抗三种有机磷农药的单克隆抗体及其应用\n技术领域\n[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及抗三种有机磷农药的单克隆抗体及其应用。\n背景技术\n[0002] 近20年来，随着农业生产的急速发展，有机磷农药的产量和使用量不断上升。大量使用，甚至不正当使用有机磷农药，使得有机磷农药残留问题日益突出。这不仅使环境安全，人们身体健康受有机磷农药威胁的概率增大，而且农药最高残留限量也成为世界各国针对中国农产品进出口的重要技术性贸易壁垒。因此，发展有机磷农药残留快速、简便、灵敏的检测方法对环境、食品安全，人们身体健康以及促进社会主义社会经济发展有着举足轻重的作用。\n[0003] 目前，有机磷农药的残留检测多采用薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法等方法。这些方法结果可靠，灵敏度高，已有相关的技术标准可供参考。但由于需要昂贵的仪器、专门的操作人员，以及样品前处理复杂、成本高、时间长，因此不能更好地满足快速简便的现场检测要求。\n[0004] 有机磷农药的免疫检测方法具有快速、廉价、简便、特异的优点，可便携而进行现场监测。克服了传统检测方法的缺点。通过化学合成有机磷农药的半抗原，与载体蛋白偶联获得完全抗原，制备针对环境和农产品中有机磷农药水胺硫磷、甲基异柳磷和乙基异柳磷的单克隆抗体，建立上述三种有机磷农药免疫学检测方法。该方法的完成，将解决针对高毒有机磷农药水胺硫磷、甲基异柳磷、乙基异柳磷快速免疫检测方法中半抗原合成、人工抗原合成、单克隆抗体制备等关键技术，并建立上述三种农药的免疫快速检测体系。该专利不仅为食品安全检测，而且为我国农产品等的出入境检测，环境监测部门的水域监测提供了一种新的技术手段和检测方法。对我国农产品的可持续健康发展、解决食品安全问题具有重要的现实意义和重要的社会、经济价值。\n发明内容\n[0005] 本发明的目的是提供针现有技术的上述不足，提供一种抗三种有机磷农药的单克隆抗体。\n[0006] 本发明的另一目的是提供该单克隆抗体的应用。\n[0007] 本发明的目的可通过如下技术方案实现：\n[0008] 分泌抗三种有机磷农药的单克隆抗体的杂交瘤细胞FQ-6E，于2013年8月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2013105，所述的三种有机磷农药为水胺硫磷、甲基异柳磷和乙基异柳磷。\n[0009] 一种抗水胺硫磷、甲基异柳磷和乙基异柳磷的单克隆抗体，由保藏编号为CCTCC NO：C2013105的杂交瘤细胞FQ-6E分泌。\n[0010] 本发明所述的水胺硫磷等三种有机磷农药单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：\n[0011] （1）针对水胺硫磷、甲基异柳磷和乙基异柳磷的公共结构化学合成人工半抗原，合成路线如下：\n[0012]\n[0013] （2）人工抗原制备：\n[0014] 采用活泼酯法将所述的人工半抗原分别偶联到载体蛋白牛血清蛋白BSA和卵清蛋白OVA上，分别得到免疫原H1-BSA和包被原H1-OVA；\n[0015] （3）小鼠免疫：\n[0016] 将制备好的H1-BSA作为免疫原免疫Balb/C鼠，鼠尾静脉采血用间接非竞争ELISA法检测血清抗体的特异性：以空白对照调零；以未经免疫小鼠血清作为阴性对照，若待测孔OD450值大于或等于2.1倍阴性孔值定为阳性；\n[0017] （4）细胞融合：\n[0018] 通过阳性值筛选Balb/C鼠，阳性值高的Balb/C鼠直接用H1-BSA免疫，三天后取脾脏，脾细胞和对数生长期的Sp2/0骨髓瘤细胞通过杂交瘤技术制备杂交瘤细胞；\n[0019] （5）杂交瘤细胞筛选：\n[0020] 用1000倍稀释的包被原H1-OVA包被酶标板，1%明胶封闭，取杂交瘤细胞的培养上清，采用非竞争间接ELISA法初步进行筛选，其中一抗为杂交瘤细胞上清，以免疫小鼠的血清为阳性对照，以骨髓瘤细胞上清为阴性对照，选取呈阳性的细胞孔，细胞上清留存用于下一步检测，呈阴性的孔若重复一次后仍为阴性则可舍弃；对于上一步呈阳性的细胞孔则采用间接竞争ELISA法进行进一步的确认，对农药水胺硫磷出现明显的竞争性抑制反应的孔即为产生抗有机磷类农药水胺硫磷抗体的阳性杂交瘤细胞，送交中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：C2013105；保藏编号为CCTCC NO：C2013105的杂交瘤细胞通过有限稀释法进行亚克隆，分泌的上清即为所制备的单克隆抗体。\n[0021] 所述的人工半抗原优选通过以下方法制备：\n[0022] ①O-甲基-O-(2-异丙氧基羰基苯基)硫代磷酰氯的合成\n[0023] O-甲基硫代磷酰二氯、K2CO3和乙腈搅拌均匀，冷却至10℃以下，滴加含水杨酸异丙酯的乙腈溶液，20℃～28℃下继续搅拌30～45min，减压蒸去溶剂，柱层析分离，得无色液体产物O-甲基-O-(2-异丙氧基羰基苯基)硫代磷酰氯；其中O-甲基硫代磷酰二氯：K2CO3：乙腈=（18～20）mol：（35～40）mol：1L；含水杨酸异丙酯的乙腈溶液中水杨酸异丙酯的浓度为22～\n28mol/L，水杨酸异丙酯与K2CO3的摩尔比为1：2～4；\n[0024] ②人工半抗原：O-甲基-O-(2-异丙氧基羰基苯基)-N-(3-羧基丙基)硫代磷酰胺的合成\n[0025] O-甲基-O-(2-异丙氧基羰基苯基)硫代磷酰氯和甲醇按照1mol：（1.4～1.5）L混合，冰水浴冷却，滴加由KOH、4-氨基丁酸和甲醇按照（3.2～3.5）mol：（1.5～1.6）mol：1L构成的混合溶液，20℃～28℃下继续搅拌10～15min，反应混合物用1N HCl-氯仿萃取，萃取液经无水硫酸钠干燥后，减压蒸去溶剂，柱层析分离，得无色液体产物O-甲基-O-(2-异丙氧基羰基苯基)硫代磷酰氯；其中O-甲基-O-(2-异丙氧基羰基苯基)硫代磷酰氯与KOH的摩尔比为1:2.5～3.0。\n[0026] 本发明所述的杂交瘤细胞FQ-6E在检测水胺硫磷、甲基异柳磷和/或乙基异柳磷中的应用。\n[0027] 本发明所述的单克隆抗体在检测水胺硫磷、甲基异柳磷和/或乙基异柳磷中的应用。\n[0028] 一种水胺硫磷、甲基异柳磷和乙基异柳磷半抗原，结构如下所示：\n[0029]\n[0030] 本发明所述的半抗原在制备抗水胺硫磷、甲基异柳磷和乙基异柳磷的单克隆抗体中的应用。\n[0031] 有益效果：\n[0032] 本抗体通过合成的H1‐BSA人工抗原免疫Blab/C，通过杂交瘤技术获得特异性识别水胺硫磷、甲基异柳磷和乙基异柳磷的单克隆抗体，在国内国际上属首创，该单抗可用于农产品和农业生产环境中水胺硫磷、甲基异柳磷和乙基异柳磷的高灵敏快速检测。\n[0033] 生物材料保藏信息\n[0034] 杂交瘤细胞株FQ-6E，2013年8月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：C2013105。\n具体实施方式\n[0035] 实施例1\n[0036] 1.1半抗原的合成：\n[0037]\n[0038] ①O-甲基-O-(2-异丙氧基羰基苯基)硫代磷酰氯的合成\n[0039] 在反应瓶中加入2.47g（15mmol）O-甲基硫代磷酰二氯，4.27g（30mmol）研细的K2CO3和0.8ml乙腈，搅拌，冷却至10℃以下，滴加含1.8g（10mmol）水杨酸异丙酯的乙腈（0.4ml）溶液，室温下继续搅拌30分钟，减压蒸去溶剂，硅胶柱层析分离（2:1正己烷-苯），得无色液体产物(a)2.85g（产率为92.5%）。\n[0040] ②O-甲基-O-(2-异丙氧基羰基苯基)-N-(3-羧基丙基)硫代磷酰胺(H1)的合成[0041] 在反应瓶中加入0.65g（2.1mmol）O-甲基-O-(2-异丙氧基羰基苯基)硫代磷酰氯(a)和3ml甲醇，冰水浴冷却，滴加由0.32g（5.72mmol）KOH、0.268g（2.6mmol）4-氨基丁酸和\n1.7ml甲醇构成的混合溶液，室温下继续搅拌10分钟，反应混合物用1N HCl-氯仿萃取，萃取液经无水硫酸钠干燥后，减压蒸去溶剂，硅胶柱层析分离（三氯甲烷/乙酸乙酯/氯氟吡氧乙酸,65:35:1），得无色液体产物O-甲基-O-(2-异丙氧基羰基苯基)-N-(3-羧基丙基)硫代磷酰胺(H1)0.6g（产率为76%），(H1)就为我们需要的半抗原。\n[0042] 上述两种生成物的核磁共振图谱数据如下：\n[0043] （a）1H NMR(300M Hz,CDCl3)ppm:7.92(1H,m ArH),7.53(1H,m ArH),7.43(1H,m ArH),7.31(1H,m ArH),5.24(1H,hept,J=6.3Hz,CH(CH3)2),4.03(3H,d,J=16.5Hz,CH3OP),\n1.37(6H,d,J=6.3Hz,CH(CH3)2).\n[0044] H1:1H NMR(300M Hz,CDCl3)ppm:7.79(1H,m,ArH),7.48(2H,m,ArH),7.18(1H,m,ArH),5.21(1H,hept,J=6.3Hz,CH(CH3)2),4.02(1H,m,NH),3.77(3H,d,J=14.1Hz,CH3OP),\n3.12(2H,m,NHCH2)2.33(2H,t,J=7.5Hz,CH2COOH),1.76(2H,m,CH2CH2CH2),1.35(6H,d,J=\n6.3Hz,CH(CH3)2)1.2人工抗原制备：\n[0045] 采用活泼酯法（DCC/NHS）将半抗原分别偶联到载体蛋白牛血清蛋白（BSA）和卵清蛋白（OVA）上，操作如下：称取半抗原0.2mmol（约0.075g）和NHS0.2mmol（约0.023g），用400μlDMF溶解于反应装置中；再称取0.24mmolDCC（约0.0495g），用600μlDMF溶解，将DCC/DMF滴加到上述反应装置中。反应在磁力搅拌器下，室内温度进行7小时（过夜）。\n[0046] 将过夜的反应终液置4℃冰箱冷却2个小时以上，经12000rpm离心5分钟，取上清液，即活泼酯，将此活泼酯液平均分成两份，分别滴加到5ml6mg/ml的BSA溶液和5ml6mg/ml的OVA溶液（滴加过程要十分缓慢）。反应缓冲液为0.02mol/L pH8.0的磷酸缓冲液（PB液）。\n反应在磁力搅拌器下室内温度进行4小时（从加样结束开始计时）。将反应终液置透析袋内，于0.02mol/L pH6.8的PB液中4℃搅拌透析，每4～8小时换一次透析液，共透析60小时。透析结束后，透析袋中的白色乳状液即分别为免疫原H1-BSA和包被原H1-OVA。将免疫原和包被原分别分装于若干1.5ml离心管中，于-20℃冰箱保存。\n[0047] 1.3小鼠免疫：\n[0048] 将制备好的H1-BSA作为免疫原免疫6-8周龄雌性Balb/C鼠，每次每只小鼠的免疫原用量100μg，共免疫四次，第一次免疫采用由等体积的免疫原和弗氏完全佐剂乳化，腹腔注射。和第一次免疫间隔三周后，第二次至第四次每次免疫间隔2周，采用等体积的免疫原和弗氏不完全佐剂乳化；\n[0049] 从第三次开始，每次免疫后一周，鼠尾静脉采血用间接非竞争ELISA法检测血清抗体的特异性：以空白对照调零；以未经免疫小鼠血清作为阴性对照，若待测孔OD450值大于或等于2.1倍阴性孔值定为阳性。\n[0050] 间接非竞争ELISA基本操作流程如下：\n[0051] （1）包被：用包被缓冲液（0.05mol/L，pH9.6）稀释包被抗原至合适浓度，加入酶标板，每孔50μl，37℃温箱中孵育2h。\n[0052] （2）洗板：倒去残液，在洗板机上用洗涤液PBST洗涤5次，吸水纸拍干。\n[0053] （3）封闭：每孔加1%明胶110μl，37℃温箱中孵育1.5h。\n[0054] （4）洗板：倒去残液，在洗板机上用洗涤液PBST洗涤5次，吸水纸拍干。\n[0055] （5）加入一抗（待检小鼠抗血清或杂交瘤细胞培养液）：将待检小鼠抗血清经PBST稀释成一系列合适的梯度浓度，加入酶标板，每孔50μl，37℃温箱中孵育0.5h。\n[0056] （6）洗板：倒去残液，在洗板机上用洗涤液PBST洗涤5次，吸水纸拍干。\n[0057] （7）加酶标抗体：把辣根过氧化物酶-羊抗小鼠IgG用PBST溶液稀释20000倍，每孔\n50μl，37℃温箱中孵育0.5h。\n[0058] （8）洗板：倒去残液，在洗板机上用洗涤液PBST洗涤5次，吸水纸拍干。\n[0059] （9）显色：每孔加入新鲜配制的显色液50μl，避光置37℃温箱10～15min。\n[0060] （10）终止：每孔加25μl2mol/L的H2SO4终止反应。\n[0061] （11）吸光度测定：酶标仪上测定450nm波长处的各孔吸光值。\n[0062] （12）结果判断：以空白对照调零，以未免疫小鼠的血清作为阴性对照，以待测孔OD450值大于或等于阴性孔的2.1倍定为阳性。\n[0063] 用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定小鼠的血清效价，从而可以掌握抗血清中抗体产生的水平。如小鼠效价不够高，就要继续免疫、检测，直到获得合适的抗体水平。\n[0064] 融合前，对所有免疫小鼠的血清效价进行一次检测，选取效价最高、竞争最好的小鼠用于细胞融合。\n[0065] 1.4细胞融合\n[0066] 上一步阳性值最高的Balb/C鼠直接用H1-BSA免疫，三天后取脾脏，脾细胞和对数生长期的Sp2/0骨髓瘤细胞通过杂交瘤技术制备杂交瘤细胞，37℃,5%二氧化碳培养箱培养\n10-12天后，通过检测融合孔上清筛选杂交瘤细胞；\n[0067] 1.5杂交瘤筛选：\n[0068] 用1000倍稀释的包被原H1-OVA包被酶标板，1%明胶封闭，取杂交瘤细胞的培养上清，采用非竞争间接ELISA法初步进行筛选（方法如上所述，其中一抗为杂交瘤细胞上清，以免疫小鼠的血清为阳性对照，以骨髓瘤细胞上清为阴性对照），选取呈阳性的细胞孔，细胞上清留存用于下一步检测，呈阴性的孔若重复一次后仍为阴性则可舍弃。\n[0069] 对于上一步呈阳性的细胞孔则采用间接竞争ELISA法进行进一步的确认，间接竞争ELISA的基本操作流程如下：\n[0070] （1）包被：用包被缓冲液（0.05mol/L，pH9.6）稀释包被抗原至合适浓度，加入酶标板，每孔50μl，37℃温箱中孵育2h。\n[0071] （2）洗板：倒去残液，在洗板机上用洗涤液PBST洗涤5次，吸水纸拍干。\n[0072] （3）封闭：每孔加入1%明胶110μl，37℃温箱中孵育1.5h。\n[0073] （4）洗板：倒去残液，在洗板机上用洗涤液PBST洗涤5次，吸水纸拍干。\n[0074] （5）加入一抗：杂交瘤细胞培养液上清经PBST稀释成合适浓度，并在其中加入不同浓度的水胺硫磷、甲基异柳磷和乙基异柳磷，混合均匀后加入酶标板，每孔50μl，37℃温箱中孵育0.5h。\n[0075] （6）洗板：倒去残液，在洗板机上用洗涤液PBST洗涤5次，吸水纸拍干。\n[0076] （7）加酶标抗体：加入用PBST溶液稀释20000倍的辣根过氧化物酶-羊抗小鼠IgG，[0077] 每孔50μl，37℃温箱中孵育0.5h。\n[0078] （8）洗板：倒去残液，在洗板机上用洗涤液PBST洗涤5次，吸水纸拍干。\n[0079] （9）显色：每孔加入新鲜配制的显色液50μl，避光置37℃温箱10～15min。\n[0080] （10）终止：每孔加25μl2mol/L的H2SO4终止反应。\n[0081] （11）吸光度测定：酶标仪上测定450nm波长处的各孔吸光值。\n[0082] 对农药水胺硫磷出现明显的竞争性抑制反应的孔即为产生抗有机磷农药水胺硫磷抗体的阳性孔，阳性孔的杂交瘤通过有限稀释法进行亚克隆，阳性孔分泌的上清即为所制备的单克隆抗体。阳性孔的杂交瘤细胞株FQ-6E于2013年8月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2013105。\n[0083] 实施例2\n[0084] 将保藏编号为CCTCC NO：C2013105的杂交瘤细胞FQ-6E冻存于液氮罐中一周、半个月、一个月、半年复苏后，均能稳定分泌抗体，而且效价未见明显下降，说明该杂交瘤细胞具有良好的稳定性。\n[0085] 实施例3水胺硫磷、甲基异柳磷、乙基异柳磷标准样品的检测\n[0086] 采用间接竞争ELISA方法，对检测曲线进行初步探索。方法如下：\n[0087] （1）包被：用包被缓冲液（0.05mol/L，pH9.6）稀释包被抗原至合适浓度，加入酶标[0088] 板，每孔50μl，37℃温箱中孵育2h。\n[0089] （2）洗板：倒去残液，在洗板机上用洗涤液PBST洗涤5次，吸水纸拍干。\n[0090] （3）封闭：每孔加入1%明胶110μl，37℃温箱中孵育1.5h。\n[0091] （4）洗板：倒去残液，在洗板机上用洗涤液PBST洗涤5次，吸水纸拍干。\n[0092] （5）加入一抗：杂交瘤细胞培养液上清经PBST稀释成合适浓度，并在其中加入不同种类不同浓度的农药，混合均匀后加入酶标板，每孔50μl，37℃温箱中孵育0.5h。\n[0093] （6）洗板：倒去残液，在洗板机上用洗涤液PBST洗涤5次，吸水纸拍干。\n[0094] （7）加酶标抗体：加入用PBST溶液稀释20000倍的辣根过氧化物酶-羊抗小鼠IgG，
