一种促生长合生元菌液的制备方法及应用

1.一种促生长合生元菌液的制备方法，其特征是包括以下步骤：
（1）将MRS培养基初始pH值控制在6.4 6.6之间，并经高压灭菌、冷却、静置；
~
（2）将菊糖所占质量比例25 35%、黄芪多糖所占质量比例65 75%的菊糖-黄芪多糖复合~ ~
物以5 10g/L的浓度加入到MRS培养基中；然后，将MRS培养基经微孔滤膜过滤，分离，收集滤~
液；
（3）在无菌操作台下，将活化后的干酪乳杆菌按体积比1% 2%的接种量接种在上述含有~
菊糖-黄芪多糖复合物的MRS培养基的滤液中，分装，封口；
（4）将上述滤液以状态静置放置在37℃的厌氧培养箱中培养，培养时间为24 26h；配养~
后的黄色菌液，即为干酪乳杆菌-菊糖-黄芪多糖合生元菌液。
2.根据权利要求1所述的促生长合生元菌液的制备方法，其特征在于：MRS培养基初始pH值为6.5。
3.根据权利要求1所述的促生长合生元菌液的制备方法，其特征在于：菊糖-黄芪多糖复合物加入MRS培养基中的浓度为9g/L，其中菊糖-黄芪多糖复合物中菊糖和黄芪多糖质量比例为3:7。
4.根据权利要求1所述的促生长合生元菌液的制备方法，其特征在于：微孔滤膜孔径为
0.22μm。
5.一种如权利要求1所述的促生长合生元菌液制备方法所得产品的应用，其特征是：将干酪乳杆菌-菊糖-黄芪多糖合生元菌液添加在全价饲料中，添加量为50 100mL/kg，现喂现~
拌。

一种促生长合生元菌液的制备方法及应用\n技术领域\n[0001] 本发明涉及一种动物添加剂，特别是一种促生长合生元的制备方法及应用，属于微生态调节剂。具体地说是干酪乳杆菌-菊糖-黄芪多糖合生元菌液的制备方法及应用。\n背景技术\n[0002] 动物在遭受疾病、断奶等外在或内在各种因素时，常造成免疫功能下降、肠道微生物菌群结构发生变化（有益菌群数量会减少，有害菌群数量增多），从而出现抵抗力低、腹泻，最终导致生产性能下降。抗生素及化学添加剂的使用在一段时间内确实起到了明显的促生长效应，但其药物残留、耐药性等问题随之而来。现如今，食品安全越来越受到消费者的重视，抗生素以及一些高残留的化学添加剂已经淡出规模养殖产业的视野，合生元作为新型绿色、无污染无残留的新型添加剂随即而生并迅速推广，倍受养殖者青睐。\n[0003] 合生元是一种由益生菌（如乳酸菌、芽孢杆菌、光合细菌等）和益生元（如低聚糖、微藻等）按照一定的工艺配制而成的微生态活性物质。其作用的主要优势是，能促进有益微生物在肠道内的定殖与增殖，减少病源微生物在体内的数量，提高机体免疫力，促进营养物质的消化吸收。合生元能同时发挥益生菌、益生元自身固有的优质效应以及二者间的协同作用，以增强肠道的消化和抗菌能力，进而提高动物机体的生产性能。\n[0004] 目前，合生元产品制备方法都是采用常规方法，即一种益生菌和一种益生元按照质量比直接组合而成，而采用两种益生元和益生菌组成合生元的制备方法还没有相应的研发。\n[0005] 干酪乳杆菌是一类有益于机体健康的活性微生物食品原料，其与嗜酸乳杆菌和双歧杆菌并称“健康三益菌”，其多用于乳制品的发酵剂及辅助发酵剂。但目前我国对干酪乳杆菌的研究还不多，而干酪乳杆菌作为益生菌与益生元组成合生元的制备方法和应用则研究更少。\n发明内容\n[0006] 本发明的目的是针对上述问题，在考虑益生菌与益生元配合效果的基础上，提供一种由干酪乳杆菌和两种功能性糖组成的合生元，即干酪乳杆菌-菊糖-黄芪多糖合生元菌液的制备和应用方法。\n[0007] 本发明原理：干酪乳杆菌是一种兼性厌氧型微生物，其发酵分解代谢多种糖产生的乳酸和其他有机酸对病原微生物（如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌以及沙门氏菌等）有较强的抑制作用。与其他益生菌相比，干酪乳杆菌能够耐受有机体的防御机制，包括口腔酶、胃酸和小肠的胆汁酸等，所以干酪乳杆菌进入人体后可以在肠道内大量存活。但单独的干酪乳杆菌菌体不能起到有效的抗菌作用，只有附植肠道粘膜，在一些益生元作用下增殖并产生代谢产物（主要是乳酸），才能有效的阻止肠道有害菌的附着和生长繁殖。\n[0008] 菊糖是一种由多个果糖通过β-2,1糖苷键相连接而构成的多糖聚合物，常见于蒲公英、草木香的根部，其水解后能产生大量的葡萄糖和果糖。菊糖作为益生元，不易被胃消化是其最显著的特征之一，因此在动物日粮中添加菊糖几乎不能被胃和小肠内的消化酶分解，其顺利进入大肠，为干酪乳杆菌提高营养，以促进其增殖，因此菊糖常被用作益生菌的增殖剂。菊糖与低聚果糖一样能调节机体肠道保持健康的状态。黄芪多糖是中药黄芪的主要成分，其主要成分均为多糖，具有较高的免疫活性，常常被作为免疫促进剂应用在动物生产中。黄芪多糖代谢产物为短链脂肪酸，可降低肠道pH值。低的pH值一方面可以刺激肠道蠕动，从而降低致病菌的数量，另一方酸性环境有利于乳酸菌等有益菌的增殖，同时有益菌在增殖过程中产生过氧化氢、有机酸等具有抗菌活性的代谢产物，能够抑制治病类有害菌和外源性病菌的生存。\n[0009] 菊糖和黄芪多糖可以为肠道中的干酪乳杆菌提供营养并产生酸环境促进有益菌的增殖，三者相辅相成，能够极大地发挥益生菌和益生元的互作作用。\n[0010] 本发明提供的促生长合生元菌液的制备方法，其特征是包括以下步骤：\n[0011] 1、将MRS培养基初始pH值控制在6.4 6.6之间，并经高压灭菌、冷却、静置；\n~\n[0012] 2、将菊糖所占质量比例25 35%、黄芪多糖所占质量比例65 75%的菊糖-黄芪多糖~ ~\n复合物以5 10g/L的浓度加入到MRS培养基中；然后，将MRS培养基经微孔滤膜过滤，分离，收~\n集滤液；\n[0013] 3、在无菌操作台下，将活化后的干酪乳杆菌按体积比1% 2%的接种量接种在上述~\n含有菊糖-黄芪多糖复合物的MRS培养基的滤液中，分装，封口；\n[0014] 4、将上述滤液以状态静置放置在37℃的厌氧培养箱中培养，培养时间为24 26h；\n~\n配养后的黄色菌液，即为干酪乳杆菌-菊糖-黄芪多糖合生元菌液。\n[0015] 本发明的积极效果：菊糖和黄芪多糖能为肠道中的干酪乳杆菌提供营养并产生酸环境促进有益菌的增殖，三者相辅相成，能够极大地发挥益生菌和益生元的互作作用。对病原微生物有较强的抑制作用。能够耐受有机体的防御机制，干酪乳杆菌进入人体后可以在肠道内大量存活并起到有效的抗菌作用。能调节机体肠道保持健康的状态。具有较高的免疫活性，从而降低致病菌的数量，能够抑制治病类有害菌和外源性病菌的生存。\n附图说明\n[0016] 图1 是静置和摇床培养状态下干酪乳杆菌的生长曲线。\n[0017] 图2 是不同培养时间干酪乳杆菌-菊糖-黄芪多糖合生元的生长曲线。\n具体实施方式\n[0018] 实施例1：\n[0019] 用1 mol/L的NaOH调节MRS培养基pH值，使其pH值为6.6。高温高压灭菌20分钟。将\n100mLMRS液体培养基装入150mL锥形瓶中，加入1g菊糖和黄芪多糖复合物，其中菊糖0.3g，黄芪多糖0.7g，然后用孔径为0.22μm微孔滤膜过滤，分离滤液。在无菌操作台下，将活化后的干酪乳杆菌按体积比2%的接种量接种在上述含有菊糖-黄芪多糖复合物的MRS培养基的滤液中，分装后封口。将上述含有干酪乳杆菌的滤液静置放置于37 ℃厌氧培养箱中培养\n25h。配养后黄色菌液即为干酪乳杆菌-菊糖-黄芪多糖合生元菌液。\n[0020] 图1示出静置和摇床培养状态下干酪乳杆菌的生长曲线；图2示出不同培养时间干酪乳杆菌-菊糖-黄芪多糖合生元的生长曲线。\n[0021] 利用平板菌落计数法检测干酪乳杆菌-菊糖-黄多糖合生元菌液活菌数为2.83×\n109CFU/mL。\n[0022] 采用EDTA定钙法，测得合生元菌液乳酸含量为23.53mol/mL。\n[0023] 应用方法：干酪乳杆菌-菊糖-黄芪多糖合生元添加在全价饲料中，添加量为50~\n100mL/kg，现喂现拌。\n[0024] 贮藏方法：该干酪乳杆菌-菊糖-黄芪多糖合生元菌液应放在2 8℃冰箱中，并在24~\n小时内使用。\n[0025] 实施例2：\n[0026] 用1 mol/L的NaOH调节MRS培养基pH值，使其pH值为6.5。高温高压灭菌20分钟。将\n100mLMRS液体培养基装入150mL锥形瓶中，加入1g菊糖和黄芪多糖复合物，其中菊糖0.2g，黄芪多糖0.8g，然后用孔径为0.22μm微孔滤膜过滤，分离滤液。在无菌操作台下，将活化后的干酪乳杆菌按体积比2%的接种量接种在上述含有菊糖-黄芪多糖复合物的MRS培养基的滤液中，分装后封口。将上述含有干酪乳杆菌的滤液静置放置于37 ℃厌氧培养箱中培养\n24h。配养后黄色菌液，即为干酪乳杆菌-菊糖-黄芪多糖合生元菌液。\n[0027] 利用平板菌落计数法检测干酪乳杆菌-菊糖-黄芪多糖合生元菌液活菌数为活菌\n9\n数为2.78×10CFU/mL。\n[0028] 采用EDTA定钙法，测得合生元菌液乳酸含量为23.48mol/mL。\n[0029] 应用方法和贮藏方法同实施例1。\n[0030] 下面结合生化检测试验和饲养试验和微生物学检验，对本发明作进一步的描述：\n[0031] 本试验历时5个月，以不同合生元产生的乳酸含量，以及试验动物生长性能，腹泻率，血清指标以及营养物质消化率等指标，来评定本合生元的使用效果。\n[0032] 一、生化检测试验\n[0033] 在无菌操作台下，将2%的干酪乳杆菌分别接种在含有浓度均为10g/L的菊糖或黄芪多糖或菊糖-黄芪多糖复合物（菊糖：黄芪多糖=3：7）的MRS培养基中，静置于厌氧培养箱中培养24小时。每组10个重复，每6h在厌氧培养箱中抽取菌液。采用EDTA定钙法，经离心、调节pH、滴定，测量合生元菌液中乳酸的含量。\n[0034] 表1 不同合生元组的乳酸含量的测定mol/mL\n[0035]\n组别 6h 12h 24h\n干酪乳杆菌-菊糖合生元 7.29±0.58* 13.85±1.25* 20.32±0.26**\n* *\n干酪乳杆菌-黄芪多糖合生元 7.58±0.63 13.98±0.97 21.44±0.08\n干酪乳杆菌-菊糖-黄芪多糖合生元 8.33±0.38 14.13±0.54 22.13±0.12\n[0036] 注：与干酪乳杆菌-菊糖-黄芪多糖合生元比较，*表示差异显著（P<0.05）；**表示差异极显著（P<0.01）。\n[0037] 干酪乳杆菌代谢产物主要是乳酸。乳酸能穿过致病菌的细胞膜并向其内部扩散、解离，产生大量的H+和RCOO-，从而破环了致病菌菌体内部的pH，并导致细胞质中的部分酶失活，从而抑制了致病菌的生长。研究显示，单独的干酪乳杆菌菌体不能起到有效的抑菌作用，只有在益生元的滋养下，才能发挥其作用。而干酪乳杆菌利用不同益生元存在差异，即干酪乳杆菌对益生元有选择作用。本试验结果显示（表1），干酪乳杆菌-菊糖-黄芪多糖合生元产生的乳酸含量在不同培养阶段均显著地高于干酪乳杆菌-菊糖合生元和干酪乳杆菌-黄芪多糖合生元。实验证明，与加入单一菊糖或黄芪多糖相比，菊糖和黄芪多糖的组合可以提高干酪乳杆菌发酵液中乳酸的产量，菊糖和黄芪多糖在菌体代谢中，产生了互补作用。\n[0038] 二、饲养试验\n[0039] （一）试验动物的选择\n[0040] 本试验选用60头21日龄断奶的“杜×长×大”三元杂交仔猪，平均体重为6.86±\n0.53kg。\n[0041] （二）基础日粮组成\n[0042] 本试验基础日粮以玉米-豆粕型为主的全价饲料。\n[0043] （三）动物分组与试验设计\n[0044] 试验动物饲养于同一栋舍内。仔猪随机分为3个处理，每个处理4个重复，每个重复\n5头猪。三个处理分别是：1）对照组，仔猪饲喂基础日粮；2）菌液组，仔猪饲喂基础日粮+\n100mL/kg干酪乳杆菌菌液；3）合生元组，仔猪饲喂基础日粮+100mL/kg干酪乳杆菌-菊糖-黄芪多糖合生元菌液。各组日粮均现喂现拌。预饲期3d，正式试验期为28d。\n[0045] （四）试验指标测定\n[0046] 结束后测定试验期的平均日增重、平均日采食量、料重比及腹泻率。试验第14天和\n28天每个处理组随机抽取体重相近的健康仔猪5头，从前腔静脉空腹采血5ml，静止30分钟后2500r/min离心10分钟，分离出血清，用于测定血清指标。同时收取仔猪粪便，立即用体积分数为10%的硫酸进行固氮，存放入-20℃冷冻保存，以不溶灰分为指示剂，测定粗蛋白、粗脂肪的表观消化率。\n[0047]\n[0048]\n[0049] （五）试验结果\n[0050] 表2 断奶仔猪生产性能的结果\n[0051]\n项目 对照组 菌液组 合生元组\n平均日增重（g） 235.7±20.66 250.4±22.43 294.3±16.35*\n平均日采食量（g） 371.3±43.62 417.4±55.32* 419.6±48.55*\n料重比 1.56±0.04 1.67±0.07 1.43±0.06*\n腹泻率(%) 15.86±0.31 9.66±0.55* 9.02±0.21*\n[0052] 注：与对照组比较，*P<0.05，差异显著；**P<0.01，差异极显著。下同[0053] 从表2可以看出，仔猪日粮中添加干酪乳杆菌-菊糖-黄芪多糖合生元显著提高了仔猪日增重、日采食量，显著降低了仔猪的料肉比和腹泻率。其改善生产性能的效果优于对照组和干酪乳杆菌菌液组。这是因为干酪乳杆菌-菊糖-黄芪多糖合生元代谢产生大量乳酸，乳酸的味道很浓郁，很好的改善了断奶仔猪饲粮的风味，从而日采食量有所提高；而且合生元产生的乳酸可降低胃肠道的pH，能缓解由于断奶导致的仔猪胃内pH的短暂升高，促进食欲的增加。此外，干酪乳杆菌作为益生菌，进入大肠，附植肠道粘膜上，由菊糖提供营养，由黄芪多糖分解代谢后降低肠道pH，提供适宜干酪乳杆菌的增殖的酸环境。两种糖共同作用，促进干酪乳杆菌大量增殖，使其与有害菌竞争营养，而降低有害菌的生长繁殖，降低PWD发生，促进仔猪生长发育。\n[0054] 表3 断奶仔猪血液生化指标的结果\n[0055]\n项目   对照组 菌液组 合生元组\n总蛋白（g/L） 14 133.6±12.92 135.51±13.56 136.84±11.09*\n  28 138.66±2.92 137.51±4.56 139.84±4.17\n尿素氮（mmol/L） 14 19.24±0.22 13.96±0.68** 12.78±1.28**\n  28 16.52±1.22 13.43±1.56* 10.18±0.58**\n碱性磷酸酶（IU/L） 14 27.27±0.4 32.83±3.59* 33.52±3.26*\n  28 32.44±4.89 32.64±2.62 32.27±3.40\n[0056] 血清总蛋白主要反映蛋白质在体内的合成情况，尿素氮含量主要反映氨基酸在体内的代谢情况，而碱性磷酸酶活性反映了仔猪体内蛋白质的合成速度。本试验结果显示（表\n3）合生元组显著提高血清总蛋白含量和碱性磷酸酶活性，显著降低了血清尿素氮含量，说明干酪乳杆菌-菊糖-黄芪多糖合生元提高了机体对氨基酸转运、消化和吸收，促进了动物蛋白质合成。这是因为干酪乳杆菌在菊糖和黄芪多糖的作用下，代谢产生更多的乳酸，降低胃肠道pH值，提高胃蛋白酶活性，加速蛋白质断裂成小肽，从而促进了肠道对蛋白的吸收和合成。\n[0057] 表4 断奶仔猪血清免疫指标的结果\n[0058]\n项目   对照组 菌液组 合生元组\n免疫球蛋白A（g/L） 14 48.63±9.67 48.66±8.62 49.56±13.21\n  28 51.37±1.69 64.31±4.13* 66.5±2.32*\n免疫球蛋白M（g/L） 14 30.75±3.29 32.83±3.59 33.52±3.26*\n  28 32.44±4.89 31.64±2.62 32.27±3.40\n免疫球蛋白G（g/L） 14 56.82±13.91 53.57±27.55 59.87±17.16\n  28 48.91±5.46 63.01±8.47** 69.85±10.24**\n结合珠蛋白（g/L） 14 4.24±0.22 3.96±0.68* 3.78±0.28**\n  28 7.40±0.38 4.13±0.56** 4.18±0.58**\n[0059] 免疫球蛋白具有保护机体免受外界病原微生物以及其他有害大分子的侵袭的作用。结合珠蛋白是一种应急性蛋白，与动物的健康水平有着直接关联。干酪乳杆菌在菊糖和黄芪多糖的作用下快速增殖，增强了单核吞噬细胞吞噬能力和溶酶体的分泌。并且作为肠道常驻菌群，肠道微生物区系形成动物机体的生物屏障。同时乳酸杆菌和黄芪多糖可以刺激机体产生特异性免疫应答，加强肠道粘膜分泌免疫蛋白。\n[0060] 表4中显示，干酪乳杆菌-菊糖-黄芪多糖合生元可以不同程度地提高仔猪断奶后第28d血清中免疫球蛋白A、M、G的含量，并且显著地降低了结合珠蛋白含量。说明合生元可以提高动物的免疫功能，并且缓解断奶应激。\n[0061] 表5 断奶仔猪营养物质表观消化率的结果\n[0062]\n项目   对照组 菌液组 合生元组\n粗蛋白（%） 14 70.89±4.89 73.63±4.56* 74.55±5.21*\n  28 75.32±5.88 76.33±6.98 76.52±7.22\n粗脂肪（%） 14 63.41±3.58 68.33±6.89* 68.42±4.23*\n  28 77.31±6.57 78.55±7.76 78.89±6.85\n[0063] 干酪乳杆菌代谢产生的乳酸以及菊糖被降解产生丙酸和黄芪多糖降解产生的短链脂肪酸，均可以降低肠道内的pH，增加肠道内消化酶的活性，促进营养物质的分解。此外，菊糖还可以增加食糜在消化道的粘度，从而增加了食糜在消化道停留的时间，使饲粮充分被消化、利用。\n[0064] 试验结果表明（表5），与对照组相比，干酪乳杆菌-菊糖-黄芪多糖合生元可以显著提高断奶仔猪试验第14天粗蛋白和粗脂肪的表观消化率，促进了动物营养物质的消化，同时其作用效果也优于干酪乳杆菌菌液组。