前列腺素E1原料药生产工艺

1、一种前列腺素E1原料药生产工艺，其特征在于按以下步骤进 行：
(1)用W1-7骨架镍把羊精囊中复合酶进行固相化，送入特制生 化反应器；
所述W1-7骨架镍是通过如下制备方法获得的：
A：配料
原料名称       规格或技术要求               投料重量比
镍-铝合金粉    含镍45-50％，40目-60目       1
氢氧化钠       化学纯                       1.5
水
               经G4砂芯滤过自来水           3  投料用水、洗水未计算在内 
B：制备W1-7骨架镍
在滤过的投料量自来水中加入投料量氢氧化钠溶解完全，使溶液 冷却至30℃逐渐加入镍-铝合金粉，控制反应液温度低于75℃下逐 渐加完镍-铝合金粉，控制加入速度不冲料；加完料，使反应物温度 升至105-110℃，压力0.2MPa，保温反应1小时，自然降温至60℃， 用夹套冷却水冷却料温至30℃，用滤过自来水洗至料液pH值为 6.5-7.0，制得还原活性在W1至W7间的W1-7骨架镍；将W1-7骨架 镍在充氮气环境下抽真空，充氮气，再抽真空，充氮气，连续三次， 将W1-7骨架镍吸附氢气抽出，取样在空气中不会燃烧止，用饱和 EDTA水溶液浸泡待用；
所述特制生化反应器由上盖、封底和直径与高等长的筒体组合而 成，筒体内装设有两个吊篮，吊篮下部设有承受吊篮的固定板和吊篮 支架，吊篮外缘与筒体间隙处设有密封滤布，筒体底部的反应液导出 管与一循环泵相接，循环泵通过管道由外界通至筒体内，吊篮下方有 一根进气管，进气管的筒体内一端开口向下、筒体外一端开口向上， 反应器的上盖连接有放空管、真空压力表和进液管，进液管和反应液 导出管通至配料罐；
(2)在特制生化反应器中加入磷酸盐缓冲液、二高-γ-亚麻 酸溶液、半胱胺盐酸盐、氢醌、固相复合酶，通入纯氧维持反应器内 压力0.005-1.000MPa；一边连续通入磷酸盐缓冲液-二高-γ-亚麻 酸溶液，一边连续流出反应液，连续进行酶催化反应，反应温度为 0-58℃，磷酸盐缓冲液pH值为8.0±0.1，流出反应液进入膜分离器 中；所述磷酸盐缓冲液-二高-γ-亚麻酸溶液各组分的重量配比是 二高-γ-亚麻酸0.10％-0.60％、半胱胺盐酸盐0.50％-0.80％、氢 醌0.001％-0.005％、磷酸盐缓冲液98.595％-99.399％；
(3)在膜分离器中加提取剂二氯甲烷-RX复合溶剂，其中：
R包括：CH3-至C6H13-的烷基；
X包括：-OH，-O-C2H5，-C-O-C2H5基团；
控制分子量小于500的有机物质分子通过，分子量大于500的有 机蛋白质被拦截分离，分离出反应液复合溶液，送入减压浓缩器中；
(4)在减压浓缩器中减压薄膜蒸发复合溶剂，得前列腺素E1粗 品，将粗品送入结晶器中结晶纯化；
(5)在结晶器中用三元复合溶剂H2O-R1X-R2X或二元复合 溶剂H2O-R1X将前列腺素E1溶解、结晶纯化；
上述三元复合溶剂及二元复合溶剂中：
R1包括：CH3-至C6H13-的烷基；
R2包括：C2H5-至C8H17-的烷基；
X包括：-OH，-O-C2H5，-C-O-C2H5基团。
2、根据权利要求1所述的前列腺素E1原料药生产工艺，其特征 在于：所述的特制生化反应器中的吊篮由不锈钢丝网制成，吊篮厚度 为反应器半径的二分之一，两吊篮上下间隔为吊篮厚度。

技术领域\n本发明涉及一种原料药的生产工艺，特别是指前列腺素E1原料药 的生产工艺。\n背景技术\n目前，国内前列腺素E1(简称PGE1)原料药的生产为实验室性质的 玻璃容器中手工生产，不仅产量低，而且杂质含量高，临床副作用大。 有的虽然已形成工业化生产，但生产周期长，从投料到出精品原料药 要7-15天。在国际上，如德、美、日等国均已对前列腺素E1原料药 进行工业化生产。但产品的纯度、成本、价格、年产量、生产周期等 并不理想。\n本案申请人曾于95年提出过一种前列腺素E1原料药的生产工艺， 并已申请专利，见CN951。该工艺的过程是：(1)用精制哺乳动物精囊 的微粒在离心机中实现复合酶纯化，送入生化反应器；(2)在生化反应 器中进行酶催化反应，再将其送入稀释器中；(3)在稀释器中加入丙酮 及柠檬酸，使反应终止，提取PGE1溶液，并将提出的溶液送入自动分 离机；(4)分离出固体酶蛋白和水，浓缩得PGE1粗制晶体；(5)进行PG E1的精制；(6)在层析柱中进行柱层析，将收集的纯PGE1溶液进行结晶 纯化，获得最终产品。该工艺在其产品纯度、生产成本、生产周期等 方面均优于目前国内外现有生产方法，特别是在生产周期上与德、美、 日等国相比缩短了6倍。但该生产工艺中PGE1溶液的结晶纯化利用了 层析柱，使得生产成本仍较高，生产周期较长，另外浓缩丙酮提取液 造成产品变质及含量递降重大缺陷。\n发明内容\n本发明的目的是在上一研究成果的基础上，进一步挖掘潜力，提 供一种新的前列腺素E1原料药生产工芝，以进一步提高产品质量，降 低生产成本，革除柱层析，避免浓缩丙酮提取液造成产品变质及含量 递降的缺陷，进一步缩短生产周潮，并可连续大规模工业化生产。\n本发明提供的前列腺素E1原料药的生产工艺，包括以下步骤：\n(1)用W1-7骨架镍把羊精囊中复合酶进行固相化复合，送入生化 反应器；\n(2)在生化反应器中加入磷酸盐缓冲液，固相化复合酶、半胱胺 盐酸盐、氢醌，通入纯氧维持反应器内压力0.005-1.000Mpa；一边 连续通入磷酸盐缓冲液-二高-γ-亚麻酸溶液，一边连续流出反应 液，连续进行酶催化反应，流出反应液进入膜分离器中；\n(3)在膜分离器中加入提取剂二氯甲烷-RX复合溶剂，其中：\nR包括：-CH3至-C6H13的烷基；\nX包括：-OH，-O-C2H5，-C-O-C2H5基团。\n控制分子量小于500的有机物质分子通过，分子量大于500的有 机蛋白质被拦截分离，分离出有机蛋白质作饲料添加剂，分离出反应 液复合溶液，送入减压浓缩器中；\n(4)在减压浓缩器中减压薄膜蒸发复合溶剂，得前列腺素E1粗品， 将粗品送入结晶器中结晶纯化；\n(5)在结晶器中用三元复合溶剂H2O-R1X-R2X或二元复合溶剂 H2O-R1X将前列腺素E1溶解，结晶纯化；\n上述三元复合溶剂和二元复合溶剂中，\nR1包括：-CH3至-C6H13的烷基；\nR2包括：-C2H5至-C8H17的烷基；\nX包括：-OH，-O-C2H5，-C-O-C2H5基团。\n为了便于审查员清楚明了本发明所提供的技术方案，现对其作进 一步说明。\n本发明提供的前列腺素E1原料药的生产工艺如下：\n1、固相复合酶制备：\n(1)冬天在屠宰场取出刚发育成熟的公羊的贮精囊，离体后除去 脂肪和其他结缔组织、肌肉，立即在冷藏柜中冷冻贮存和运输。\n(2)称取12-15公斤的冷冻羊精囊，用体积比1∶1的0.154摩 尔/升的氯化钾水溶液迅速浸洗，立即倒去洗液。\n(3)再用15-19升的浓度为0.154摩尔/升、温度为0-10℃的 氯化钾水溶液浸泡羊精囊立即在立体胶体磨中粗磨一次，再精磨一次 成1-2微米颗粒，制成匀浆。\n(4)匀浆在离心机中于3000-9500转/分转速进行第一次离心25 分钟。\n(5)取出离心杯中上层清液，除去油脂，用2摩尔/升柠檬酸液调 pH值4.0-5.0，再次在离心机中于3000-9500转/分转速离心25分 钟。倒出上层清液，取出下层湿酶称重，便制得纯化复合酶。\n(6)计算湿酶的n值\n2、酶促反应操作：\n(1)底物反应液配制：\n按重量配方：\n二高-γ-亚麻酸0.10％-0.60％(反应底物)\n半胱胺盐酸盐：0.50％-0.80％(辅酶因子)\n氢醌：0.001％-0.005％(活化因子、抗氧剂)\n磷酸盐缓冲液：98.595％-99.399％，600ml×n(体积量)\n以上总重量为百分之百。其中磷酸盐缓冲液体积(毫升)为复合湿 酶重量(克)2倍。\n配方说明：a.磷酸盐缓冲液浓度为0.1摩尔/升，且其中加入10％ 体积的乙二胺四乙酸二纳盐(EDTA)饱和水溶液。\n           b.磷酸盐缓冲液配制：磷酸二氢钾(分析纯)2.90克 和磷酸氢二钾(分析纯)88.00g溶解成约2000ml水溶液，pH8.0±0.1； EDTA(分析纯)46.5克溶于1000ml水中；每900ml磷酸盐缓冲溶液中 加入100mlEDTA溶液作为投料用磷酸盐缓冲液。\n            c.半胱胺盐酸盐也可用还原型谷胱甘肽代替，配方 中所占的百分比基本相同。\n(2)复合酶固相化：\n①W1-7骨架镍制备：\na.配料\n原料名称        规格或技术要求     投料重量比\n镍-铅合金粉     含镍45-50％        1\n                40目-60目\n氢氧化钠        化学纯             1.5\n水              G4砂芯滤过自来水   3\n(投料用水，洗水没计算在内)\nb.制备W1-7骨架镍：\n在滤过的投料量自来水中加入投料量氢氧化钠溶解完全，并使溶 液冷却至30℃。逐渐加入镍-铝合金粉，反应时产生大量的氢气放出， 同时反应液温度升高。控制反应液温度低于75℃下逐渐加完镍-铝合 金粉，控制加入速度不冲料。加完料，使反应物温度升至105-110℃， 压力0.2MPa保温反应1小时自然降温至60℃，用夹套冷却水冷却料 温至30℃，用滤过自来水洗至料液pH值为6.5-7.0，制得还原活性 在W1至W7间的W1-7骨架镍。\n将W1-7镍在充氮气环境下，抽真空，充氮气，再抽真空，充氮气 连续三次，将W1-7骨架镍吸附氢气抽出，取样在空气中不会燃烧(发生 火花)止，用饱和EDTA水溶液浸泡待用。\nB、复合酶固定：\n取2倍湿酶重量的沥去浸液的W1-7镍备用(要扣除其吸收占重量 40％水)。\n用辅酶因子液将湿酶匀浆(辅酶因子液配制：分析纯还原型谷胱 甘酞以湿酶重量计算，n×1.0-2.0g；氢醌(分析纯)n×0.05g，n值 为前述计算湿酶重n值，两者溶于湿酶等体积的0.1摩尔/升磷酸盐缓 冲液中)。\n将用不锈钢加工制成大布氏漏斗底层以二层绸布一层滤纸作过滤 介质。过滤布上面用W1-7骨架镍先铺一层约2mm厚度。再将全部投料 用骨架镍倒入湿酶匀浆中搅拌均匀。将混和物倒入漏斗中抽滤。再用 滤液重洗匀桨容器内壁，洗液倒入布氏漏斗中抽滤，复合酶已固定到 W1-7骨架镍孔中。用两个大小与吊篮大小配套的丝绸滤布袋装好固定化 复合酶，袋中留一定空间扎紧袋口，两袋固定化复合酶连袋平铺满两 吊篮，不留空隙，两吊篮在吊篮支架上整体吊入生化反应器中，再把 滤液渗透到两袋W1-7镍固定的复合酶中，渗出滤液存生化反应器底部 待与反应液混合。W1-7骨架镍固定复合酶原理是表面吸附，靠分子间力 维持。\n③本发明使用的生化反应器及吊篮图示结构说明：\n图1为生化反应器结构示意图。\n1-筒体        2-吊篮         3-密封滤布    4-吊篮支架\n5-固定板      6-循环泵       7-进气管      8-真空压力表\n9-放空管      10-配料罐      11-搅拌器\n生化反应器由上盖、封底和直径与高等长的筒体组合而成，筒体 内装设有吊篮，吊篮下部设有承受吊篮的固定板和吊篮支架，吊篮外 缘与筒体间隙处设有密封滤布，筒体底部的反应液导出管与一循环泵 相接。循环泵通过管道由外界通至筒体内，吊篮下方有一根进气管， 进气管的筒体内一端开口向下、筒体外一端开口向上。反应器的上盖 连接有放空管、真空压力表和进液管，进液管和反应液导出管通至配 料罐。\na.生化反应器为不锈钢板制椭园盖及封底和直径与高等长的筒体 组合而成。\nb.盖与筒体1由有密封糟及密封垫片的法兰用螺栓紧固密封，可 拆开，罐底与筒体焊接。\nc.用支架4固定上、下两个圆形、相等大小的吊篮2，吊篮2用 不锈钢丝网制成。吊篮直径略小于反应器内径，吊篮厚度为反应器半 径二分之一，两吊篮上、下间隔为吊篮厚度。上吊篮之上吊篮厚度尺 寸高处有一个大进液喷淋头，喷淋头筛板面直径为吊篮直径的四分之 三。下层吊篮下面有进气管7偏离罐底中心，下端管口离罐底板15mm 左右，进入的氧气在罐底反弹向上分散。反应液与氧气在固相化酶层 呈气液逆向对流。\nd.吊篮固定支架4上端有两个吊环，拿住两个吊环，支架与及两 个吊篮都可整体进、出反应器。反应器中放入复合酶后，用磷酸盐缓 冲液浸湿丝绸滤布3，并用此丝绸滤布扎紧且密封吊篮与罐壁间隙， 使气、液都非得经过固相化复合酶层进行充分分散及接触。\ne.反应器罐底中心有反应液导出管及阀门，罐顶有放空管9、真 空压力表8、温度计装置。\n④W1-7镍固定化复合酶的优点：\na.反应物气、液、酶粒充分分散在镍骨架空洞中，三者又充分地 吸附在镍空洞中，氧气、底物与酶催化活性中心接触机率、比表面积、 接触后催化效果远比由搅拌产生的要强得多，反应速率要提2-4倍。\nb.可避免因剧烈搅拌(分散氧、酶)产生剪接力对酶的损害及酶失 活，自溶。可达到延长复合酶活性时间，可连续反应2-3批，使占原 料成本90％的复合酶成本大幅度降低。\nc.加压可使反应液中氧含量增大，加之W1-7镍吸附氧分子形成原 子离子成分倾向大增。所需要的反应速度大增，杂质少，产品质量好， 收率高，副作用小。\nd.骨架镍吸附酶用后可制饲料蛋白，W1-7骨架镍经处理可反复使 用。\n(3)酶促反应操作：\n在生化反应器中边通入纯氧，边导入反应液(配制好的磷酸盐缓 冲液-二高-γ-亚麻酸溶液)，边导出反应液(待反应器底有一定反 应液存积时)，导出反应液与进入反应液体积基本相等，并维持反应器 氧气压力0.005-1.000MPa，反应温度为0-58℃，将前10分钟导出 的反应液重加入反应器中再反应一次，待此部份反应液反应毕，计反 应液体积为12×600ml以上体积时，终止反应，(固相复合酶若有活力， 仍可再进行1-2批反应)终止反应后反应液进入膜分离器中。\n3、提取操作及粗品制备：\n在膜分离器中加入反应液体积3-5倍体积的提取剂二氯甲烷-RX 复合溶剂。其中：\nR包括：CH3-至-C6H13的烷基；\nX包括：-OH，-O-C2H5，-C-O-C2H5基团。\n控制分子量小于500的有机物质分子通过(前列腺素E1的分子量 为354)，分子量大于500的有机蛋白质被拦载分离。分离出有机蛋白 作饲料添加剂，分离出反应复合物溶液调pH值3.0-4.5后静止分层， 将下层二氯甲烷-RX复合溶液送入减压薄膜蒸发器中减压蒸发。维持 蒸发温度0-60℃，浓缩得到固体物PGE1粗晶。\n4、精品制备：\n将PGE1粗品用三元复合溶剂H2O-R1X-R2X或二元复合溶剂 H2O-R1X进行结晶纯化，得纯品PGE1，纯度可达99.95％。\nR1包括：CH3-至-C6H13的烷基；\nR2包括：-C2H5至-C8H17的烷基；\nX包括：-OH，-O-C2H5，-C-O-C2H5基团。\n被拦载的分子量大于500的蛋白质用于作饲料添加剂。\n将本工艺方法的生产规模，生产周期，生产成本以及得到的产品 纯度与现有技术比较列表如下。\n本发明提供的工艺与国内外现有生产前列腺素E1的工艺比较，其 优点在于：\n1、本发明工艺生产的产品纯度高，疗效好，无毒，副作用轻微。 生产中无三废排放。不使用易燃易爆溶剂，保证生产安全。\n2、本发明工艺以连续化工业生产代替间断性手工生产，采用固 相化复合酶，加压酶促反应、膜分离、二元、三元复合溶剂结晶纯化 等现代技术，产率高，劳动强度小，生产成本降低30％以上。\n\n3、简化生产工序，缩短生产周期，国外全合成要49天，国内为 7-15天，本发明工艺仅为4天。\n4、浓缩收集复合溶剂可套用，分离出有机蛋白可作饲料蛋白，W1-7 骨架镍可反复使用。\n5、从羊精囊中制取复合酶固相化后，可反复使用，催化效率高， 缓和资源紧缺矛盾，可工业化生产。\n附图说明\n图1为生化反应器结构示意图。\n1-筒体       2-吊篮           3-密封滤布       4-吊篮支架\n5-固定板     6-循环泵         7-进气管         8-真空压力表\n9-放空管     10-配料罐        11-搅拌器\n具体实施方式\n下面提供本发明的实例。\n实施例一\n按前所述制备复合酶操作以12公斤精制羊精囊(不带脂肪及结 缔组织等)制成复合湿酶重3000克。并把3000克复合酶制成固相化复 合酶。\n固相化复合酶制备配料：\n谷胱甘肽(还原型)：11.0克(10.0×1.1克)\n氢醌：0.50(克(10.0×0.05克)\n磷酸盐缓冲液：3000ml(与复合酶等重量，视此液比重为1)\n磷酸盐缓冲液浓度为0.1摩尔/升，且其中混有10％体积的EDTA 饱和液，pH7.9。\n以上四者混合成匀浆与扣除水分的6000克W1-7骨架镍按前面所述 操作制成固相化复合酶放入生化反应器吊篮中备用。\n配制磷酸盐缓冲液-二高-γ-亚麻酸溶液：\n二高-γ-亚麻酸  纯度98％       12.5克  占0.20％\n半胱胺盐酸盐    分析纯         15.0克  占0.25％\n氢醌            分析纯         0.30克  占巴0.01％\n磷酸盐缓冲液0.1摩尔/升，pH7.9，6000ml，占99.54％\n                                       总：100％\n磷酸盐缓冲液中含10％体积的EDTA饱和液，视此混合液比重为1， 其量的复合酶重量2倍。\n按说明书述及磷酸盐配制方法配制磷酸盐缓冲液并把上述物质溶 解于投料量的磷酸盐缓冲液中。在配料罐中配料并预热到36℃备用。\n向生化反应器中充纯氧，维持反应器内压力0.05MPa，达反应压 力后向反应器内喷淋反应底物的磷酸盐缓冲液。25分钟内泵完配好的 反应底物溶液，泵入反应液10分钟后开始边泵入边泵出反应液，且泵 入泵出反应液速度基本相等。前10分种泵出的反应液又复泵入反应器 中，反应器中反应温度维持在30-35℃。反应液体积为6000ml，加 上固相化复合酶用的辅酶因子液3000ml，当泵出的反应液在12× 6000ml以上，即7200ml以上后停止通氧气，终止反应。把反应液全部 泵出，反应液泵至膜分离器前存液器内，用2摩尔/升柠檬酸液调pH 值3.0-4.0，加入反应液体积2倍量的RX溶剂，搅拌，再加入反应 液体积3倍量的二氯甲烷，搅拌，静止分层，先把底层提取液进入膜 分离器中拦载分子量大于500的蛋白质，分离大分子后的混合提取液 再在分离器后存液器内静止分层，再泵入液-液分离器内，再把水分 除尽。除尽水及蛋白质的提取液送入减压薄膜蒸发器中于60℃下温度 蒸发浓缩，得PGE1粗品。冷却收集混合溶剂可套用。\nPGE1粗品在二元复合溶剂H2O-R1X中于60℃水溶加热溶解成饱和 液后，再缓缓滴入溶剂R2X使液体少部分出现混浊为止。再自然冷却 至室温，再放入冰柜中冷冻结晶。制得PGE1精品，纯度99.95％。\nR1包括：CH3-至C6H13-的烷基；\nR2包括：C2H5-至C8H17-的烷基；\nX包括：-OH，-O-C2H5，-C-O-C2H5基团。\n实施例二\n配制磷酸盐缓冲液-二高-γ-亚麻酸溶液：\n二高-γ-亚麻酸0.20％，半胱胺盐酸盐0.40％，氢醌0.0015％， 加上磷酸盐缓冲液量总共100％(重量)。其它条件均不变，按上述工 艺进行生产，最终得到PGE1精品，纯度达99.95％。