一种用于检测非小细胞肺癌的双抗体夹心ELISA试剂盒及其制备方法

1.一种用于检测非小细胞肺癌的双抗体夹心ELISA试剂盒，其特征在于包含如下组成：保藏号为CCTCC NO：C201172的杂交瘤细胞株分泌的抗人非小细胞肺癌单克隆抗体NJ001-1 5-10 μL，抗SPC-A1兔多克隆抗体包被的96孔酶标板1块，辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG 5-10 μL，抗体稀释液1% PBS 40-50 mL，洗液 40-50 mL，终止液2 M H2SO4
8-10 mL，TMB底物显色液A、B液各8-10 mL，阳性对照：SPC-A1裂解液400-600 μL，阴性对照：人AB血清或胎牛血清400-600 μL和空白对照：1% PBS 1-2 mL；其中，所述的保藏号为CCTCC NO：C201172的杂交瘤细胞株分泌的抗人非小细胞肺癌单克隆抗体NJ001-1浓度为
200 mg/L，使用时稀释度为1:4 000；
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所述的抗SPC-A1兔多克隆抗体的通过如下方法制备：首次免疫用1×10 个SPC-A1细
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胞对新西兰兔进行耳缘静脉注射，其后隔一周加强免疫一次，免疫剂量为3×10 个细胞，每次免疫前均进行耳缘静脉采血，间接ELISA法检测血清抗体效价，待抗体滴度达大于或等于1:300 000后进行腹主动脉放血，将兔血37 ℃放置1 h，再转入4 ℃过夜，待血液充分收缩后迅速分离血清，并于4 ℃，3000 r/min离心30 min，收集上清，利用Protein A亲和层析法进行纯化，纯化后效价为1:150 000-170 000；
所述的抗SPC-A1兔多克隆抗体包被的酶标板通过如下方法制备：用pH 9.6的碳酸盐包被缓冲液将纯化后抗SPC-A1兔多克隆抗体稀释成目的浓度0.63 μg/mL；将稀释好的抗体溶液混匀后加入微孔中，100 μL/孔，4 ℃过夜；洗板3次；加入3% BSA封闭液，300 μL/孔，4 ℃过夜；洗板3次；所述的pH9.6的碳酸盐包被缓冲液: Na2CO3 1.59 g，NaHCO3
2.93 g，加ddH2O至1 L，最后用10 M NaOH调节pH至9.6，混匀；所述的洗液配方为：2.0 g NaCl；0.2 g KH2PO4；2.9 g Na2HPO4·12H2O；0.2 g KCl；0.2 g NaN3；40 mL ddH2O；0.5 mL吐温-20，临用前加ddH2O至1 L；SPC-A1裂解液制备方法为：将SPC-A1铺于六孔板中，浓度为
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1×10 个/mL；待细胞铺满孔底后，弃培养液，加4 ℃预冷1% PBS洗两遍，2 mL/孔；每孔加入裂解液150 μL，置于震荡器上；30 min后，用枪头刮取贴壁细胞，收集裂解液于1.5 mL EP管中，13 000 g离心10 min；留取上清，分装后-20℃保存。
2.权利要求1所述的用于检测非小细胞肺癌的双抗体夹心ELISA试剂盒的制备方法，其特征在于包含如下步骤：
（1）单克隆抗体NJ001-1的制备：取8-10周龄雌性BALB/c小鼠腹腔注射0.5 mL石蜡油，10 d后分别腹腔注射生长良好的保藏号为CCTCC NO：C201172的杂交瘤细胞 NM001-1
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1×10/只，1-2周后抽吸腹水，37 ℃ 1 h后，4 ℃过夜，次日将腹水离心，经Protein G亲和层析柱纯化，得到纯化的单克隆抗体NJ001-1，抗体经甘油与水比例为1:1的液体进行溶解，终浓度为200 mg/L；
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（2）抗SPC-A1兔多克隆抗体的制备：首次免疫用1×10 个SPC-A1细胞对新西兰兔进
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行耳缘静脉注射，其后隔一周加强免疫一次，免疫剂量为3×10 个细胞，每次免疫前均进行耳缘静脉采血，间接ELISA法检测血清抗体效价，待抗体滴度达大于或等于1:300 000后进行腹主动脉放血，将兔血37 ℃放置1 h，再转入4 ℃过夜，待血液充分收缩后迅速分离血清，并于4 ℃，3 000 r/min离心30 min，收集上清，利用Protein A亲和层析法进行纯化，纯化后效价为1:150 000-1:170 000，浓度为14.77 μg/mL；
（3）抗SPC-A1兔多克隆抗体包被酶标板：用pH9.6的碳酸盐包被缓冲液将纯化后抗SPC-A1兔多克隆抗体稀释成目的浓度0.63 μg/mL；将稀释好的液体充分混匀后加入微孔中，100 μL/孔，4 ℃过夜；洗板3次，200 μL/孔；加入3% BSA封闭液，300 μL/孔，4 ℃过夜；洗板3次，200 μL/孔；-20℃保存；
（4）洗液、SPC-A1裂解液、1%PBS的配制：
洗液：2.0 g NaCl；0.2 g KH2PO4；2.9 g Na2HPO4·12H2O；0.2 g KCl；0.2 g NaN3；40 mL ddH2O；0.5 mL吐温-20，临用前加ddH2O至1 L；
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SPC-A1裂解液制备方法：将SPC-A1铺于六孔板中，浓度为1×10 个/mL；待细胞铺满孔底后，弃培养液，加4 ℃预冷1% PBS洗两遍，2 mL/孔；每孔加入裂解液150 μL，置于震荡器上；30 min后，用枪头刮取贴壁细胞，收集裂解液于1.5 mL EP管中，13 000 g离心10 min；
留取上清，分装后-20℃保存；
1% PBS：8 g NaCl；2.2 g KCl；1.44 g Na2HPO4；0.24 g KH2PO4；加ddH2O至 800 mL；
（5）试剂盒组装：上述制备的保藏号为CCTCC NO：C201172的杂交瘤细胞株分泌的抗人非小细胞肺癌单克隆抗体NJ001-1 5-10 μL，抗SPC-A1兔多克隆抗体包被的酶标板1块，辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG 5-10 μL，抗体稀释液1% PBS 50 mL，洗液 40-50 mL，终止液2 M H2SO4 8-10 mL，TMB底物显色液A、B液各8-10 mL，阳性对照：SPC-A1裂解液
400-600 μL，阴性对照：人AB血清或胎牛血清 400-600 μL和空白对照：1%PBS 1-2 mL组装成试剂盒。
3.根据权利要求2所述的用于检测非小细胞肺癌的双抗体夹心ELISA试剂盒的制备方法，其特征在于所述的pH 9.6的碳酸盐包被缓冲液: Na2CO3 1.59 g，NaHCO3 2.93 g，加ddH2O至1 L，最后用10 M NaOH调节pH至9.6，混匀。

一种用于检测非小细胞肺癌的双抗体夹心ELISA试剂盒及\n其制备方法\n技术领域\n[0001] 本发明属于生物样品检测领域，涉及一种用于检测非小细胞肺癌的双抗体夹心ELISA试剂盒及其制备方法。\n背景技术\n[0002] 肺癌是人类发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，全球每年肺癌发生超过150万例，其中80％为非小细胞肺癌(NSCLC)。非小细胞型肺癌，包括鳞癌、腺癌、大细胞癌，与小细胞癌相比其癌细胞生长分裂较慢，扩散转移相对较晚。尽管诊治技术日新月异，肺癌的5年生存率仍不到15％。要提高肺癌患者的生存率，早期诊断尤其重要。单克隆抗体具有高度特异性，在肿瘤诊断和治疗方面都成为当前的研究热点。\n发明内容\n[0003] 本发明的目的是提供一种用于检测非小细胞肺癌的双抗体夹心ELISA试剂盒。\n[0004] 本发明的另一目的是提供该ELISA试剂盒的制备方法。\n[0005] 本发明的目的可通过如下技术方案实现：\n[0006] 一种用于检测非小细胞肺癌的双抗体夹心ELISA试剂盒，包含如下组成：保藏号为CCTCC NO：C201172的杂交瘤细胞株分泌的抗人非小细胞肺癌单克隆抗体NJ001-1，抗SPC-A1兔多克隆抗体包被的96孔酶标板，辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG，抗体稀释液：\n1％PBS，洗液，终止液2M H2SO4，TMB底物显色液，阳性对照：SPC-A1裂解液，阴性对照：人AB血清或胎牛血清和空白对照：1％PBS。\n[0007] 所述的用于检测非小细胞肺癌的双抗体夹心ELISA试剂盒，优选包含如下组成：\n[0008] 保藏号为CCTCC NO：C201172的杂交瘤细胞株分泌的抗人非小细胞肺癌单克隆抗体NJ001-1 5-10μL，抗SPC-A1兔多克隆抗体包被的酶标板1块，辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG 5-10μL，抗体稀释液为1％PBS 40-50mL，洗液40-50mL，终止液2M H2SO4 8-10mL，TMB底物显色液A、B液各8-10mL，阳性对照：SPC-A1裂解液400-600μL，阴性对照：人AB血清或胎牛血清400-600μL和空白对照：1％PBS 1-2mL。\n[0009] 其中，所述的保藏号为CCTCC NO：C201172的杂交瘤细胞株分泌的抗人非小细胞肺癌单克隆抗体NJ001-1浓度为200mg/L。\n[0010] 所述的抗SPC-A1兔多克隆抗体的通过如下方法制备：首次免疫用1×108个\n8\nSPC-A1细胞对新西兰兔进行耳缘静脉注射，其后隔一周加强免疫一次，免疫剂量为3×10个细胞，每次免疫前均进行耳缘静脉采血，间接ELISA法检测血清抗体效价，待抗体滴度达大于或等于1∶300000后进行腹主动脉放血，将兔血37℃放置1h，再转入4℃过夜，待血液充分收缩后迅速分离血清，并于4℃，3000r/min离心30min，收集上清，利用Protein A亲和层析法进行纯化，纯化后效价为1∶150 000-1∶170 000。\n[0011] 所述的抗SPC-A1兔多克隆抗体包被的酶标板通过如下方法制备：用pH9.6的碳酸盐包被缓冲液将纯化后抗SPC-A1兔多克隆抗体稀释成目的浓度0.63μg/mL；将稀释好的抗体溶液混匀后加入微孔中，100μL/孔，4℃过夜；洗板3次；加入3％BSA封闭液，300μL/孔，4℃过夜；洗板3次。\n[0012] 所述的pH 9.6的碳酸盐包被缓冲液：Na2CO3 1.59g，NaHCO3 2.93g，加ddH2O至1L，最后用10M NaOH调节pH至9.6，混匀。\n[0013] 所述的洗液配方为：2.0g NaCl；0.2g KH2PO4；2.9g Na2HPO4·12H2O；0.2g KCl；\n0.2g NaN3；40mL ddH2O；0.5mL吐温-20，临用前加ddH2O至1L；SPC-A1裂解液制备方法为：\n6\n将SPC-A1铺于六孔板中，浓度为1×10 个/mL；待细胞铺满孔底后，弃培养液，加4℃预冷\n1％PBS洗两遍，2mL/孔；每孔加入裂解液150μL，置于震荡器上；30min后，用枪头刮取贴壁细胞，收集裂解液于1.5mL EP管中，13000g离心10min；留取上清，分装后-20℃保存。\n[0014] 所述的用于检测非小细胞肺癌的双抗体夹心ELISA试剂盒的制备方法，包含如下步骤：\n[0015] (1)单克隆抗体NJ001-1的制备：取8-10周龄雌性BALB/c小鼠腹腔注射0.5mL石蜡油，10d后分别腹腔注射生长良好的保藏号为CCTCC NO：C201172的杂交瘤细胞\n6\nNM001-11×10/只，1-2周后抽吸腹水，37℃1h后，4℃过夜，次日将腹水离心，经Protein G亲和层析柱纯化，得到纯化的单克隆抗体NJ001-1，抗体经甘油与水比例为1∶1的液体进行溶解，终浓度为200mg/L；\n[0016] (2)抗SPC-A1兔多克隆抗体的制备：首次免疫用1×108个SPC-A1细胞对新西兰\n8\n兔进行耳缘静脉注射，其后隔一周加强免疫一次，免疫剂量为3×10 个细胞，每次免疫前均进行耳缘静脉采血，间接ELISA法检测血清抗体效价，待抗体滴度达大于或等于1∶300 \n000后进行腹主动脉放血，将兔血37℃放置1h，再转入4℃过夜，待血液充分收缩后迅速分离血清，并于4℃，3 000r/min离心30min，收集上清，利用Protein A亲和层析法进行纯化，纯化后效价为1∶150 000-1∶170 000，浓度为14.77μg/mL；\n[0017] (3)抗SPC-A1兔多克隆抗体包被酶标板：用pH 9.6的碳酸盐包被缓冲液将纯化后抗SPC-A1兔多克隆抗体稀释成目的浓度0.63μg/mL；将稀释好的液体充分混匀后加入微孔中，100μL/孔，4℃过夜；洗板3次，200μL/孔；加入3％BSA封闭液，300μL/孔，4℃过夜；洗板3次，200μL/孔；-20℃保存；\n[0018] (4)洗液、SPC-A1裂解液、1％PBS的配制：洗液：2.0g NaCl；0.2g KH2PO4；2.9g Na2HPO4·12H2O；0.2g KCl；0.2g NaN3；40mL ddH2O；0.5mL吐温-20，临用前加ddH2O至1L；\n6\nSPC-A1裂解液制备方法：将SPC-A1铺于六孔板中，浓度为1×10 个/mL；待细胞铺满孔底后，弃培养液，加4℃预冷1％PBS洗两遍，2mL/孔；每孔加入裂解液150μL，置于震荡器上；\n30min后，用枪头刮取贴壁细胞，收集裂解液于1.5mL EP管中，13 000g离心10min；留取上清，分装后-20℃保存；1％PBS：8g NaCl；2.2g KCl；1.44g Na2HPO4；0.24g KH2PO4；加ddH2O至800mL；\n[0019] (5)试剂盒组装：上述制备的保藏号为CCTCC NO：C201172的杂交瘤细胞株分泌的抗人非小细胞肺癌单克隆抗体NJ001-1 5-10μL，抗SPC-A1兔多克隆抗体包被的酶标板1块，辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG 5-10μL，抗体稀释液为1％PBS 40-50mL，洗液\n40-50mL，终止液2M H2SO4 8-10mL，TMB底物显色液A、B液各8-10mL，阳性对照：SPC-A1裂解液400-600μL，阴性对照：人AB血清或胎牛血清400-600μL和空白对照：1％PBS 1-2mL组装成试剂盒。\n[0020] 所述的pH 9.6的碳酸盐包被缓冲液：Na2CO3 1.59g，NaHCO3 2.93g，加ddH2O至1L，最后用10M NaOH调节pH至9.6，混匀。\n[0021] 本发明的有益效果：\n[0022] 本发明在成功制备了能特异性识别非小细胞肺癌的单抗NJ001-1的基础上，首先通过Western blot证实了肺腺癌患者血清中NJ001-1相关靶抗原的表达水平明显高于健康体检者；然后免疫新西兰兔制备并纯化得到高效价的抗SPC-A1的多克隆抗体，联合该多抗和NJ001-1单抗建立双抗体夹心ELISA试剂盒，最后利用该试剂盒对大量的临床样本进行检测和分析。结果显示，该试剂盒用于非小细胞肺癌的检测具有很好的特异性、精密度和稳定性，有望在临床检测中发挥重要作用。目前市面上无国家FSDA批准的非小细胞肺癌抗原ELISA检测试剂盒，采用现有电化学发光方法检测非小细胞肺癌，与本ELISA检测方法比较，更敏感的化学发光法进行检测，结果显示本发明试剂盒用于非小细胞肺癌的检测时敏感度和特异性均优于化学发光法。\n附图说明\n[0023] 图1间接细胞ELISA法分析单抗NJ001-1与多种肿瘤细胞及非肿瘤细胞的反应性。\n[0024] 图2血清中NJ001-1相关靶抗原的蛋白免疫印迹结果及灰度分析；\n[0025] A：2、3和6为三位健康体检者的血清样本，4和5为两位肺腺癌患者的血清样本，\n1为SPC-A1细胞裂解液(阳性对照)；\n[0026] B：1为肺腺癌患者，2为健康体检者，3为阳性对照。\n[0027] 图3抗SPC-A1多克隆抗体的效价检测。\n[0028] 图4棋盘法确定包被抗体和NJ001-1的最佳工作浓度。\n[0029] 生物材料样品的保藏信息\n[0030] 杂交瘤细胞株NM001-1于2011年8月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉，武汉大学，保藏号为CCTCC NO：C201172。\n具体实施方式\n[0031] 1、以下实施例中所涉及的细胞及主要试剂：人肺癌细胞系SPC-A1、A549、NCI-H460、NCI-H520，人肝癌细胞系HepG2，人乳腺癌细胞系ZR-75-30，人结肠癌细胞系Colo205及人胚肺成纤维细胞系WI-38购自中国科学院细胞库；SP2/0小鼠骨髓瘤细胞系由本实验室保存；6-8周龄和8-10周龄雌性BALB/c小鼠购自上海斯莱克实验动物公司。\nRPMI 1640、DMEM、胎牛血清、0.25％胰蛋白酶、聚乙二醇、次黄嘌呤胸腺嘧啶核苷(HT)、氨基喋呤次黄嘌呤胸腺嘧啶核苷(HAT)、人AB血清和石蜡油购自美国Gibco Invitrogen公司；\nFITC标记的羊抗鼠IgG及可溶型单组分TMB底物溶液购自北京天根公司；小鼠Ig亚型测定试剂盒购自美国Santa Cruz公司；Western blot显色剂购自美国Cell Signaling公司；肺炎性假瘤组织、肺癌组织及乳腺癌组织由江苏省人民医院病理科提供；Model 550型酶标仪购自Bio-Rad公司。2.5Kg的雄性新西兰兔购自上海斯莱克实验动物公司。BSA购自Biosharp公司；GAPDH抗体购自碧云天公司；辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG购自中杉金桥公司；Proteo Extract Albumin/IgG Removal Kit购自默克公司。\n[0032] 2、以下实施例中所涉及的细胞培养方法为：上述细胞分别生长于含10％胎牛血清、青霉素和链霉素各100U/mL的DMEM或RPMI1640培养液中，37℃、5％CO2恒温培养箱中培养。人外周血单个核细胞(PBMC)获自健康献血者，采用常规淋巴细胞分离液分离。\n[0033] 3、标本收集2007年10月至2011年6月病理科确诊的肺癌患者303例，其中195例为肺腺癌，作为实施例6-8中的肺腺癌组，69例为肺鳞癌，作为实施例6-8中的肺鳞癌，肺腺癌组和肺鳞癌组合并作为非小细胞肺癌组；39例为小细胞肺癌，作为实施例6-8中的小细胞肺癌组；同时收集50例肺良性疾病患者，作为实施例6-8中的肺良性疾病组和500例健康体检者作为实施例6-8中的健康体检组。临床病理参数见表1，随访至2011年10月。\n[0034] 表1不同组别的临床病理参数\n[0035] \n[0036] 4、标本处理用血清分离胶真空采血管采集静脉血2mL，先室温3000r/min离心\n10min，转移上层血清，再于4℃、16 000×g离心10min，吸取上层无细胞血清分装每管\n200μL，置-70℃保存。上述操作于标本采集后2h内完成。\n[0037] 5、统计学分析采用SPSS 16.0统计学软件对数据进行统计分析。定性资料的组间比较采用Fisher’s确切概率法，P＜0.05时具有统计学意义。\n[0038] 实施例1单抗制备\n[0039] 1.1动物免疫取6-8周雌性BALB/c小鼠，每只用2×106SPC-A1细胞/次腹腔注射免疫3次，每次间隔2周。每次免疫前均进行小鼠内眦采血，间接细胞ELISA法检测小鼠血清抗体效价，待免疫小鼠血清抗体滴度达到最大并不再升高时取鼠脾细胞进行融合，融合前3d加强免疫1次。\n[0040] 1.2间接细胞ELISA试验接种SPC-A1细胞105/孔于96孔板上，至细胞生长融合达80％，95％乙醇固定，PBS洗3次，0.2％Triton-X-100通透20min，再用50g/L BSA 37℃封闭2h，依次加入不同稀释度的免疫小鼠血清100μL，37℃温育1h，再经PBS洗3次后，加入1∶1 000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG 100μL，37℃温育45min，经PBS洗涤后，加入TMB显色液，37℃温育10min后终止反应，用酶标仪测定450nm时吸光度(OD)值，以未免疫小鼠血清(1∶1 000)作为阴性对照。\n[0041] 1.3细胞融合取免疫小鼠脾脏研磨制成细胞悬液，与处于对数生长期的骨髓瘤细胞SP2/0进行融合(姚晓玲，柳晓燕，吴强，等.人肺癌相关单克隆抗体的制备及其抗原的纯化[J].中国免疫学杂志，2006，22(12)：1140-1145.)，首次融合480孔，融合1周后出现细胞克隆，有330孔生长杂交瘤细胞，融合率约为70％。按照1.2中的方法进行间接细胞ELISA试验筛选阳性杂交瘤细胞(将1.2间接细胞ELISA试验中的免疫小鼠血清替换为杂交瘤细胞培养上清)，进行转种和3次有限稀释法亚克隆，采获得稳定分泌抗SPC-A1单抗且阳性最强的杂交瘤细胞株NM001-1。将杂交瘤细胞株NM001-1于2011年8月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为武汉，武汉大学，保藏号为CCTCC NO：C201172。\n[0042] 1.4单抗腹水的制备及纯化\n[0043] 取8-10周龄雌性BALB/c小鼠腹腔注射0.5mL石蜡油，10d后分别腹腔注射生长\n6\n良好的杂交瘤细胞NM001-1(CCTCC NO：C201172)约1×10/只，1-2周后抽吸腹水，37℃1h后，4℃过夜，次日分别将腹水离心，经Protein G亲和层析柱纯化，得到纯化的单克隆抗体NJ001-1；抗体经甘油与水比例为1∶1的液体进行溶解，终浓度为200mg/L。\n[0044] 1.5单抗的鉴定\n[0045] 1.5.1单抗Ig亚类的鉴定：纯化单抗用PBS 1∶10 000稀释，按照测定试剂盒说明书操作。单抗NJ001-1的亚类均为IgG，轻链为κ链。\n[0046] 1.5.2单抗效价的测定：分别将纯化的单抗NJ001-1用PBS倍比稀释，分别取\n100μL加入包被有SPCA1细胞的96孔板中，用间接细胞ELISA法测定OD450值，能与包被细\n6\n胞发生免疫反应的单抗最大稀释度即为其效价。单克隆抗体NJ001-1效价为4×10，用于本发明试剂盒的制备。\n[0047] 1.5.3单抗特异性的鉴定：用纯化的单抗NJ001-1与上述8种肿瘤细胞(人肺癌细胞系：肺腺癌SPC-A1和A549，大细胞肺癌：NCI-H460，肺鳞癌：NCI-H520，人肝癌细胞系：HepG2，人乳腺癌细胞系：ZR-75-30，人结肠癌细胞系：Colo205与人胚肺成纤维细胞系：\nWI-38)及健康人PBMC分别做间接细胞ELISA分析，观察有无阳性反应。结果显示，单抗NJ001-1仅对肺癌细胞(SPCA1、A549、NCI-H520、NCI-H460)抗原具有较强反应，对其他肿瘤细胞(HepG2、Colo 205、ZR-75-30)抗原、正常人胚肺细胞(WI-38)抗原及健康人PBMC均无反应(见图1)。\n[0048] 实施例2蛋白免疫印迹(Western blot)\n[0049] 随机选择3例肺腺癌患者和2例健康体检者的血清，通过Proteo Extract Albumin/IgG Removal试剂盒除去血清中的白蛋白和IgG，经冷冰酮法对样本进行浓缩。将浓缩后的样本加样至12％的SDS-PAGE胶进行蛋白分离，后将蛋白转移至PVDF膜，用5％的脱脂牛奶室温封闭2h，再分别以1∶1 000稀释的NJ001-1单抗和1∶400稀释的GAPDH抗体4℃摇床孵育过夜，取出膜用1×TBST漂洗3次，加入1∶3 000稀释的羊抗鼠二抗室温摇床孵育2h，1×TBST漂洗3次后进行ECL显色。肺腺癌患者血清中NJ001-1相关靶抗原的表达水平显著高于健康体检者，见图2A，灰度分析结果见图2B。\n[0050] 实施例3抗SPC-A1多克隆抗体的制备\n[0051] 首次免疫用1×108个SPC-A1细胞对新西兰兔进行耳缘静脉注射，其后隔一周加\n8\n强免疫一次，免疫剂量为3×10 个细胞。每次免疫前均进行耳缘静脉采血，间接ELISA法\n5\n(以SPC-A1细胞铺板，浓度为1×10 个/孔，将免疫前血清和该次采集的血清从1∶5 000开始分别进行倍比稀释后加样，以辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG作为二抗，以OD450大于\n2.1倍阴性对照孔的血清最高稀释倍数作为血清的效价)检测血清抗体效价。待抗体滴度达大于或等于1∶300 000后进行腹主动脉放血，将兔血37℃放置1h，再转入4℃过夜，待血液充分收缩后迅速分离血清，并于4℃，3 000r/min离心30min，收集上清，利用Protein A亲和层析法进行纯化，纯化后效价为1∶160 000，见图3，浓度为14.77μg/mL。\n[0052] 实施例4包被抗体和一抗最佳工作浓度的确定\n[0053] 用棋盘滴定实验确定包被抗体和一抗的工作浓度。用包被缓冲液(pH 9.6)将包被抗体(抗SPC-A1兔多抗，14.77mg/mL)稀释成2.50、1.25、0.63及0.31μg/mL包被酶标板，100μL每孔，4℃过夜；用洗液洗板3次；3％BSA每孔300μL，4℃封闭过夜，得到抗SPC-A1多克隆抗体包被的酶标板；用洗液洗板同上，加入待检血清，50μL每孔，37℃孵育\n2h，洗板5次；将一抗(单克隆抗体NJ001-1，200mg/L)分别用1％PBS(抗体稀释液)进行\n1∶3 000、1∶4 000、1∶5 000和1∶6 000的稀释，每孔加入100μL，37℃孵育1h；洗板\n5次；辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG，用1％PBS(抗体稀释液)稀释至1∶3 000，每孔加\n100μL，37℃孵育30min，用洗液洗板5次；每孔加入新鲜配制的TMB底物显色液100μL(空白孔除外)，室温避光显色10min，以2M H2SO4的终止液终止反应。用Model550型酶联仪(Bio-Rad公司)读取OD值，读数波长450nm。阳性、阴性和空白对照分别为SPC-A1裂解液，人AB血清或胎牛血清和1％PBS。选择阳性孔OD450值/阴性孔OD450值(P/N值)最大孔所对应的包被抗体和一抗的浓度为最佳工作浓度。结果显示：当包被抗体的浓度为0.63μg/mL，一抗稀释度为1∶4 000时，可保证尽可能多地结合靶抗原，同时P/N值最大(9.8)，见图4。\n[0054] 上述方法中涉及的各试剂的配制方法：\n[0055] 终止液、TMB底物显色液：购自上海科华公司\n[0056] 洗液：2.0g NaCl；0.2g KH2PO4；2.9g Na2HPO4·12H2O；0.2g KCl；0.2g NaN3；40mL ddH2O；0.5mL吐温-20，临用前加ddH2O至1L。\n[0057] SPC-A1裂解液制备方法：将SPC-A1铺于六孔板中(浓度为1×106个/mL)；待细胞铺满孔底后，弃培养液，加4℃预冷1％PBS洗两遍，2mL/孔；每孔加入裂解液150μL，置于震荡器上；30min后，用枪头刮取贴壁细胞，收集裂解液于1.5mL EP管中，13000g离心\n10min；留取上清，分装后-20℃保存。\n[0058] 抗体稀释液1％PBS：8g NaCl；2.2g KCl；1.44g Na2HPO4；0.24g KH2PO4；加ddH2O至800mL。pH9.6的碳酸盐包被缓冲液：Na2CO3 1.59g，NaHCO3 2.93g，加蒸馏水至1L，最后用10M NaOH调节pH至9.6，充分混匀。\n[0059] 实施例5\n[0060] 用于检测非小细胞肺癌的双抗体夹心ELISA试剂盒，包含如下组分：上述制备的保藏号为CCTCC NO：C201172的杂交瘤细胞株分泌的抗人非小细胞肺癌单克隆抗体NJ001-1 5μL，抗SPC-A1兔多克隆抗体包被的96孔酶标板，辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG 5μL，洗液40mL，终止液2M H2SO4 8mL，TMB底物显色液A、B液各8mL，阳性对照：SPC-A1裂解液500μL，阴性对照：人AB血清或胎牛血清500μL和空白对照：1％PBS 1mL，抗体稀释液为1％PBS 50mL。\n[0061] 试剂盒中使用的单抗、多抗以及各试剂的制备方法见实施例1、3、4。终止液、TMB底物显色液：购自上海科华生物工程股份有限公司。\n[0062] 所述的抗SPC-A1兔多克隆抗体包被的酶标板通过如下方法制备：用pH9.6的碳酸盐包被缓冲液将纯化后抗SPC-A1兔多克隆抗体稀释成目的浓度0.63μg/mL；将稀释好的抗体溶液混匀后加入微孔中，100μL/孔，4℃过夜；洗板3次，200μL/孔；加入3％BSA封闭液，300μL/孔，4℃过夜；洗板3次，200μL/孔；-20℃保存。\n[0063] 实施例6\n[0064] 从冰箱中取出-20℃保存的实施例5制备的试剂盒，待测血清、阳性对照(SPC-A1裂解液)及阴性对照(人AB血清或胎牛血清)，置于冰上融解；取出已包被ELISA板及相关试剂恢复至室温；待血清融解后，颠倒混匀，离心；取待测血清上清50μL加入微孔中，同时加入阳性对照、阴性对照、空白对照各50μL/孔；37℃孵育2h，取出ELISA板用洗液洗板5次，200μL/孔，每次2min；用抗体稀释液1％PBS按1∶4 000稀释一抗NJ001-1，100μL/孔加入微孔；37℃孵育1h，洗板同前；用抗体稀释液1％PBS按照1∶3 000稀释二抗辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG，100μL/孔加入微孔；37℃孵育30min，洗板同前；将TMB底物显色液A、B按1∶1混合，100μL/孔加入微孔中(空白对照孔不加底物)，室温避光10min，加入终止液，50μL/孔；Model 550型酶联仪检测OD450值。\n[0065] 双抗体夹心ELISA法检测结果显示(表2)肺腺癌、肺鳞癌、小细胞肺癌和肺良性疾病组的检测阳性率分别为63.1％(123/195)，47.8％(33/69)，20.5％(8/39)和12.0％(6/50)均显著高于健康体检组(4.4％，P＜0.05)。非小细胞肺癌组(肺腺癌和肺鳞癌)的阳性率显著高于小细胞肺癌组(59.1％vs 20.5％，P＜0.05)和肺良性疾病组(59.1％vs \n12.0％，P＜0.05)。另外，非小细胞肺癌中肺腺癌组的阳性率显著高于肺鳞癌组(63.1％vs 47.8％，P＜0.05)。195例肺腺癌患者中已明确病理分期的为124例，其中早期组(I/II)和晚期组(III/IV)的阳性率分别达63.3％(19/30)和79.8％(75/94)，结果表明，本方法在早期肺腺癌病例中即有较高的检出率，有助于肺腺癌的早期诊断。\n[0066] 表2双抗体夹心ELISA法检测各组的阳性率\n[0067] \n[0068] 注：*与肺腺癌组阳性率比较，P＜0.05；△与肺鳞癌组阳性率比较，P＜0.05；○与小细胞肺癌组阳性率比较，P＜0.05；□与肺良性疾病组阳性率比较，P＜0.05[0069] 实施例7\n[0070] 通过较ELISA方法敏感的化学发光法对样本进行血清CEA、NSE和CYFRA21-1的同步检测，与基于本发明双抗体夹心ELISA试剂盒的双抗体夹心ELISA方法进行比较。\n[0071] 1.敏感性：表3中基于本发明双抗体夹心ELISA试剂盒的双抗体夹心ELISA法对非小细胞肺癌患者的检测阳性率为59.1％(156/264)，显著高于CEA、NSE和CYFRA21-1的阳性率(41.3％、17.4％和37.1％)，故本发明试剂盒对NJ001-1相关靶抗原的检测较CEA、NSE和CYFRA21-1检测相应靶抗原具有更高的敏感性；\n[0072] 2.特异性：基于本发明双抗体夹心ELISA试剂盒的双抗体夹心ELISA法对小细胞肺癌患者，肺良性疾病患者和健康体检者的检测阳性率分别为20.5％、12.0％和4.4％，均明显低于CEA、NSE和CYFRA21-1的阳性率(其中CEA阳性率为25.6％、14.0％和5.8％，NSE的阳性率为56.4％、18.0％和9.8％，CYFRA21-1的阳性率为23.1％、16.0％和6.4％)，故该试剂盒对NJ001-1相关靶抗原的检测较CEA、NSE和CYFRA21-1检测相应靶抗原具有更好的特异性。\n[0073] 表3各组别中ELISA法检测NJ001-1相关靶抗原与化学发光法检测三种肿瘤标志物的阳性率\n[0074] \n[0075] 注：*与NJ001-1相关靶抗原比较，P＜0.05；○与NJ001-1相关靶抗原比较，P＜0.05；△与NJ001-1相关靶抗原比较，P＜0.05；\n[0076] 3.对于肺腺癌：表4中基于本发明双抗体夹心ELISA试剂盒的双抗体夹心ELISA法检测195例肺腺癌患者血清中NJ001-1相关靶抗原的阳性率为63.1％，显著高于电化学发光方法(CEA 45.1％，NSE 15.9％，和CYFRA21-1 33.8％)，P＜0.05。\n[0077] 4.对于肺鳞癌：与上述结果相似，表4中基于本发明双抗体夹心ELISA试剂盒的双抗体夹心ELISA法检测69例肺腺癌患者血清中NJ001-1相关靶抗原的阳性率为47.8％，明显高于电化学发光方法(CEA 30.4％，NSE 21.7％和CYFRA21-1 46.4％)。\n[0078] 5.对于三项联合检测：采用电化学发光方法联合CEA，NSE，和CYFRA21-1三项指标检测264例非小细胞肺癌患者血清的阳性率为59.5％(157/264)；而仅采用基于本发明双抗体夹心ELISA试剂盒的双抗体夹心ELISA法检测NJ001-1相关靶抗原单项检测即可达到近乎相同阳性检出率59.1％(156/264)。\n[0079] 6.对于四项联合检测：在三项联合检测基础上加入本发明检测，即四项联合(NJ001-1相关靶抗原、CEA、NSE和CYFRA21-1)在肺腺癌及肺鳞癌患者血清中的阳性检出率分别为85.1％，75.4％，显著高于三项联合(CEA、NSE和CYFRA21-1)的阳性检出率60.5％，\n56.6％，大幅度地提高(约提高20％左右)非小细胞肺癌的阳性检出率，见表4。\n[0080] 表4肺腺癌和肺鳞癌组中单项和联合检测NJ001-1相关靶抗原及三种肿瘤标志物的阳性率\n[0081] \n[0082] 注：*与四项联合组比较，P＜0.01；○表示与NJ001-1相关靶抗原比较，P＜0.05；\n△表示与四项联合组比较，P＜0.05；□表示与NJ001-1相关靶抗原比较，P＜0.05.[0083] 实施例8\n[0084] 精密度：混合10份非小细胞肺癌患者的血清，利用实施例5制备的双抗体夹心ELISA试剂盒对其连续检测20次，另外每天检测1次，连续检测20天，结果显示，批内和批间的CV％分别为2.24％和2.52％，均在允许误差范围内(批内CV％＜2.5％，批间CV％＜3.3％)，故该法精密度高，重复性较好。\n[0085] 稳定性：将实施例5制备的双抗体夹心ELISA试剂盒置于-20℃分别保存30d、90d和270d，再分别对高水平样本(10份非小细胞肺癌患者的混合血清)和低水平样本(10份健康体检者的混合血清)进行检测，高水平样本的CV％为1.83％，低水平样本的CV％为\n2.11％，均小于3.3％，说明该试剂盒具有良好的稳定性。