基于微粒子化学发光免疫分析的人血清脂联素检测试剂盒

1.基于微粒子化学发光免疫分析的人血清脂联素检测试剂盒，其特征在于，其由反应缓冲液、包被有脂联素单克隆抗体的磁性微粒子、标记有吖啶酯的脂联素单克隆抗体、发光液A、发光液B、脂联素抗原标准品溶液、浓缩洗涤液组成；
所述反应缓冲液为pH为7.4的磷酸盐缓冲液，内含1％牛血清白蛋白、0.5％酪蛋白、
0.1％Triton X-100、防腐剂；
所述磁性微粒子为表面覆有亲水性聚合物和羧基的磁珠，所述磁性微粒子的粒径为
1.5～3μm；
所述基于微粒子化学发光免疫分析的人血清脂联素检测试剂盒是由包括以下步骤的制备方法制备的：
1)制备反应缓冲液：所述反应缓冲液为pH为7.4的磷酸盐缓冲液，内含1％牛血清白蛋白、0.5％酪蛋白、0.1％Triton X-100和防腐剂；
2)制备包被有脂联素抗体的磁微粒：在磁微粒、EDC与NHS中加入MES溶液，再放置在垂直旋转仪上活化，将活化后的磁微粒与脂联素单克隆抗体放置在垂直旋转仪上标记，将反应后的磁微粒洗涤，再加入含有甘氨酸、0.5％牛血清白蛋白、0.05％Triton X-100、pH为
7.4的磷酸盐缓冲液，然后放置在垂直旋转仪上终止，将终止后的磁微粒洗涤，加入含有1％牛血清白蛋白、0.5％酪蛋白、0.1％Triton X-100、防腐剂、pH为7.4的磷酸盐缓冲液，得包被有脂联素单克隆抗体的磁微粒，
其中，所述磁微粒、EDC与NHS的质量比为1∶1∶1；所述MES溶液为pH为5的50mM MES溶液，使磁微粒的质量浓度为4mg/ml；所述活化的温度为25℃，活化的时间为20min；所述活化后的磁微粒与脂联素单克隆抗体的质量比为1000∶15；所述标记的温度为25℃，标记的时间为
3h；所述洗涤为洗涤3次；所述加入含有甘氨酸、0.5％牛血清白蛋白、0.05％Triton X-100、pH为7.4的磷酸盐缓冲液后，使磁微粒浓度为4mg/ml；所述放置在垂直旋转仪上终止的反应环境温度为25℃，时间为2h；所述加入含有1％牛血清白蛋白、0.5％酪蛋白、0.1％Triton X-100、防腐剂、pH为7.4的磷酸盐缓冲液后，使磁微粒浓度为4mg/ml；
3)制备吖啶酯标记的脂联素抗体：取待标记脂联素单克隆抗体50μg，加入含Nacl的磷酸盐缓冲液至体积为300μl，再加入5μl吖啶酯母液，振荡混匀，反应30min后加入200μl含Nacl和甘氨酸的磷酸盐缓冲液，混匀，反应30min后将产物转移至透析袋中，透析液为pH为
7.4的20mM PBS缓冲液，2～8℃避光透析，每隔2h换一次PBS缓冲液，共更换3次，以除去未标记的吖啶酯；将标记物取出，按实际体积加入10％牛血清白蛋白至牛血清白蛋白的终浓度为0.1％，体积比为1∶100，加入等体积甘油，混匀后，-15℃以下避光保存备用，其中，所述混匀采用手工颠倒20次混匀；
4)制备脂联素抗原标准品溶液：采用脂联素抗原，再用含有1％牛血清白蛋白、0.5％酪蛋白、0.1％Triton X-100、防腐剂、PH为7.4的磷酸盐缓冲液梯度稀释为240000ng/ml、
160000ng/ml、106666.67ng/ml、71111.11ng/ml、47407.41ng/ml、23703.7ng/ml、
11851.85ng/ml、5925.926ng/ml、2962.963ng/ml、1481.481ng/ml、740.7407ng/ml、
370.3704ng/ml、185.1852ng/ml、92.59259ng/ml、46.2963ng/ml的系列脂联素抗原标准品溶液；
5)制备发光液：发光液包括A液和B液，所述A液为过氧化氢和硝酸水溶液，A液中过氧化氢的质量浓度为0.5％～3％，硝酸的摩尔浓度为0.01～0.5M；所述B液为氢氧化钠与Triton X-100水溶液，氢氧化钠的摩尔浓度为0.05～1M，Triton X-100的体积浓度为0.1％～2％；
6)制备洗涤液：洗涤液是含有表面活性剂和生物防腐剂的磷酸盐缓冲液，其中，所述表面活性剂采用Triton X-100表面活性剂，所述生物防腐剂采用Proclin防腐剂；
而且，所述人血清脂联素检测试剂盒对人血清脂联素的检测过程如下：取10μl血清、
100μl反应缓冲液以及用反应缓冲液稀释为0.4mg/ml的50μl磁微粒在37℃的条件下反应
15min，然后用洗涤液洗涤2次，再加入50μl吖啶酯标记的抗体，37℃反应10min，再用洗涤液洗涤4次，最终加入发光液A和发光液B，测定发光值。
2.如权利要求1所述基于微粒子化学发光免疫分析的人血清脂联素检测试剂盒，其特征在于所述脂联素单克隆抗体是待检脂联素抗原的特异性单克隆抗体。

基于微粒子化学发光免疫分析的人血清脂联素检测试剂盒\n技术领域\n[0001] 本发明涉及化学发光检测试剂盒，尤其是涉及基于微粒子化学发光免疫分析的人血清脂联素检测试剂盒。\n背景技术\n[0002] 脂联素(adiponectin)亦称Acrp30、GBP28或AdipoQ，是由脂肪细胞分泌一种激素蛋白，能在人体血浆中稳定存在，浓度范围约为2～30μg/mL，占血浆蛋白总量的0.01％。\n([1]Arita Y,Kihara S,Ouchi N,et al.Paradoxical decrease of an adipose-specific protein,adiponectin,inobesity[J].Biochem Biophys Res Commun,1999,257(1):79-83)。随着对脂联素研究的不断深入，已发现，脂联素在肥胖症者和II型糖尿病患者血清中的浓度明显低于非肥胖者，其浓度的降低导致了胰岛素抵抗和高胰岛素血症，而脂联素有防止动脉粥样硬化斑块形成的作用，因此，脂联素与肥胖症患者II型糖尿病及冠心病的发生发展密切相关，即脂联素的明显降低预示着II型糖尿病及冠心病的发生明显增加([2]Zhang MH,Spies C,Ali S,et al.Adiponectin and inclucible ischemia in patients with stable coronary heart disease:data from the Heart and Soul study[J].Atherosclerosis,2009,205(1):233-238；[3]Kawano J,Arora R.The role of adiponectin in obesity,diabetes,and cardiovascular disease[J].J Cardiometab Syndr.2009,4(1):44-49)。测定血清中脂联素水平，对这些疾病的诊断和预后有重要意义。\n[0003] 目前，脂联素的临床诊断技术主要包括：放射免疫法(RIA)([4]Schulze MB,Shai I,Rimm EB,et al.Adiponectin and future coronary heart disease events among men with type 2diabetes[J].Diabetes,2005,54(2):534-539)、酶联免疫试验(ELISA)([5]Urbonaviciene G,Frystyk J,Flyvbjerg A,et al.Association of serum adiponectin with risk for cardiovascular events in patients with peripheral arterial disease[J].Atherosclerosis,2010,210(2):619-624)等方法，它们的优点是灵敏度较高，缺点是操作繁琐，耗时长，易受人为操作和外界因素干扰，自动化程度低，而且放射性标记物会对操作者产生危害，对环境造成污染。这些缺点限制了脂联素检测的推广应用，使其无法广泛地应用于临床诊断与科研工作。\n[0004] 微粒子化学发光免疫分析技术(Chemiluminescence Immunoassay，CLIA)是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术，是继放免分析、酶免分析、荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项最新免疫测定技术，具有操作简单、灵敏度高、线性范围宽、结果稳定、安全性好、便于自动化、产品有效期长、对环境无污染、对人体无毒无害等优点，是目前体外诊断试剂检测方法中的佼佼者，在技术上具有明显的优势。\n[0005] 目前微粒子化学发光免疫分析法已广泛应用于乙肝两对半(中国专利CN \n102072957)、性激素(中国专利CN 103954779)、肿瘤标志物等各种抗原的检测，取得了良好的社会效益，但国内外尚未见有此类脂联素检测试剂盒问世，本发明将填补这一空白，其市场应用前景广阔。\n发明内容\n[0006] 本发明的目的在于针对上述现有技术的不足，提供一种基于微粒子化学发光免疫分析的人血清脂联素检测试剂盒及其制备方法。\n[0007] 所述基于微粒子化学发光免疫分析的人血清脂联素检测试剂盒，包括反应缓冲液、包被有脂联素单克隆抗体的磁性微粒子、标记有吖啶酯的脂联素单克隆抗体、发光液A、发光液B、脂联素抗原标准品溶液、浓缩洗涤液。\n[0008] 所述反应缓冲液可为pH为7.4的磷酸盐缓冲液，内含1％牛血清白蛋白、0.5％酪蛋白、0.1％Triton X-100、防腐剂。\n[0009] 所述磁性微粒子为表面覆有亲水性聚合物和羧基的磁珠，所述磁性微粒子的粒径可为1.5～3μm。\n[0010] 所述脂联素单克隆抗体是待检脂联素抗原的特异性单克隆抗体。\n[0011] 所述基于微粒子化学发光免疫分析的人血清脂联素检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：\n[0012] 1)制备反应缓冲液：所述反应缓冲液为pH为7.4的磷酸盐缓冲液，内含1％牛血清白蛋白、0.5％酪蛋白、0.1％Triton X-100和防腐剂；\n[0013] 2)制备包被有脂联素抗体的磁微粒：在磁微粒、EDC与NHS中加入MES溶液，再放置在垂直旋转仪上活化，将活化后的磁微粒与脂联素单克隆抗体放置在垂直旋转仪上标记，将反应后的磁微粒洗涤，再加入含有甘氨酸、0.5％牛血清白蛋白、0.05％Triton X-100、pH为7.4的磷酸盐缓冲液，然后放置在垂直旋转仪上终止，将终止后的磁微粒洗涤，加入含有\n1％牛血清白蛋白、0.5％酪蛋白、0.1％Triton X-100、防腐剂、pH为7.4的磷酸盐缓冲液，得包被有脂联素抗体的磁微粒；\n[0014] 3)制备吖啶酯标记的脂联素抗体：取待标记脂联素单克隆抗体50μg，加入含Nacl的磷酸盐缓冲液至体积为300μl，再加入5μl吖啶酯母液，振荡混匀，反应30min后加入200μl含Nacl和甘氨酸的磷酸盐缓冲液，混匀，反应30min后将产物转移至透析袋中，透析液为pH为7.4的20mM PBS缓冲液，2～8℃避光透析，每隔2h换一次PBS缓冲液，共更换3次，以除去未标记的吖啶酯；将标记物取出，按实际体积加入10％牛血清白蛋白至牛血清白蛋白的终浓度为0.1％，体积比为1∶100，加入等体积甘油，混匀后，-15℃以下避光保存备用；\n[0015] 4)制备脂联素抗原标准品溶液：采用脂联素抗原，再用含有1％牛血清白蛋白、\n0.5％酪蛋白、0.1％Triton X-100、防腐剂、PH为7.4的磷酸盐缓冲液梯度稀释为240000ng/ml、160000ng/ml、106666.67ng/ml、71111.11ng/ml、47407.41ng/ml、23703.7ng/ml、\n11851.85ng/ml、5925.926ng/ml、2962.963ng/ml、1481.481ng/ml、740.7407ng/ml、\n370.3704ng/ml、185.1852ng/ml、92.59259ng/ml、46.2963ng/ml的系列脂联素抗原标准品溶液；\n[0016] 5)制备发光液：发光液包括A液和B液，所述A液为过氧化氢和硝酸水溶液，A液中过氧化氢的质量浓度为0.5％～3％，硝酸的摩尔浓度为0.01～0.5M；所述B液为氢氧化钠与Triton X-100水溶液，氢氧化钠的摩尔浓度为0.05～1M，Triton X-100的体积浓度为0.1％～2％；\n[0017] 6)制备洗涤液：洗涤液是含有表面活性剂和生物防腐剂的磷酸盐缓冲液。\n[0018] 在步骤2)中，所述磁微粒、EDC与NHS的质量比可为1∶1∶1；所述MES溶液可为pH为5的50mM MES溶液，使磁微粒的质量浓度为4mg/ml；所述活化的温度可为25℃，活化的时间可为20min；所述活化后的磁微粒与脂联素单克隆抗体的质量比可为1000∶15；所述标记的温度可为25℃，标记的时间可为3h；所述洗涤可洗涤3次；所述加入含有甘氨酸、0.5％牛血清白蛋白、0.05％Triton X-100、pH为7.4的磷酸盐缓冲液后，使磁微粒浓度为4mg/ml；所述放置在垂直旋转仪上终止的反应环境温度可为25℃，时间可为2h；所述加入含有1％牛血清白蛋白、0.5％酪蛋白、0.1％Triton X-100、防腐剂、pH为7.4的磷酸盐缓冲液后，使磁微粒浓度为4mg/ml。\n[0019] 在步骤3)中，所述混匀可采用手工颠倒20次混匀。\n[0020] 在步骤4)中，所述脂联素抗原可使用厦门万泰沧海生物技术有限公司自主研发生产的高纯度脂联素抗原。\n[0021] 在步骤6)中，所述表面活性剂可采用Triton X-100表面活性剂；所述生物防腐剂可采用Proclin防腐剂。\n[0022] 本发明的反应缓冲液为抗原抗体反应提供合适的反应条件；采用磁性微粒子偶联单克隆抗体，由于微粒子可以悬浮于样本溶液中，有利于微粒子表面抗体与待测物充分接触，缩短反应时间；以吖啶酯作为标记物，可以得到稳定、高强度的信号。本发明与已知的检测脂联素含量的试剂盒相比，具有操作简单、灵敏度高、线性范围宽、结果稳定、安全性好、便于自动化等优点，在临床检验等方面具有广阔的应用前景。\n[0023] 由于本发明的试剂盒采用微粒子化学发光免疫分析技术，比ELISA具有更高的灵敏度和更好的稳定性，填补了人血清脂联素检测的微粒子化学发光诊断试剂生产的空白。\n附图说明\n[0024] 图1为脂联素抗原标准品溶液曲线。\n[0025] 图2为本发明所述的基于微粒子化学发光免疫分析的人血清脂联素检测试剂盒和R&D Systems公司生产的Human Total Adiponectin/Acrp30Quantikine ELISA Kit分别对\n32份人血清检测结果的相关性分析。\n具体实施方式\n[0026] 以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。\n[0027] 本发明试剂盒采用微粒子化学发光免疫分析技术，检测人血清中脂联素的含量。\n下面具体描述基于微粒子化学发光免疫分析的人血清脂联素检测试剂盒及其制备方法。\n[0028] 基于微粒子化学发光免疫分析的人血清脂联素检测试剂盒，包括反应缓冲液、包被有脂联素单克隆抗体的磁性微粒子、标记有吖啶酯的脂联素单克隆抗体、发光液A、发光液B、脂联素抗原标准品溶液、浓缩洗涤液。\n[0029] 基于微粒子化学发光免疫分析的人血清脂联素检测试剂盒的制备方法，其具体步骤如下：\n[0030] (1)制备反应缓冲液。反应缓冲液为pH为7.4的磷酸盐缓冲液，内含1％牛血清白蛋白、0.5％酪蛋白、0.1％Triton X-100和防腐剂。\n[0031] (2)制备包被有脂联素抗体的磁微粒。将磁微粒、EDC与NHS的质量比为1∶1∶1，并加入pH为5.0的50mM MES溶液，使磁微粒浓度为4mg/ml，放置在垂直旋转仪上活化，活化环境温度25℃，时间20min。将活化后的磁微粒与脂联素单克隆抗体比例为每毫克磁微粒标记15μg的抗体，放置在垂直旋转仪上标记，反应环境温度25℃，时间3h。将反应后的磁微粒用洗液洗涤3次，加入含有甘氨酸、0.5％牛血清白蛋白、0.05％Triton X-100、pH为7.4的磷酸盐缓冲液，使磁微粒浓度为4mg/ml，放置在垂直旋转仪上终止，反应环境温度25℃，时间2h。将终止后的磁微粒用洗液洗涤3次，加入含有1％牛血清白蛋白、0.5％酪蛋白、0.1％Triton X-100、防腐剂、pH为7.4的磷酸盐缓冲液，使磁微粒浓度为4mg/ml，2～8℃保存备用。\n[0032] (3)制备吖啶酯标记的脂联素抗体。取待标记脂联素单克隆抗体50μg，加入含Nacl的磷酸盐缓冲液至体积为300μl，再加入5μl吖啶酯母液，振荡混匀，室温避光反应30min。反应后加入200μl含Nacl和甘氨酸的磷酸盐缓冲液，手工颠倒20次混匀，室温避光反应30min。\n反应后将产物转移至透析袋中，透析液为PH为7.4的20mM PBS缓冲液，2～8℃避光透析，每隔2h换一次PBS缓冲液，共更换3次，以除去未标记的吖啶酯。将标记物取出，按实际体积加入10％牛血清白蛋白至牛血清白蛋白的终浓度为0.1％(体积比1∶100)，加入等体积甘油，手工颠倒混匀后，-15℃以下避光保存备用。\n[0033] (4)制备脂联素抗原标准品溶液。参见图1，采用厦门万泰沧海生物技术有限公司自主研发生产的高纯度脂联素抗原，使用含有1％牛血清白蛋白、0.5％酪蛋白、0.1％Triton X-100、防腐剂、pH为7.4的磷酸盐缓冲液梯度稀释为240000ng/ml、160000ng/ml、\n106666.67ng/ml、71111.11ng/ml、47407.41ng/ml、23703.7ng/ml、11851.85ng/ml、\n5925.926ng/ml、2962.963ng/ml、1481.481ng/ml、740.7407ng/ml、370.3704ng/ml、\n185.1852ng/ml、92.59259ng/ml、46.2963ng/ml的系列脂联素抗原标准品溶液。\n[0034] (5)制备发光液。发光液包括A液和B液。其中A液为过氧化氢和硝酸水溶液，A液中过氧化氢的质量浓度在0.5％～3％之间，硝酸的摩尔浓度在0.01～0.5M之间；B液为氢氧化钠与Triton X-100水溶液，氢氧化钠的摩尔浓度在0.05～1M之间，Triton X-100的体积浓度在0.1％～2％之间。\n[0035] (6)制备洗涤液。洗液是含有表面活性剂(Triton X-100)和生物防腐剂(Proclin)的磷酸盐缓冲液。\n[0036] 本发明所述基于微粒子化学发光免疫分析的人血清脂联素检测试剂盒对人血清脂联素的检测过程如下：\n[0037] 取10μl血清、100μl反应缓冲液以及50μl磁微粒(用反应缓冲液稀释为0.4mg/ml)在37℃的条件下反应15min，然后用洗液洗涤2次，再加入50μl吖啶酯标记的抗体，37℃反应\n10min，再用洗液洗涤4次，最终加入发光液A和发光液B，测定发光值。样本的含量可以利用该试剂盒的标准曲线，通过发光仪自动计算出来。\n[0038] 本发明所述基于微粒子化学发光免疫分析的人血清脂联素检测试剂盒和R&D Systems公司生产的Human Total Adiponectin/Acrp30Quantikine ELISA Kit分别对来自厦门大学附属中山医院的32份人血清样本的检测结果对比，如表1所示。\n[0039] 表1\n[0040]\n[0041] 参见图2，本发明所述基于微粒子化学发光免疫分析的人血清脂联素检测试剂盒和R&D Systems公司生产的Human Total Adiponectin/Acrp30Quantikine ELISA Kit分别对来自厦门大学附属中山医院的32份人血清样本的检测结果的相关性为0.9053。