一种磁珠标记的氯霉素免疫检测方法

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一种磁珠标记的氯霉素免疫检测方法\n技术领域\n[0001] 本发明涉及一种磁性分离技术和酶联免疫检测技术，具体的说是一种利用磁珠标记配合酶联免疫检测方法对待检样品中氯霉素残留量进行测定的方法。 [0002] 背景知识 \n[0003] 氯霉素(Chloramphenicol，CAP)是20世纪中叶发现的一种广谱抗生素，对革兰氏阴性菌和阳性菌均有很好的抑制作用。由于其优良的抗菌性、稳定的药性和低廉的价格，曾在一段时期内作为细菌性疾病的治疗药物应用与人和动物临床，并作为饲料添加剂广泛应用于畜牧业生产。然而，在使用中人们发现氯霉素具有毒性，CAP在动物性食品中的残留直接危害着人们的健康和生命安全。特别是人体接触后后果严重，能产生再生障碍性贫血、其他恶性血液病等毒副作用，对人类的健康构成巨大的潜在威胁。美国最早规定不允许在家禽饲养中使用CAP，出售的家禽必须做CAP残留检测。鉴于健康原因，联合国粮农组织(FAO)、世界卫生组织(WHO)和许多国家规定禁止将CAP用于食品动物，中国同样已经禁止使用CAP，并且规定CAP的检测限量值：牛奶0.25ng/mL、肉类1.5ng/g、尿液1.0ng/mL、血清\n0.5ng/mL、蜂蜜(快检)1.5ng/g、蜂蜜(C18柱)0.1ng/g，并且我国农牧发[2001]24号文同样规定，在马肝、鸡肉、真鲷肌肉中的氯霉素残留限量为不得检出；欧盟的进口食品卫生标准同样规定氯霉素含量标准为不得检出；目前美国食品及药物管理局(FDA)和芬兰进一步规定CAP的最高残留限量(RML)为0，即不得检出，但是各种CAP的检测方法都有检测极限，不能达到0。 \n[0004] 目前CAP的检测方法很多。其中气相色谱法和液相色谱法，灵敏度高，其检测极限可以达到0.7ng/mL，但样品前处理过程相对复杂，仪器化程度高且价格昂贵，分析速度慢，不适合在基层推广使用及大量样本筛选；微生物法经济、简单，但灵敏度有限，且缺乏特异性；放射免疫分析法适用于肉蛋奶，检测限约为200ng/kg，但具有同位素半衰期短，存在放射性污染等缺点。而ELISA方法具有灵敏度高，特异性强，仪器设备要求低和样本前处理相对简单等优点，适于现场监控和大量样本筛选。据目前文献报道，常规的ELISA检测极限是\n0.1ng/mL。但是，随着人们对健康状况要求的不断提高，CAP的最高残留限量(RML)同样也将会跟美国和芬兰一样达到0ng/mL。那么目前的各种检测体系都将不能达到这 个要求，因此需要一种检测灵敏度更高测定方法。 \n[0005] 免疫磁珠(Immunomagnctic beads，IMB)是免疫学和磁载体技术相结合而发展起来的一类新型材料。IMB是包被有单克隆抗体的磁性微球，可与含有相应抗原的靶物质特异性地结合形成新的复合物，通过外加磁场的作用，使磁球和上清快速分离，可以在短时间内得到浓缩、纯净的待测样品，缩短检测时间，提高检测效益和灵敏度。目前，MB-ELISA检测方法是免疫磁珠在免疫检测领域最主要的应用，其采用免疫磁珠配合常规ELISA方法主要用于免疫检测、细胞和微生物的分离和蛋白质、DNA、RNA以及mRNA等生物大分子纯化检测，其基本步骤为：一、用抗原和磁珠进行偶联，制备免疫磁珠。二、将检测样品和第一种抗体(简称一抗)按一定比例混合，然后在其中加入适量体积的第一步制备出的免疫磁珠，使免疫磁珠上的抗原和样品中的抗原竞争结合一抗，然后通过磁性分离，除去上清。三、加入一定体积的过氧化物酶标记过的二抗，然后放在37℃条件下温育1小时，再通过磁性分离，除去上清。四、加底物显色15分钟，把显色液移入96孔ELISA反应板中，放入酶标仪中读数。 \n[0006] 这种方法对大分子抗原具有良好的检测效果，但是对有关氯霉素等小分子的检测实例尚未见报道。经过实验表明，用MB-ELISA检测方法检测灵敏度要比一般的直接竞争抑制ELISA方法高，但是检测的重复性不好，稳定性差，并不适用于检测氯霉素等小分子。 发明内容\n[0007] 针对上述现状，本发明的目的在于提供一种与常规酶联免疫检测方法相比，检测CAP样品灵敏度更高，并且重复性好，检测数据的稳定性高的氯霉素检测方法。 [0008] 为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种磁珠标记的氯霉素免疫检测体系，其特征在于，制备特异性强的抗-CAP单克隆抗体，然后将其与磁珠偶联进一步制备出包被有抗-CAP单克隆抗体的免疫磁珠；利用制备出的免疫磁珠吸附待检CAP样品中的CAP分子，再通过磁性分离技术去除上清，然后用挥发性有机溶剂抽提免疫磁珠中吸附的CAP分子，并将其配备成浓缩的CAP样品，最后用直接竞争抑制ELISA方法对浓缩的CAP样品进行检测得出结果。 \n[0009] 该方法利用磁性分离技术将低于常规检测法检测范围的低浓度待检CAP样 品中CAP分子富集后再配备成高浓度的CAP样品。然后再用直接竞争ELISA检测方法对其进行检测，有效的提高了对CAP含量的检测灵敏度，并且检测效益非常好。这比直接采用直接竞争抑制ELISA方法所能检测样品浓度的最低极限0.1ng/mL高50倍左右。 \n[0010] 采用本发明的方法检测样品中CAP含量的具体步骤包括： \n[0011] 第一步，免疫磁珠的制备 \n[0012] 将准备好的抗-CAP单克隆抗体和xMag异硫氰酸根末端磁珠，经过磁珠活化→抗体偶联→磁珠洗涤→磁珠封闭→磁珠保存等步骤制备出包被有特异性强的抗-CAP单克隆抗体的免疫磁珠； \n[0013] 第二步，免疫磁珠吸附样品中的CAP \n[0014] 按比例将第一步中制备的免疫磁珠加入到待检样品中，温育后利用磁性分离技术去除上清，获得吸附有CAP分子的免疫磁珠复合物；在该步骤中，所述温育过程适宜在\n37℃180rpm的恒温摇床内进行，温育时间以40min为宜。 \n[0015] 第三步，免疫磁珠所吸附的CAP的提取 \n[0016] 利用挥发性有机溶剂对第二步中去除上清后的免疫磁珠复合物进行CAP分子抽提，然后将抽提液放入水浴中挥发，直到无有机溶剂气味为止；在该步骤中，所述挥发性有机溶剂为乙酸乙酯，对免疫磁珠复合物进行CAP分子抽提的次数为两次，每次间隔时间可为5min。 \n[0017] 第四步，用110ul的PBS溶液溶解第三步中有机溶剂挥发后的析出物，制备浓缩的CAP样品； \n[0018] 第五步，用直接竞争ELISA检测方法检测第四步中得到的浓缩待检样品； [0019] 第六步，根据CAP标准曲线计算出样品中的CAP含量； \n[0020] 本发明的突出优点是：磁性免疫载体特异性好，固液经磁力作用能较容易分离，洗脱条件较环保无毒害作用，对于低于检测极限的氯霉素样品通过免疫磁珠富集浓缩后检测，从而间接改变检测极限，提高检测的灵敏度，避免漏检。 \n附图说明\n[0021] 图1是CAP标准曲线。 \n[0022] 图2是偶联抗体的扫描曲线。图中曲线pre是偶联前抗体的检测曲线；曲线 post是偶联上清的检测曲线；曲线wash1是第一次洗涤液的检测曲线；曲线wash2是第二次洗涤液的检测曲线。 \n具体实施方式\n[0023] 实验(一) \n[0024] 一、制做CAP的ELISA标准曲线 \n[0025] 配制CAP标准品，从50ng/mL开始倍比稀释，选取浓度分别为50ng/mL、12.5ng/mL、\n3.125ng/mL、0.781ng/mL、0.195ng/mL、0.097ng/mL、0.049ng/mL的样品，设置PBS空白对照，做出标准曲线，如图1所示。 \n[0026] 二、磁珠偶联抗-CAP单克隆抗体，制备免疫磁珠 \n[0027] 该过程参照陕西北美基因股份有限公司的xMag异硫氰酸根末端磁珠抗体偶联试剂盒说明书，即把磁珠和抗CAP-IgG偶联。具体步骤如下： \n[0028] 第一步，磁珠的预处理：将1ml的xMagTM异硫氰酸根末端磁珠溶液经磁性分离分离后去除上清，加入500uL偶联液BP，对磁珠进行预处理。再经磁性分离后去除上清。再重复预处理1次。 \n[0029] 第二步，磁珠偶联：将适量的抗体溶解于适量的偶联液BP中，配制成浓度为\n0.3-1.0ug/mL的抗体溶液，取1mL抗体溶液加入第一步处理后的磁珠中，剩余溶液标记为pre，留作偶联效率检测用。将加有抗体溶液的磁珠置于37℃、180rpm的恒温摇床上振荡反应。然后经磁性分离后去除上清，并液标记为post，留作偶联效率检测用。 [0030] 第三步，清洗：在第二步中去除上清后的磁珠加入500uL清洗液WP，轻摇重悬磁粒，经磁性分离后，取出上清液标记为wash1；重复清洗操作1次，取出上清液标记为wash2，留作偶联效率检测用。 \n[0031] 第四步，封闭：在清洗后的磁珠中加入3mL封闭液，置于37摄氏度，180rpm摇床中反应2h。再经磁性分离后，去除上清。 \n[0032] 第五步，清洗：在磁珠中加入1mL清洗液WP，轻摇重悬磁珠，再经磁性分离后，去除上清。重复清洗操作3次。 \n[0033] 第六步，保存：在磁珠中加入1mL保存液SP，轻摇重悬微粒，4℃保存备用。 [0034] 在上述过程中，应用紫外-可见分光光度计，以偶联液BP调零，分别测定 pre、post样品在280nm处的吸光值；以清洗液WP调零，分别测定wash1、wash2样品在280nm处的吸光值，并作记录，如表1所示。 \n[0035] 表1偶联抗体浓度检测数据 \n[0036] \n[0037] 参照表1测得数值并按照以下公式：偶联效率＝[OD280(pre)-OD280(post)-OD28\n0(wash1)-OD280(wash2)]/OD280(pre)*100％，计算出蛋白/抗体在xMagTM异硫氰酸根末端磁性微粒表面的偶联效率为43.7％。 \n[0038] 三、免疫磁珠富集分离CAP \n[0039] 配制0.1ng/mL的CAP标准品，取6只50mL的离心管，在每个50mL的离心管中加入29400uL0.1M/L的PBS缓冲液，其中5只离心管中加入600uLo.1ng/mL的CAP标准品，混合均匀，即得到0.002ng/mL的CAP溶液。同时设置一管空白对照，即在第6只离心管中加入600uL的PBS缓冲液。 \n[0040] 6只50mL离心管中分别加入160uL偶联好的免疫磁珠，放在37℃180rpm的恒温摇床内温育40min，磁性分离，吸出上清保存以备进一步检测。用PBST洗涤免疫磁珠三次，\n3min/次。用乙酸乙酯对免疫磁珠抽提两次，5min/次，利用磁性分离技术使抽提液和磁珠分离，分别对应移入小离心管中，然后放在70℃水浴中挥发，直至无乙酸乙酯气味。 [0041] 四、直接竞争抑制ELISA检测磁珠富集样品CAP \n[0042] 每管中加入110uL的0.1M/L的PBS缓冲液，同时加入等体积的酶标抗CAP-IgG，放在37℃恒温箱中温育20min。把混合液转移到封闭好的酶标板中(预先按1∶6000倍包被BSA-CAP)，100uL/孔，放在37℃恒温箱中温育40min。用PBST洗板三次，5min/次。加入\n100uL/孔TMB，放在37℃恒温箱中显色15min。加入50uL/孔2M的浓硫酸终止，放入酶标仪上读数。读出的数据通过标准曲线公式计算，得到数据如表2所示。 \n[0043] 表2磁珠分离富集的CAP检测数据 \n[0044] \n[0045] 五、磁珠吸附后上清中CAP的ELISA检测 \n[0046] 样品冻干浓缩CAP：吸取上清20mL于玻璃平皿中，放在冻干机(购自美国LABCONCO公司)中冻干，用乙酸乙酯抽提平皿中冻干形成的盐类结晶中的CAP，抽提液放入\n70℃水浴中挥发，直至无乙酸乙酯气味。 \n[0047] 直接竞争抑制ELISA检测冻干浓缩样品CAP，其步骤同[3]中直接竞争抑制ELISA检测磁珠富集样品CAP的操作。读出的数据通过标准曲线公式计算，得到数据如表3所示。 [0048] 表3磁珠吸附后上清中CAP检测数据 \n[0049] \n[0050] 通过表2和表3的数据，可以计算出通过磁珠标记的氯霉素免疫检测体系检测出样品中总的氯霉素含量，而实际的氯霉素添加量为0.06ng，因此可以计算得出检测的误差值，如表4。 \n[0051] 表4CAP检测量和添加量间的误差分析 \n[0052] \n[0053] 通过表4可以得出，磁珠标记的氯霉素免疫检测体系对检测氯霉素这一类小分子抗原具有良好的检测效果，检测稳定性好。 \n[0054] 六、实验结论 \n[0055] 在本发明中，磁珠的作用是吸附样品中的CAP分子，进一步通过磁性分离技术分离出CAP样品中的CAP分子，挥发性有机溶剂作用是将CAP分子从免疫磁珠上抽提出来，然后水浴加热去除抽提液中的有机溶剂乙酸乙酯，此时抽提液中的微量CAP并没有随有机溶剂挥发掉，而是滞留在离心管中，在该离心管中加入110uL的0.01M PBS溶解CAP，制成浓缩后的待检CAP样品。最后通过直接竞争抑制ELISA检测浓缩后的CAP样品，推算出待检CAP样品中的CAP含量。此法实现了对超出常规检测方法检测极限的CAP样品进行检测，有效提高了检测灵敏度，经前面实验数据可知，本发明方法的检测极限可达到0.002ng/mL。\n并且，相对于MB-ELISA方法，此法避免了在免疫磁珠上进行检测反应，有效排除了其不稳定因素，稳定性好。