达托霉素高产菌株及制备方法

1.玫瑰孢链霉菌Streptomyces roseosporus的突变株Streptomyces roseosporus SCU，其保藏号为CGMCC No.6356。
2.制备达托霉素的方法，其特征在于以发酵6～7天的玫瑰孢链霉菌Streptomyces roseosporus突变株Streptomyces roseosporus SCU菌液为原料分离纯化得到达托霉素，该突变株的保藏号为CGMCC No.6356。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于包括以下步骤：收集发酵6～7天的玫瑰孢链霉菌Streptomyces roseosporus菌液，离心收集得到上清液；用正丁醇萃取后用HCl调节溶液pH3.5～4.5，用双蒸水冲洗正丁醇，pH维持3.5～4.5；再加入双蒸水并调节pH6.5～7.3；在水相中加入CaCl2，用正丁醇萃取，收集正丁醇萃取物，与双蒸水混合后，用
2＋
HCl调节pH3.5～4.5，双蒸水冲洗一次移除Ca ；去除水相，将醇相与双蒸水混合，以调节至pH7.0，达托霉素以钠盐形式存在于水相中，除去正丁醇，获得纯度80%以上达托霉素粗提物。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于包括以下步骤：收集发酵6～7天的玫瑰孢链霉菌Streptomyces roseosporus菌液，离心收集得到上清液；用正丁醇萃取后用HCl调节溶液pH3.5，用双蒸水冲洗正丁醇，pH维持3.5；再加入双蒸水并调节pH7.3；在水相中加入CaCl2，用正丁醇萃取，收集正丁醇萃取物，与双蒸水混合后，用HCl调节pH3.5，双蒸水
2＋
冲洗一次，保持pH3.5移除Ca ；去除水相，将醇相与双蒸水混合，以调节至pH7.0，达托霉素以钠盐形式存在于水相中，除去正丁醇，获得纯度80%以上达托霉素粗提物。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于还包括以下步骤：将所述达托霉素粗提物再用硅胶柱层析色谱、阴离子交换树脂或高效液相色谱进一步分离纯化，最终得到纯度90%以上的达托霉素制品。

达托霉素高产菌株及制备方法\n技术领域\n[0001] 本发明属于微生物制药领域，具体涉及一种达托霉素高产菌株及其制备方法。\n背景技术\n[0002] 抗耐药菌药物是目前世界上药物研究开发的重点和发展方向之一。达托霉素(Daptomycin，DAP)是近年第一个环脂肽类新型抗生素，其化学结构和作用机制不同于已有所有类别的抗生素,是近四十年来继噁唑烷酮类抗生素后,应用到临床的唯一新结构类别抗生素。达托霉素最初是由Lilly公司80年代末研究获得，于1997年11月将DAP的全球独家开发、生产销售权转让给Cubist制药公司开发的环脂肽类抗生素。2003年底，美国食品药品监督管理局(FDA)经过快速审理程序批准注射用达托霉素(商品名Cubicin)用于治疗金黄色葡萄球菌(包括耐甲氧西林菌株)、化脓性念球菌、无乳念球菌、停乳念球菌似马亚种和粪肠球菌(万古霉素敏感菌株)引起的复杂性皮肤及皮肤组织感染(cSSSI)。随后也批准用于治疗金黄色葡萄球菌引起的菌血症(SAB)，包括甲氧西林敏感性金黄色葡萄球菌(MSSA)和耐甲氧西林性金黄色葡萄球菌(MRSA)引起的右侧感染性心内膜炎(RIE)。\n注射用达托霉素除2003年在美国上市外，还分别于2006年在奥地利、德国、荷兰、西班牙、英国和2007年在瑞士上市。由于作用机制和结构上的差异，达托霉素在临床上有着明显的优势，其前景非常可观。达托霉素在2007年院区感染治疗药物市场上的销售额达到2亿美元，在以后数年内还有上升的潜力。\n[0003] 随着高致病耐药菌,如耐甲氧西林金葡菌(MRSA)、耐万古霉素肠球菌(VRE)和耐青霉素肺炎链球菌(PRSP)等的不断出现,临床上对新抗生素的需求变得十分迫切。达托霉素除了能作用于大多数临床相关革兰氏阳性菌外，对以上耐药菌均有很好的杀菌效果,毒副作用小。它的上市为临床医生提供了一种新的治疗方案。\n[0004] 迄今，我国还没有研发具有自主知识产权的达托霉素药品，只是在2009年进口Cubist公司的产品。国内中国科学院上海有机化学研究所和上海吉尔生化有限公司有机合成达托霉素获得成功（专利申请号200710037006.6），但其合成工艺复杂、产品得率低，生产成本较高，不适宜达托霉素的工业化生产。而以Streptomyces lividans为宿主构建基因工程菌,进行达托霉素的异源表达，表达水平(22mg/L)远低于原菌株。进一步优化培养基中磷酸盐水平,删除产放线菌素的act基因簇以减轻宿主细胞的代谢负荷,提高外源基因表达水平,达托霉素产量最终可以达到55mg/L。由于受表达水平的制约,利用Streptomyces lividans进行达托霉素的异源表达目前仅停留在实验室研究阶段。达托霉素异源表达水平距产业化要求尚有较大差距（Julia P,Xiang L,Whiting A,et al.Heterologous production of daptomycin in streptomyces lividans.Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology,2006,33(2):121-128.）。\n发明内容：\n[0005] 本发明要解决的技术问题是目前达托霉素产量低，难以获得的技术问题。本发明采用的解决上述技术问题的技术方案为提供一种玫瑰孢链霉菌Streptomyces roseosporus的突变株，命名为Streptomyces roseosporus SCU。\n[0006] 本发明玫瑰孢链霉菌Streptomyces roseosporus的突变株是由申请人四川大学以玫瑰孢链霉菌（Streptomyces roseosporus）NRRL 11379株为出发菌株诱变得到，该突变株已于2012年07月12日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101）保藏，分类命名为玫瑰孢链霉菌Streptomyces roseosporus，保藏号为CGMCC No.6356。\n[0007] 其中，上述玫瑰孢链霉菌突变株Streptomyces roseosporus SCU：具有高的达托霉素产量。\n[0008] 本发明还提供了一种制备上述的突变株Streptomyces roseosporus SCU的方法。\n该方法包括以下步骤：\n[0009] 1）、对野生型玫瑰孢链霉菌（Streptomyces roseosporus）进行EMS/紫外复合诱变处理，涂布斜面，培养，得诱变处理突变株；\n[0010] 2）分别将步骤1）所得的突变株斜面培养物制备孢子悬液，涂布含有达托霉素的固体平板，培养，即得耐受达托霉素的玫瑰孢链霉菌；\n[0011] 3）、分别挑取步骤2）所得耐受达托霉素的玫瑰孢链霉菌单菌落进行摇瓶发酵培养，检测发酵物中的达托霉素产量，选择达托霉素产量比出发菌株高的菌株，得到了Streptomyces roseosporus SCU。\n[0012] 本发明另外还提供了一种制备达托霉素的方法。该方法是以玫瑰孢链霉菌Streptomyces roseosporus的发酵菌液为原料分离纯化得到达托霉素。\n[0013] 其中，上述制备达托霉素的方法包括以下步骤：\n[0014] 收集发酵6～7d的玫瑰孢链霉菌Streptomyces roseosporus菌液，离心收集得到上清液；用正丁醇萃取后用HCl调节溶液pH3.5～4.5，用双蒸水冲洗正丁醇，pH维持3.5～\n4.5；再加入双蒸水并调节pH6.5～7.3；在水相中加入CaCl2，用正丁醇萃取，收集正丁醇萃\n2＋\n取物，与双蒸水混合后，用HCl调节pH3.5～4.5，双蒸水冲洗一次移除Ca ；去除水相，将醇相与双蒸水混合，以调节至pH7.0，达托霉素以钠盐形式存在于水相中，除去正丁醇，获得纯度80%以上达托霉素粗提物。\n[0015] 进一步的，上述方法的步骤为：收集发酵6～7d的玫瑰孢链霉菌Streptomyces roseosporus菌液，离心收集得到上清液；用正丁醇萃取后用HCl调节溶液pH3.5，用双蒸水冲洗正丁醇，pH维持3.5；再加入双蒸水并调节pH7.3；在水相中加入CaCl2，用正丁醇萃取，收集正丁醇萃取物，与双蒸水混合后，用HCl调节pH3.5，双蒸水冲洗一次，保持pH3.5移\n2＋\n除Ca ；去除水相，将醇相与双蒸水混合，以调节至pH7.0，达托霉素以钠盐形式存在于水相中，除去正丁醇，获得纯度80%以上达托霉素粗提物。\n[0016] 其中，上述制备达托霉素的方法还包括以下步骤：将所述达托霉素粗提物再用硅胶柱层析色谱、阴离子交换树脂或高效液相色谱进一步分离纯化，最终得到纯度90%以上的达托霉素制品。\n[0017] 其中，上述制备达托霉素的方法中所述的玫瑰孢链霉菌Streptomyces roseosporus为其突变株Streptomyces roseosporus SCU。\n[0018] 本发明采用微生物发酵转化方法来生产DAP，即以Streptomyces roseosporus为出发菌株，经复合诱变处理和抗DAP筛选，通过对菌株的生长代谢条件的优化调控，最终选育出一株达托霉素产量达800-1000μg/ml的突变株Streptomyces roseosporus SCU。并对发酵液的达托霉素分离提取、纯化与体外活性检测，获得高纯度和高活性的最终产品达托霉素。\n[0019] 本发明的有益效果在于：本发明创造性地通过EMS/紫外复合诱变的方式获得了一种玫瑰孢链霉菌Streptomyces roseosporus突变株Streptomyces roseosporus SCU。\n该突变株能够高效生产达托霉素，且培养方便，制备达托霉素的过程也较为简便高效，能得到高纯度的达托霉素，具有很好的应用前景。\n附图说明\n[0020] 图1.1%EMS溶液处理玫瑰孢链霉菌孢子不同时间的生长试验。\n[0021] 图2.EMS和UV复合诱变后突变株抗DAP的水平测试试验。\n[0022] 图3.突变株发酵液抗菌性试验结果。\n[0023] 图4.达托霉素标准品最小抑菌浓度（MIC）试验结果。\n[0024] 图5.分离纯化DAP的色谱图(保留时间为3.42min)。\n[0025] 发明内容\n[0026] 本发明玫瑰孢链霉菌Streptomyces roseosporus的突变株是由申请人四川大学以玫瑰孢链霉菌（Streptomyces roseosporus）NRRL 11379株为出发菌株，通过EMS/紫外复合诱变的方式得到，该突变株已于2012年07月12日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101）保藏，分类命名为玫瑰孢链霉菌Streptomyces roseosporus，保藏号为CGMCC No.6356。\n[0027] 实施例一复合诱变玫瑰孢链霉菌\n[0028] 1、EMS诱变\n[0029] 以玫瑰孢链霉菌（Streptomyces roseosporus）NRRL 11379为出发菌株，NRRL美国农业研究菌种保藏中心（Agricultural Research Service Culture Collection）。经斜面培养14d的孢子，用灭菌生理盐水洗下加入装有玻璃珠的锥形瓶中，30℃，250rpm摇动\n6\n处理2h，无菌纱布过滤，得到孢子悬液（1×10 个/ml）。在50ml三角瓶内加入1ml孢子悬液、9ml磷酸缓冲液和0.1ml甲基磺酸乙酯（EMS）溶液，使EMS终浓度达到1％，30℃恒温振荡，分别处理一定时间（20～60min）。然后各取0.5ml处理液，加入0.5ml的5％硫代硫酸\n3\n钠溶液洗涤两次终止反应，稀释到2.5×10 个孢子/ml后，取0.1ml涂布于ISP2分离培养基（其成分为酵母膏0.4％，麦芽汁1％，葡萄糖0.4％，琼脂2％；所述的百分比均为质量体积百分比），30℃培养2-3d后，不同诱变时间的孢子均能在平板长出菌落（图1）。\n[0030] 2、紫外线诱变\n[0031] 采用经1%EMS溶液处理40min后生长出的单菌落，挑入ISP2斜面（其成分为酵母膏0.4%，麦芽汁1%，葡萄糖0.4%，琼脂2%；所述的百分比均为质量体积百分比），斜面培养\n14d的孢子，用灭菌生理盐水洗下加入装有玻璃珠的锥形瓶中，30℃,250rpm摇动2h，无菌\n6\n纱布过滤，得到孢子悬浮液并稀释到1×10 个/ml。\n[0032] 取10ml孢子悬液于10cm直径的无菌平皿中，放入超净台内的水平摇床上，8w紫外\n3\n灯下30cm处分别照射1min,2min，4min，然后稀释到2.5×10 个/ml，取0.1ml涂布于ISP2分离培养基，30℃培养10-12d可见单菌落长出。由于UV处理2分钟的孢子存活率适中，故挑取处理2分钟的单菌落接种到ISP2斜面培养12-14d，备用。\n[0033] 3、复合诱变后菌株抗DAP水平测试\n[0034] 将经过上述1,2复合诱变处理的2轮的突变株，分别划线在含有100-2000μg/ml梯度浓度DAP的ISP2培养基斜面上，30℃培养10-14d可见菌落能在100-1000μg/ml DAP的培养基斜面生长良好，在1500μg/ml DAP的培养基斜面生长很差，在2000μg/ml DAP的培养基斜面不生长（见图2）。\n[0035] 结果表明，经过EMS和UV的复合诱变，突变株抗自生代谢产物DAP的能力大大增强，故我们后续通过在含有1500μg/ml DAP的平板上涂布上述2中UV处理2分钟的孢子，\n30℃培养10-14d，可见菌落长出。\n[0036] 4、突变株的摇瓶发酵培养及发酵液抗菌性试验\n[0037] 4.1摇瓶培养\n[0038] 直接从生长良好的平板挑取合适接种的菌落于装有30ml种子培养基（TSB 30g，玉米淀粉35g，溶解于1L蒸馏水中，pH7.0）的250ml三角瓶中，30℃，200rpm摇床培养48h。\n[0039] 按4%（体积比）的接种量将种子培养液转接入装有300ml发酵培养基（见表1，混匀，溶于1L水中，pH7.5，培养基灭菌条件：121℃，灭菌20min。）的1000ml三角瓶中，30℃，\n200rpm摇床培养。从第24h后，每隔12h，向摇瓶中加入癸酸使其终浓度为0.2g/L，每组三个摇瓶。自发酵培养4-10h后，每12h取样测量发酵液中达托霉素的浓度及菌体浓度，以确定癸酸补加时间和发酵时间。\n[0040] 表1.液体发酵培养基组成\n[0041] \n 玉米淀粉 20g\n 葡萄糖 20g\n 黄豆粉 20g\n 酵母浸粉 2.5g\n MgSO4 0.175g\n KCl 0.2g\n CaCO3 2g\n[0042] 4.2发酵液抗菌性试验：\n[0043] 收集发酵6-7d的菌液，4000rpm，离心20min，收集上清液，0.22μm滤器过滤备用。\n抗菌性试验步骤参照美国临床实验室标准化协会（CLSI）标准文献M07-A8微量肉汤稀释法进行。测试菌株为金黄色葡萄球菌Staphyloccocus aureus ATCC25923，ATCC为美国标准生物品收藏中心(American type culture collection)。达托霉素标准品最小抑菌浓度（MIC）为0.25μg/ml。\n[0044] 操作步骤：\n[0045] 1）用接种环挑取形态相似菌落3-5个，接种于4-5ml的Mueller-Hinton（MH）肉汤中，37℃孵育6-8h。增菌后的对数生长期菌液用生理盐水校正浓度至0.5麦氏比浊标准，\n6\n并在此基础上稀释20倍，使菌液浓度约为5×10CFU/ml。\n[0046] 2）发酵液倍比稀释，稀释倍数为A，B，C，D，取96孔板按浓度梯度各加入稀释液\n5\n100μl，每孔加入菌液10μl，使菌液浓度约为5×10CFU/ml，做好阳性及阴性对照，37℃孵育16-20h后观察结果。\n[0047] 注：MH肉汤需调节Ca2+浓度为50μg/ml。\n[0048] 3）肉眼观察或使用酶标仪在570nm测定96孔板各孔的OD值，与阳性对照比较，以无菌生长孔为有效抑菌浓度。\n[0049] 4）达托霉素标准品最小抑菌浓度（MIC）如图3：\n[0050] 如图3所示，标准品浓度在0.25-8μg/ml之间时孔内培养基OD值与阴性对照差异不大，肉眼观察孔内培养基澄清无菌生长，而浓度低于0.25μg/ml时孔内培养基OD值与阴性对照有显著性差异(P<0.01)，肉眼观察孔内培养基浑浊有大量菌体生长，则可以确定\n0.25μg/ml为标准品对金黄色葡萄球菌Staphyloccocus aureus ATCC25923的最小抑菌浓度。标准品对菌株金黄色葡萄球菌Staphyloccocus aureus ATCC6538的最小抑菌浓度也为0.25μg/ml。\n[0051] 5）突变株发酵液抗菌性试验结果如图4：\n[0052] 如图4所示，发酵液稀释倍数在A-B之间时孔内培养基OD值与阴性对照差异不大，肉眼观察孔内培养基澄清无菌生长，而稀释倍数高于B时孔内培养基OD值与阴性对照有显著性差异(P<0.01),肉眼观察孔内培养基浑浊有大量菌体生长，则可以确定发酵液稀释倍数B为对ATCC25923的最小有效抑菌浓度，根据多次重复结果推算该菌株的达托霉素粗品含量约为800-1000μg/ml，此菌株在摇瓶培养复筛中产量最高，命名为Streptomyces roseosporus SCU。\n[0053] 实施例二DAP的分离纯化\n[0054] 收集上述菌株Streptomyces roseosporus SCU在上述实施例中发酵6-7d的菌液\n270ml，4000rpm，离心20min，收集得到250ml上清液。用正丁醇连续萃取两次，每次100ml，用1mol/LHCl调节溶液pH3.5～4.5，优选3.5，用30ml双蒸水冲洗正丁醇，pH维持3.5～\n4.5，优选3.5。加入100ml双蒸水，调节pH6.5～7.3，优选7.3，在水相中加入1.0g CaCl2用正丁醇萃取两次，每次80ml。收集正丁醇萃取物，与等体积双蒸水混合，用1mol/L HCl调\n2＋\n节PH3.5，15ml双蒸水冲洗一次，保持pH3.5移除Ca 。去除水相，醇相与50ml双蒸水混合，以1mol/LNaOH调节pH7.0，A-21978C以钠盐形式存在于水相中。在真空下蒸干除去正丁醇，再冻干处理，获得黄褐色样品，纯度约为83%。再利用硅胶柱层析色谱，阴离子交换树脂或高效液相色谱(HPLC)进一步分离纯化，最终得到纯度达95%的达托霉素制品（见图5）。