ZnS、CuInS2、CuInSe2、CuInSe2/ZnS，以及掺杂量子点CdS:Mn、CdS:Mn、CdS:Cu、ZnS:Cu、CdS:Tb、ZnS:Tb等；所用的聚合物还可以是聚苯乙烯、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸乙酯、聚酰胺、聚丙烯腈、聚碳酸酯、聚己内酯、聚氨酯、聚乳酸、壳聚糖、白蛋白、胶原、聚乙酸乙酯、聚苯乙烯丙烯酸共聚物、聚苯乙烯甲基丙烯酸共聚物或聚苯乙烯-甲基丙烯酸甲酯共聚物等；所用的PEG衍生物还可以是包多臂PEG，Y型结构，枝状结构，PEG混合体系及其它衍生物；所用的表面改性的方法还可以是磺化等，经表面改性还可连接有以下官能团中的一种或几种：氨基、磺酸根基、硝基、羟基、巯基、氯基或酯基等，并可通过官能团连接以下连接物：生物素、亲和素或抗生蛋白链菌素等。\n[0055] 本发明的基于功能性纳米颗粒复合PEG微球的生物检测探针可用于检测样品中一种或多种目标物，如用于疾病诊断中检测细胞因子、过敏原和自身免疫反应、HLA分型、SNP检测、肿瘤特异抗原定量检测、多重微生物运量检测等；或用于基础研究中如基因分型、蛋白表达分型、酶-底物分析、核酸研究等；还可运用到食品安全、农兽药残留多重定量检测和司法鉴定等领域。\n[0056] 具体地，采用本发明的基于复合PEG微球的生物检测探针检测样品中一种或多种目标物的方法是：\n[0057] (1)将本发明的生物检测探针中的一种或多种组合投入到含有目标物的样品中，探针分子与目标物特异性成键；\n[0058] (2)对连接在生物检测探针上的目标物进一步用荧光物质进行荧光标记；\n[0059] (3)利用仪器对生物探针检测结果进行分析。\n[0060] 步骤(1)中所述的目标物包括蛋白质、蛋白质片段或核酸；步骤(2)中所述的荧光物质包括：异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)、碘化丙啶(PI)、化青素(CY5)、叶绿素蛋白(preCP)、藻红蛋白-德克萨斯红、Cascade蓝及表面改性量子点；步骤(3)中，利用仪器对生物探针检测结果进行分析指的是利用仪器，通过对微球内部纳米颗粒性能的测定来对检测样品中的目标物进行定性分析，同时通过对生物检测探针上所连接的目标物标记荧光强度来对检测样品中的目标物进行定量分析；用于检测的常用仪器包括：流式细胞仪、Luminex悬浮式阵列检测系统(美国Luminex公司)、荧光分光光度计、光纤光谱仪、激光共聚焦显微镜、荧光显微镜、震动样品磁强计。\n[0061] 对生物探针检测结果进行分析进一步包括：利用本发明的复合PEG微球内部纳米颗粒性能的测定来对检测样品中的目标物进行定性分析；通过生物检测探针上所连接的目标物标记荧光的强度来对检测样品中的目标物进行定量分析，其中生物检测探针上所连接的目标物标记荧光的强度与检测样品中的目标物浓度成正比关系。\n[0062] 以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。