氨基甲酸酯天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂及其用途

1、式I化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗患者疾病的 药物中的应用，该疾病通过用天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂 治疗得以减轻，

其中：
Z是氧；
R1是-CH2Y；
Y是卤素；
R2是-CO2H、或其C1-C6烷基酯、C3-C10环烷基酯或胆固醇酯或其伯、 仲或叔酰胺；其中酰胺氮上的合适取代基包括一个或多个C1-C6烷基 或含有1-2个杂原子的5至6元杂环基环，其中C1-C6烷基可选被 N(R)2取代，并且其中R是直链或支链C1-12烷基；
R3是直链或支链C1-C4烷基或C3-6环烷基；和
R4和R5与中间的氮一起构成二-或三-环的杂环基或杂芳基环系统，具 有1-4个选自氮、氧或硫的杂原子，其中所述系统的每一个环具有5 -7个环原子。
2、权利要求1的应用，其中R1是-CH2F。
3、权利要求1的应用，其中R2是-CO2H。
4、权利要求1的应用，其中R3是直链或支链C1-C4烷基。
5、权利要求4的应用，其中R3是乙基、异丙基或叔丁基。
6、权利要求5的应用，其中R3是异丙基。
7、权利要求1的应用，其中R4和R5与中间的氮一起构成三环的 杂环基或杂芳基环系统，其中该系统的每个环具有5-7个环原子。
8、权利要求7的应用，其中R4和R5与中间的氮一起构成选自下 述的环：取代或未取代的吲哚、二氢吲哚、咔唑、二氢菲啶、二氢二 苯并氮杂、二苯并氮杂、或吩噻嗪。
9、权利要求8的应用，其中R4和R5与中间的氮一起构成选自取 代或未取代的吲哚、咔唑或吩噻嗪的环。
10、权利要求9的应用，其中R4和R5与中间的氮一起构成选自 取代或未取代的吲哚或咔唑的环。
11、权利要求1的应用，其中所述化合物选自下列化合物：





和

12、权利要求11的应用，其中所述化合物选自如下：

和
13、式I化合物：

或其药学上可接受的盐，其中：
Z是氧；
R1是-CH2Y；
Y是卤素；
R2是-CO2H、或其C1-C6烷基酯、C3-C10环烷基酯或胆固醇酯；或其 伯、仲或叔酰胺；其中酰胺氮上的合适取代基包括一个或多个C1-C6 烷基或含有1-2个杂原子的5至6元杂环基环，其中C1-C6烷基可选 被N(R)2取代，其中R是直链或支链C1-12烷基；
R3是直链或支链C1-C4烷基或C3-6环烷基；和
R4和R5与中间的氮一起构成二-或三-环的杂环基或杂芳基环系统，具 有1-4个选自氮、氧或硫的杂原子，其中所述系统的每一个环具有5 -7个环原子。
14、权利要求13的化合物，其中R1是-CH2F。
15、权利要求13的化合物，其中R2是-CO2H。
16、权利要求13的化合物，其中R3是直链或支链C1-C4烷基。
17、权利要求16的化合物，其中R3是乙基、异丙基或叔丁基。
18、权利要求17的化合物，其中R3是异丙基。
19、权利要求13的化合物，其中R4和R5与中间的氮一起构成三 环的杂环基或杂芳基环系统，其中该系统的每个环具有5-7个环原子。
20、权利要求19的化合物，其中R4和R5与中间的氮一起构成选 自下述的环系统：取代或未取代的吲哚、二氢吲哚、咔唑、二氢菲啶、 二氢二苯并氮杂、二苯并氮杂、或吩噻嗪。
21、权利要求20的化合物，其中R4和R5与中间的氮一起构成选 自取代或未取代的吲哚、咔唑或吩噻嗪的环系统。
22、权利要求21的化合物，其中R4和R5与中间的氮一起构成选 自取代或未取代的吲哚或咔唑的环系统。
23、权利要求13的化合物，其中所述化合物选自下列化合物：






和

24、权利要求23的化合物，其中该化合物选自如下：

和
25、药物组合物，包含根据权利要求13-24任一项的化合物和药 学上可接受的载体。

发明领域\n本发明属于医药化学领域，涉及新颖的化合物及其药物组合物， 它们抑制介导细胞程序死亡和炎症的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白 酶。本发明还涉及使用本发明化合物和药物组合物治疗牵涉天冬氨酸 特异性半胱氨酸蛋白酶活性的疾病的方法。\n发明背景\n细胞程序死亡或编程性细胞死亡是生物体消除不需要的细胞的主 要机理。细胞程序死亡的去调节，即，无论是过度的细胞程序死亡还 是不能经历之，都已牵涉在大量疾病中，例如癌症、急性炎症、自体 免疫障碍、局部缺血疾病和某些神经变性障碍(一般参见Science(科 学)，1998，281，1283-1312；Ellis等，Ann.Rev.Cell Biol.(细 胞生物学年评)，1991，7，663)。\n天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(caspases)是一个半胱氨酸蛋 白酶家族，它们在细胞程序死亡的信号途径和细胞解装配中是关键的 介质(Thornberry，Chem.Biol.(化学与生物学)，1998，5， R97-R103)。这些信号途径因细胞类型和刺激物而异，但是所有细胞程 序死亡途径似乎都集中于一种共同的效应器途径，该途径引起关键蛋 白质的蛋白水解。天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶参与信号途径的效 应器阶段和其初始的上游阶段。参与初始事件的上游天冬氨酸特异性 半胱氨酸蛋白酶变成活化，继而激活参与细胞程序死亡后期的其他天 冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶。\n天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1是首先被鉴别的天冬氨酸特异 性半胱氨酸蛋白酶，已知也称白介素转化酶或“ICE”。天冬氨酸特异性 半胱氨酸蛋白酶-1通过特异性裂解Asp-116与Ala-117之间的 pIL-1β，转化前体白介素-1β(“pIL-1β”)为前炎性活性形式。除了天 冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1以外，还有十一种其他已知的人天冬 氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶，它们都特异性裂解天冬氨酰残基。还观 察到它们在裂解部位的N-末端一侧迫切需要至少四个氨基酸残基。\n根据优选或首先识别的氨基酸序列，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋 白酶分为三组。一组天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶包括天冬氨酸特 异性半胱氨酸蛋白酶1、4和5，偏爱裂解部位的N-末端一侧4位疏 水性芳族氨基酸。另一组包括天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶2、3 和7，识别裂解部位的N-末端一侧1位和4位天冬氨酰残基，优选为 Asp-Glu-X-Asp的序列。第三组包括天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶 6、8、9和10，在首先识别序列中容许很多氨基酸，但是似乎偏爱4 位具有分支的脂族侧链的残基，例如缬氨酸和亮氨酸。\n天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶还根据所认知的功能加以分组。 第一亚家族由天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1(ICE)、4和5组成。 这些天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶参与前炎性细胞因子过程，因此 在炎症中扮演重要角色。天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1是这类中 研究最多的酶，它通过蛋白水解作用激活IL-1β前体。这种酶因此在 炎症应答中扮演关键角色。天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1还参与 γ-干扰素诱导因子(IGIF或IL-18)过程，刺激γ-干扰素的产生，后者 是调制抗原呈递、T-细胞活化和细胞粘连的关键免疫调节剂。\n其余天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶构成第二与第三亚家族。这 些酶在引起细胞程序死亡的细胞内信号途径中是至关重要的。一个亚 家族由参与引发细胞程序死亡途径事件的酶组成，包括信号从质膜转 导。该亚家族的成员包括天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-2、8、9和 10。另一亚家族由效应器天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3、6和7 组成，参与最终的下游裂解事件，通过细胞程序死亡导致细胞的系统 崩溃和死亡。参与上游信号转导的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶激 活下游天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶，后者然后使DNA修复机理无 效，使DNA片段化，拆解细胞的细胞骨架，最终使细胞片段化。\n已经测定了首先由天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶识别的四氨基 酸序列的酶底物。Talanian等，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)272， 9677-9682，(1997)；Thornberry等，J.Biol.Chem.(生物化学杂 志)272，17907-17911，(1997)。关于首先由天冬氨酸特异性半胱氨 酸蛋白酶识别的四氨基酸序列的知识已经用于设计天冬氨酸特异性半 胱氨酸蛋白酶抑制剂。已经制备了可逆性四肽抑制剂，具有结构 CH3CO-[P4]-[P3]-[P2]-CH(R)CH2CO2H，其中P2至P4代表最佳氨基酸 识别序列，R是能够与天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶半胱氨酸巯基 结合的醛、腈或酮。Rano和Thornberry，Chem.Biol.(化学与生物 学)4，149-155(1997)；Mjalli，等，Bioorg.Med.Chem.Lett.(生 物有机与医药化学快报)，3，2689-2692(1993)；Nicholson等， Nature(自然)376，37-43(1995)。已经制备了基于类似四肽识别 序列的不可逆抑制剂，其中R是酰氧基甲基酮——COCH2OCOR’，R’例如 为可选被取代的苯基，例如2，6-二氯苯甲酰氧基，其中R是COCH2X， 其中X是离去基团，例如F或Cl. Thornberry等，Biochemistry(生 物化学)33，3934(1994)；Dolle等，J.Med.Chem.(药物化学杂 志)37，563-564(1994)。\n天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂治疗各种与细胞程序死亡 增加有关的哺乳动物疾病状态的实用性已经得到肽类天冬氨酸特异性 半胱氨酸蛋白酶抑制剂的证明。例如，在啮齿动物模型中，天冬氨酸 特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂已经显示减少心肌梗塞后的梗塞大小和 抑制心肌细胞程序死亡，减少由中风导致的损伤体积和神经病学缺陷， 减少创伤性脑损伤中的创伤后细胞程序死亡和神经病学缺陷，有效治 疗暴发性肝坏死，提高内毒素性休克后的存活率。Yaoita等， Circulation(循环)，97，276(1998)；Endres等，J.Cerebral Blood Flow and Metabolism(脑血流与代谢杂志)，18，238，(1998)；Cheng 等，J.Clin.Invest.(临床检查杂志)，101，1992(1998)；Yakovlev 等，J.Neuroscience(神经科学杂志)，17，7415(1997)；Rodriquez 等，J.Exp.Med.(实验医学杂志)，184，2067(1996)；Grobmyer 等，Mol.Med.(分子医学)，5，585(1999)。\n一般而言，上述肽类抑制剂对有些天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白 酶是非常有效的。不过，这种效力不总是反映在细胞程序死亡的细胞 模型中。另外，肽抑制剂通常具有不希望的药理学性质，例如口服吸 收差、稳定性差和代谢迅速。Plattner和Norbeck，Drug Discovery Technologies(药物发现技术)，Clark和Moos编(Ellis Horwood， Chichester，英格兰，1990)。\n改性肽抑制剂已见诸报道。WO 91/15577和WO 93/05071公开了 下式的肽ICE抑制剂：\nZ-Q2-Asp-Q1\n其中Z是N-末端保护基团；Q2是0至4个氨基酸；Q1是电负性离去基 团。\nWO 99/18781公开了下式的二肽天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶 抑制剂：\n\n其中R1是N-末端保护基团；AA是天然α-氨基酸或β-氨基酸的残基； R2是氢或CH2R4，其中R4是电负性离去基团；R3是烷基或氢。\nWO 99/47154公开了下式的二肽天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶 抑制剂：\n\n其中R1是N-末端保护基团；AA是非天然α-氨基酸或β-氨基酸的残基； R2是可选被取代的烷基或氢。\nWO 00/023421公开了具有下式的(取代的)酰基二肽细胞程序死亡 抑制剂：\n\n其中n是0、1或2；q是1或2；A是某种天然或非天然氨基酸的残基； B是氢原子、氘原子、C1-10直链或支链烷基、环烷基、苯基、取代的苯 基、萘基、取代的萘基、2-苯并唑基、取代的2-唑基、(CH2)m环 烷基、(CH2)m苯基、(CH2)m(取代的苯基)、(CH2)m(1-或2-萘基)、(CH2)m 杂芳基、卤代甲基、CO2R13、CONR14R15、CH2ZR16、CH2OCO芳基、CH2OCO(取 代的芳基)、CH2OCO(杂芳基)、CH2OCO(取代的杂芳基)、或CH2OPO(R17)R18， 其中R13、R14、R15、R16、R17和R18是如该申请所定义的；R2选自含有氢、 烷基、环烷基、苯基、取代的苯基、(CH2)mNH2的组；R3是氢、烷基、 环烷基、(环烷基)烷基、苯基烷基、或取代的苯基烷基；X是CH2、C＝O、 O、S、NH、C＝ONH或CH2OCONH；Z是氧或硫原子。\nWO 97/24339公开了下式的白介素-1β转化酶抑制剂：\n\n其中R1代表H、烷基、烷氧基、碳环、杂环、和各种其他基团；AA1和 AA2是单键或氨基酸；Y代表下式基团：\n\n其中Tet环代表四唑环；Z尤其代表亚烷基、亚烯基、O、S、SO、和 SO2。\nEP 618223公开了下式的ICE抑制剂：\nR-A1-A2-X-A3\n其中R是H、保护基团、或可选为环取代的PhCH2O；A1是α-羟基-或α- 氨基酸残基；A2是α-羟基酸残基或α-氨基酸，或者A1和A2一起构成伪 二肽或二肽模拟物残基；X是从Asp衍生的残基；A3是CH2X1COY1、CH2OY2、 CH2SY3或CH2(CO)mY6，其中X1是O或S，m是O或1，Y1、Y2、Y3和Y6是 可选被取代的环状脂族基团或芳基。\nWO 98/16502尤其公开了下式的ICE抑制剂：\n\n其中R1和R2是如该申请所述的，吡咯烷环被各种基团取代。\n尽管已经报道了大量天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂，不 过还不清楚它们是否具有治疗学上有用的适当的药理学性质。因此， 对小分子天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂仍然存在需求，它们 是有效的和稳定的，跨膜提供体内对细胞程序死亡的有效抑制作用。 这类化合物将大可用于治疗其中天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶扮演 角色的上述疾病。\n发明概述\n现已发现，本发明的化合物及其药物组合物是有效的天冬氨酸特 异性半胱氨酸蛋白酶与细胞程序死亡的抑制剂。这些化合物具有通式 I：\n\n其中：\nZ是氧或硫；\nR1是氢、-CHN2、-R、-CH2OR、-CH2SR、或-CH2Y；\nR是C1-12脂族基团、芳基、芳烷基、杂环基、或杂环烷基；\nY是电负性离去基团；\nR2是CO2H、CH2CO2H、或其酯、酰胺或等排物；\nR3是能够适合天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶S2亚位的基团；\nR4和R5与中间的氮一起构成单-、二-或三-环的杂环系统，具有1-6 个选自氮、氧或硫的杂原子。\n本发明的化合物对广泛的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶目标具 有抑制性质，在细胞程序死亡的细胞模型中具有良好的功效。另外， 这些化合物将具有良好的细胞穿透性和药动学性质，作为它们的效力 的结果，对牵涉天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶的疾病具有良好的功 效。\n发明的详细说明\n本发明提供新颖的化合物及其药学上可接受的衍生物，它们是有 用的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂。本发明还提供使用这些 化合物抑制天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶活性和治疗天冬氨酸特异 性半胱氨酸蛋白酶介导的疾病状态的方法。这些化合物具有通式I：\n\n其中：\nZ是氧或硫；\nR1是氢、-CHN2、-R、-CH2OR、-CH2SR、或-CH2Y；\nR是C1-12脂族基团、芳基、芳烷基、杂环基、或杂环烷基；\nY是电负性离去基团；\nR2是CO2H、CH2CO2H、或其酯、酰胺或等排物；\nR3是能够适合天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶S2亚位的基团；\nR4和R5与中间的氮一起构成单-、二-或三-环的杂环系统，具有1-6 个选自氮、氧或硫的杂原子。\n本文应当适用下列定义，除非另有指示。本文所用的术语“脂族” 表示直链或支链C1-C12烃，它们是完全饱和的或者含有一个或多个不 饱和单元。例如，适合的脂族基团包括取代或未取代的直链、支链或 环状烷基、烯基或炔基及其组合，例如(环烷基)烷基、(环烯基)烷基 或(环烷基)烯基。单独或者作为更大基团的一部分使用的术语“烷基” 指的是含有一至十二个碳原子的直链和支链。当术语烷基作为更大基 团的一部分使用时，例如芳烷基或杂芳烷基，该烷基部分将优选含有 一至六个碳。术语“卤素”表示F、Cl、Br或I。术语“芳基”指的是 具有五至十四个原子的单环或多环芳族环基，例如苯基、萘基和蒽基。 术语“杂环基”指的是饱和与不饱和的单环或多环系统，含有一个或 多个杂原子，环的大小为三至九，例如呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡 咯啉基、吡咯烷基、二氧戊环基、唑基、噻唑基、咪唑基、咪唑啉 基、咪唑烷基、吡唑基、吡唑啉基、吡唑烷基、异唑基、异噻唑基、 二唑基、三唑基、噻二唑基、吡喃基、吡啶基、哌啶基、二烷基、 吗啉基、二噻烷基、硫代吗啉基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、哌嗪基、 三嗪基、三噻烷基、吲嗪基、吲哚基、异吲哚基、二氢吲哚基、苯并 呋喃基、苯并噻吩基、吲唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、嘌呤基、 喹嗪基、喹啉基、异喹啉基、噌啉基、酞嗪基、喹唑啉基、喹喔啉基、 1，8-萘啶基、蝶啶基、奎宁环基、咔唑基、吖啶基、吩嗪基、吩噻嗪 基、或吩嗪基。“杂芳基”指的是芳香性的杂环。本发明化合物被 理解为限于实际上能够以稳定的化合物存在的那些。\n术语“碳环基团”指的是三至十四个碳的饱和单环或多环碳环系 统，它可以与芳基或杂环基稠合。实例包括环己基、环戊基、环丁基、 环丙基、二氢茚基、四氢萘基等。\n单独或者作为更大基团的一部分使用的脂族基团、烷基、芳基、 杂芳基、杂环基或碳环基指的是取代或未取代的基团。当被取代时， 这些基团可以含有一个或多个取代基。适合的取代基的实例包括卤素、 -R、-OR、-OH、-SH、-SR、保护的OH(例如酰氧基)、苯基(Ph)、取 代的Ph、-OPh、取代的-OPh、-NO2、-CN、-NH2、-NHR、-N(R)2、-NHCOR、 -NHCONHR、-NHCON(R)2、-NRCOR、-NHCO2R、-CO2R、-CO2H、-COR、-CONHR、 -CON(R)2、-S(O)2R、-SONH2、-S(O)R、-SO2NHR、-NHS(O)2R、＝O、＝S、 ＝NNHR、＝NNR2、＝N-OR、＝NNHCOR、＝NNHCO2R、＝NNHSO2R、或＝NR，其中 R是脂族基团或取代的脂族基团。\n杂环上可取代的氮可以是可选被取代的。氮上适合的取代基包括 R、COR、S(O)2R和CO2R，其中R是脂族基团或取代的脂族基团。\n氮和硫可以是它们的氧化形式，氮还可以是季铵形式。\n术语“电负性离去基团”具有本领域技术人员已知的定义(参见 March，Advanced Organic Chemistry(高等有机化学)，第4版，John Wiley&Sons，1992)。电负性离去基团的实例包括卤素，例如F、Cl、 Br、I，芳基、烷基磺酰氧基、三氟甲磺酰氧基、OR、SR、-OC＝O(R)、 -OPO(R6)(R7)，其中R是脂族基团、芳基、芳烷基、碳环基、烷基碳环 基、杂环基、或烷基杂环基；R6和R7独立地选自R或OR。\n当R2基团是酯或酰胺的形式时，本化合物经过代谢裂解为相应的 羧酸，它们是活性天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂。因为它们 经历代谢性裂解，所以酯或酰胺基团的精确性质不是实施本发明的关 键。R2基团的结构可以从相对简单的二乙基酰胺到甾族酯。R2羧酸酯 的实例包括但不限于C1-12脂族基团、例如C1-6烷基或C3-10环烷基，芳基、 例如苯基，芳烷基、例如苄基或苯乙基，杂环基或杂环基烷基的酯。 适合的R2杂环基环的实例包括但不限于具有一或两个杂原子的5-6元 杂环基环，例如哌啶基、哌嗪基或吗啉基。\nR2羧酸酰胺可以是伯、仲或叔酰胺。酰胺氮上适合的取代基包括 但不限于一个或多个基团，独立地选自上述关于R2酯醇的脂族基团、 芳基、芳烷基、杂环基或杂环基烷基。同样，其他前体药物也包括在 本发明的范围内。参见Bradley D.Anderson，“Prodrugs for Improved CNS Delivery”(提高CNS释放的前体药物)，Advanced Drug Delivery Reviews(药物释放进展评论)(1996)，19，171-202。\nR2羧酸、酯和酰胺的等排物或生物等排物产生于一个原子或原子 团的交换，产生生物学性质与母体羧酸或酯相似的新化合物。生物等 排置换可以是以物理化学或拓扑学为基础的。关于羧酸的等排置换的 实例是CONHSO2(烷基)，例如CONHSO2Me。\nR3可以是任意能够适合天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶S2-亚位 的基团。从已经见诸报道的很多天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制 剂已知这类基团(参见WO 91/15577、WO 93/05071、WO 99/18781、 WO 99/47154、WO 00/023421、WO 97/24339、EP 618223、WO 98/16502， 所有这些均如上所述)。此外，包括S-2亚位的若干天冬氨酸特异性 半胱氨酸蛋白酶的结构是已知的。关于天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白 酶结构的参考文献包括如下：Blanchard H.等，J.Mol.Biol.(分 子生物学杂志)302(1)，9-16(2000)；Wei Y.等，Chem.Biol.(化 学与生物学)7(6)：423-32(2000)；Lee D.等，J.Biol.Chem.(生 物化学杂志)275(21)：16007-14(2000)；Blanchard H.等， Structure Fold Res.(结构折叠研究)7(9)：1125-33(1999)； Okamoto Y.等，Chem.Pharm.Bull.(化学与药学通报)(Tokyo)47(1)： 11-21(1999)；Margolin N.等，J.Biol.Chem.(生物化学杂志) 272(11)：7223-8(1997)；Walker NP等，Cell(细胞)78(2)：343-52 (1994)；和Wilson KP等，Nature(自然)370(6487)：270-5(1994)。\n一种基团是否适合S-2亚位将取决于所考虑的特定天冬氨酸特异 性半胱氨酸蛋白酶。亚位的大小将从小的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋 白酶-3S-2亚位到相对大的亚位，前者允许至多C4脂族基团，后者允 许分子量高达约140道尔顿的基团，例如萘基。R3基团的大小以及电 性将影响抑制剂的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶选择性。鉴于上述 参考文献，本领域技术人员能够容易地确定一种基团是否能够可取地 适合天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶的S-2亚位，例如采用标准的分 子建模程序(molecular modeling programs)，例如Quanta或 Macromodel。\nR3基团包括选自下列的这些：氢、天然α-氨基酸的侧链、或分子 量至多约140道尔顿的取代或未取代的基团，选自脂族基团、芳基、 芳烷基、杂环基和杂环基烷基。R3脂族基团的实例包括甲基、乙基、 丙基、异丙基、环丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、环丁基、 戊基、环戊基、己基和环己基。R3芳基的实例包括苯基、茚基和萘基。 R3杂环基的实例包括吡咯烷基、吡咯啉基、咪唑烷基、咪唑啉基、吡 唑啉基、吡唑烷基、哌啶基、吗啉基、硫代吗啉基、哌嗪基、高哌啶 基和奎宁环基。R3杂芳基的实例包括呋喃基、噻吩基、吡咯基、唑 基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、异唑基、异噻唑基、二唑基、呋 咱基、三唑基、噻二唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪 基、吲哚基、异吲哚基、二氢吲哚基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、吲 唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、嘌呤基、喹啉基、异喹啉基、喹嗪 基、噌啉基、酞嗪基、喹唑啉基、喹喔啉基、萘啶基、蝶啶基、苯并 二氢吡喃基和异苯并二氢吡喃基。每个基团可以含有一个或多个如上 所述的取代基。\nR4和R5与中间的氮一起构成具有1-6个杂原子、优选1-4个杂原 子的单-、二-或三-环的杂环系统。这类环包括取代或未取代的吲哚、 异吲哚、二氢吲哚、吲唑、嘌呤、二氢吡啶、苯并咪唑、咪唑、咪唑 啉、吡咯、吡咯烷、吡咯啉、吡唑、吡唑啉、吡唑烷、三唑、哌啶、 吗啉、硫代吗啉、哌嗪、咔唑、吩噻嗪、吩嗪、二氢吩嗪、二氢噌 啉、二氢喹喔啉、四氢喹啉、四氢异喹啉、二氢萘啶、四氢萘啶、二 氢吖啶、5H-二苯并[b，f]氮杂、10，11-二氢-5H-二苯并[b，f]氮杂、 β-咔啉、吡啶并[4，3-b]吲哚、2，3，9-三氮杂芴、9-硫杂-2，10-二氮杂 蒽、3，6，9-三氮杂芴、噻吩并[3，2-b]吡咯、或二氢菲啶。R4或R5上适 合的取代基包括一个或多个基团，独立地选自卤素、-R、-OR、-OH、 -SH、-SR、保护的OH(例如酰氧基)、苯基(Ph)、取代的Ph、-OPh、 取代的-OPh、-NO2、-CN、-NH2、-NHR、-N(R)2、-NHCOR、-NHCONHR、 -NHCON(R)2、-NRCOR、-NHCO2R、-CO2R、-CO2H、-COR、-CONHR、-CON(R)2、 -S(O)2R、-SONH2、-S(O)R、-SO2NHR、或-NHS(O)2R，其中每个R独立 地选自脂族基团或取代的脂族基团。\n其中R2是COOH的本发明化合物是γ-酮酸，它们可以以开环形式1 或环化半缩酮形式2存在于溶液中。本文两种异构型之一的表示法表 示包括另一种。类似地，环化作用还可以发生在R2是CH2COOH的情况 下，当本文代表开环形式时，环化异构体也被理解为包括在内。\n\n同样，对本领域技术人员来说显而易见的是，某些本发明化合物 可以存在互变异构形式或水合形式，所有这类形式的化合物都在本发 明的范围内。除非另有规定，本文所示结构也表示包括该结构的所有 立体化学形式；也就是关于每个不对称中心的R与S构型。因此，本 发明化合物的单一立体化学异构体以及对映体与非对映体混合物都在 本发明的范围内。除非另有规定，本文所示结构也表示包括仅在一个 或多个富含同位素的原子上有区别的化合物。例如，具有该结构并且 氢被氘或氚代替或者碳被富含13C或14C的碳代替的化合物也在本发明 的范围内。\n本发明的一种实施方式涉及具有一个或多个、优选全部下列特征 的化合物：\n(i)Z是氧。\n(ii)R1是氢、-R、-CH2OR、-CH2SR或-CH2Y。更优选地，R1是-CH2OR、 -CH2SR或-CH2Y。进而更优选的R1是-CH2Y。最优选地，R1是-CH2F。\n(iii)R2是CO2H或其酯、酰胺或等排物。\n(iv)R3是分子量至多约140道尔顿的基团，例如脂族基团或芳烷 基。更优选地，R3是C1-C4烷基，它是适合一些天冬氨酸特异性半胱氨 酸蛋白酶S2亚位的基团。\n(v)R4和R5与中间的氮一起构成单环、二环或三环的杂环基或杂 芳基环系，其中该系统的每个环具有5-7个环原子。\n本发明化合物的关键特征是由R4和R5与中间的氮一起构成的杂环 系统。二环或三环的杂环基或杂芳基环优选于单环。因此，优选的实 施方式涉及具有一个或多个、优选全部下列特征的化合物：(i)Z是 氧；(ii)R1是氢、-R、-CH2OR、-CH2SR或-CH2Y，更优选地，R1是-CH2OR、 -CH2SR或-CH2Y，更优选地，R1是-CH2Y，最优选地，R1是-CH2F；(iii) R2是CO2H或其酯、酰胺或等排物；(iv)R3是分子量至多约140道尔顿 的基团，例如脂族基团或芳烷基，更优选为C1-C4烷基；和/或(v)R4 和R5与中间的氮一起构成二环或三环的杂环基或杂芳基环系，其中该 系统的每个环具有5-7个环原子。\n优选的单环实例包括三唑、哌啶、吗啉、硫代吗啉、咪唑、吡咯 烷、吡唑和哌嗪。优选的二环实例包括吲哚、异吲哚、二氢吲哚、吲 唑、苯并咪唑、噻吩并[3，2-b]吡咯、二氢喹喔啉、二氢噌啉、二氢萘 啶、四氢萘啶、四氢喹啉和四氢异喹啉，最优选为吲哚或异吲哚。优 选的三环实例包括咔唑、吩噻嗪、β-咔啉、吡啶并[4，3-b]吲哚、2，3，9- 三氮杂芴、9-硫杂-2，10-二氮杂蒽、3，6，9-三氮杂芴、吩嗪、二苯 并氮杂、二氢-二苯并氮杂、二氢吩嗪、二氢吖啶或二氢菲啶，最 优选为咔唑、吩噻嗪或二氢菲啶。\n化合物I的具体实例如表1所示。\n表1：式I化合物(Z是氧)的实例\n\n\n\n\n\n\n\n\n\n在评价很多R4-N-R5杂环之后，发现其中末端的环基本上共面的三 环化合物惊人地显示比无环类似物或其他基本上不共面的三环系统最 优异广泛的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶活性。当三环系统中间的 环是5-或6-元环时，可以实现这种基本共面性，例如咔唑或吩噻嗪环。\n此外，这些基本上共面的三环系统以及诸如吲哚和二氢吲哚等二 环系统赋予次优异广泛的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶活性，对应 的化合物中R4-N-R5杂环是单环的，例如哌啶、哌嗪或吗啉。\n因此，本发明的优选实施方式涉及这样的式I化合物，其中R4-N-R5 是三环系统，具有1-6个杂原子，优选1-4个杂原子，选自氮、氧或 硫，其中该环系末端的环具有5-7个环原子，中间的环具有5或6个 环原子。\n这种实施方式的一方面涉及式II化合物：\n\n其中X是化学键、-S-、-O-、-CH2-或-NH-，Z、R1、R2和R3如上所述。\n若X是-CH2-，则每个亚甲基的氢都可以可选和独立地被-OR、-OH、-SR、 保护的OH(例如酰氧基)、-CN、-NH2、-NHR、-N(R)2、-NHCOR、-NHCONHR、 -NHCON(R)2、-NRCOR、-NHCO2R、-CO2R、-CO2H、-COR、-CONHR、-CON(R)2、 -S(O)2R、-SONH2、-S(O)R、-SO2NHR、-NHS(O)2R、＝O、＝S、＝NNHR、＝NNR2、 ＝N-OR、＝NNHCOR、＝NNHCO2R、＝NNHSO2R、或＝NR代替，其中R是C1-4脂 族基团。若X是-NH-，则NH氢可以被烷基、CO(烷基)、CO2(烷基)或 SO2(烷基)代替。优选的R1、R2和R3如上所述。\n本发明的化合物一般可以按照本领域技术人员已知有关类似化合 物的方法加以制备，如下通用流程和后面的制备例所述。\n流程I\n\n试剂：(a)R5-N＝C＝Z(2)；(b)NaOH/THF/H2O；(c)EDC/DMAP/HOBt； (d)i.Dess-Martin高碘烷，ii.TFA/DCM\n上述流程I显示获得其中R4是氢的化合物的合成途径。异氰酸酯 或异硫氰酸酯2与乳酸衍生物1的反应生成氨基甲酸酯3。利用碱、 或者当酯是叔丁基时利用三氟乙酸水解3的酯基，得到酸4，然后与 氨基醇5偶联。根据R1和R2的性质，可以使用氨基酮代替氨基醇，这 样避免随后的氧化步骤。在其中R1是CH2F的氟甲基酮的情况下，氨基 醇5可以按照Revesz等，Tetrahedron Lett.(四面体快报)，1994， 35，9693的方法获得。最后，氧化化合物6中的羟基，根据R2的性质 适当处理所得化合物。例如，如果产物I需要R2是羧酸，那么6中的 R2优选为酯，流程的最后一步是水解。\n起始的异氰酸酯或异硫氰酸酯1是商业上可得到的或者可以这样 制备，在碱，例如三乙胺的存在下，使胺与光气或光气等价物(或硫 光气，用于制备异硫氰酸酯)反应。乳酸酯衍生物是商业上可得到的 或者可以通过氨基酸与重氮化剂、例如NaNO2的反应加以制备。\n流程II\n\n试剂：(a)CDI/THF；(b)MeOTf/CH2Cl2；(c)R4R5NH(8)/THF\n上述流程II显示获得本发明化合物I的合成途径，其中R4是烷基 或者R4和R5一起构成环。乳酸酯衍生物2与1，1’-羰基二咪唑(CDI) 的反应得到咪唑羧酸酯7。7被三氟甲磺酸甲酯甲基化，然后与胺8反 应(参见J.Med.Chem.(药物化学杂志)，(1996)，39，982)，得到 中间体3。上述流程I显示3如何可以转化为I。\n流程III\n\n试剂：(a)COCl2/CH2Cl2；(b)1/THF\n上述流程III显示获得本发明化合物I的另外可供选择的合成途 径，其中R4是烷基或者R4和R5一起构成环。用光气处理胺8，得到氨 基甲酰氯中间体9。9与乳酸酯衍生物1的反应得到中间体3。\n流程IV\n\n试剂：(a)Cl3COC(O)Cl/THF；(b)R4R5NH(8)，NaOH，Bu4NBr\n上述流程IV显示获得本发明化合物的合成途径，其中R4是氢或烷 基或者R4和R5一起构成环。羟基酯1与光气或光气等价物、例如二光 气或三光气的反应得到氯甲酸酯中间体10。10与胺8的反应得到中间 体3。\n本发明的化合物被设计用来抑制天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白 酶。因此，可以测定本发明化合物抑制细胞程序死亡、抑制IL-1β的 释放或直接抑制天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶活性的能力。每种活 性的测定法如下试验部分所述，也是本领域已知的。\n本发明的一种实施方案涉及组合物，包含式I化合物或其药学上 可接受的盐和药学上可接受的载体。\n如果在这些组合物中采用本发明化合物的药学上可接受的盐，那 么这些盐优选是从无机或有机酸和碱衍生的。这类酸盐包括如下：乙 酸盐、己二酸盐、藻酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸 氢盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环戊烷丙酸盐、 二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、 甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘 酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、 烟酸盐、草酸盐、扑酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、苦 味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯 磺酸盐和十一烷酸盐。碱盐包括铵盐，碱金属盐、例如钠和钾盐，碱 土金属盐、例如钙和镁盐，有机碱的盐、例如二环己胺和N-甲基-D- 葡糖胺盐，氨基酸的盐、例如精氨酸和赖氨酸盐等。\n而且，含有碱性氮的基团可以被下列试剂季铵化：低级烷基卤化 物，例如甲基、乙基、丙基和丁基的氯化物、溴化物和碘化物；二烷 基硫酸酯，例如二甲基、二乙基、二丁基和二戊基的硫酸酯；长链卤 化物，例如癸基、月桂基、肉豆蔻基和硬脂基的氯化物、溴化物和碘 化物；芳烷基卤化物，例如苄基和苯乙基的溴化物和其他。由此得到 水或油溶性或可分散性产物。\n用在本发明组合物和方法中的化合物还可以通过附加适当的官能 团加以修饰，以增强选择性生物学性质。这类修饰是本领域已知的， 包括增加进入给定生物系统(例如血液、淋巴系统、中枢神经系统) 的生物穿透性，增加口服可利用度，增加溶解度以便注射给药，改变 代谢和改变排泄率。\n可以用在这些组合物中的药学上可接受的载体包括但不限于离子 交换剂，氧化铝，硬脂酸铝，卵磷脂，血清蛋白质、例如人血清白蛋 白，缓冲物质、例如磷酸盐，甘氨酸，山梨酸，山梨酸钾，饱和植物 脂肪酸的偏甘油酯混合物，水，盐或电解质、例如硫酸鱼精蛋白、磷 酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐，胶体二氧化硅，三硅酸镁，聚 乙烯吡咯烷酮，纤维素基物质，聚乙二醇，羧甲基纤维素钠，聚丙烯 酸酯，蜡，聚乙烯-聚丙烯-嵌段聚合物，聚乙二醇和羊毛脂。\n按照优选的实施方式，本发明的组合物被配制成对哺乳动物、优 选人类给药。\n本发明的这类药物组合物可以通过口服、肠胃外、吸入喷雾、局 部、直肠、鼻、颊、阴道或经由植入药库给药。本文所用的术语“肠 胃外”包括皮下、静脉内、肌内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、 肝内、损伤内与颅内注射或输注技术。优选地，组合物是通过口服或 静脉内给药的。\n本发明组合物的无菌可注射形式可以是水性或油性悬液。这些悬 液可以按照本领域已知的技术加以配制，并且采用适合的分散或湿润 剂和悬浮剂。无菌可注射制剂还可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释 剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬液，例如在1，3-丁二醇中的溶液。 可以采用的可接受的载体和溶剂是水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。 另外，无菌的不挥发油按照惯例用作溶剂或悬浮介质。为此，可以采 用任意品牌的不挥发油，包括合成的甘油单-或二-酯。脂肪酸、例如 油酸及其甘油酯衍生物可用于制备注射剂，因为它们是天然的药学上 可接受的油，例如橄榄油或蓖麻油，尤其是它们的聚氧乙烯化形式。 这些油溶液或悬液还可以含有长链醇稀释剂或分散剂，例如羧甲基纤 维素或相似的分散剂，它们常用于配制药学上可接受的剂型，包括乳 剂和悬液。出于配制的目的，还可以使用其他常用的表面活性剂、例 如吐温类、司盘类和其他乳化剂或生物利用度增强剂，它们常用于制 备药学上可接受的固体、液体或其他剂型。\n本发明的药物组合物可以以任意口服可接受的剂型口服给药，包 括但不限于胶囊剂、片剂、水悬液或溶液。在口用片剂的情况下，常 用的载体包括乳糖和玉米淀粉。通常还加入润滑剂，例如硬脂酸镁。 关于以胶囊剂口服给药，有用的稀释剂包括乳糖和干燥的玉米淀粉。 当需要口用水悬液时，将活性成分与乳化及悬浮剂混合。如果需要的 话，还可以加入某些甜味剂、矫味剂或着色剂。\n作为替代选择，本发明的药物组合物可以以栓剂的形式用于直肠 给药。它们可以这样制备，将药物与适合的无刺激性赋形剂混合，后 者在室温下是固体，但是在直肠温度下是液体，因此将在直肠内熔化 而释放药物。这类材料包括可可脂、蜂蜡和聚乙二醇。\n本发明的药物组合物还可以通过局部给药，尤其当治疗目标包括 容易为局部用药接近的部位或器官时，包括眼部、皮肤或下肠道的疾 病。容易制备适合的局部制剂用于每个这些部位或器官。\n下肠道的局部用药可以借助直肠栓剂(见上)或适合的灌肠剂加 以实现。还可以使用局部透皮贴剂。\n关于局部用药，药物组合物可以被配制成适合的软膏剂，其中含 有悬浮或溶解在一种或多种载体中的活性组分。用于本发明化合物局 部给药的载体包括但不限于矿物油、液体矿脂、白矿脂、丙二醇、聚 氧乙烯、聚氧丙烯化合物、乳化蜡和水。作为替代选择，药物组合物 可以被配制成适合的洗剂或霜剂，其中含有悬浮或溶解在一种或多种 药学上可接受的载体中的活性组分。适合的载体包括但不限于矿物油、 脱水山梨醇单硬脂酸酯、聚山梨醇酯60、鲸蜡酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2- 辛基十二烷醇、苯甲醇和水。\n关于眼用，药物组合物可以被配制成在等渗的pH调节的无菌盐水 中的微粉化悬液或者优选为在等渗的pH调节的无菌盐水中的溶液，其 中含有或不含防腐剂，例如苯扎氯铵。作为替代选择，关于眼用，药 物组合物可以被配制成软膏剂，载体例如矿脂。\n本发明的药物组合物还可以通过鼻气雾剂或吸入作用给药。这类 组合物是按照药物制剂领域熟知的技术加以制备的，可以制成在盐水 中的溶液，采用苯甲醇或其他适合的防腐剂、增强生物利用度的吸收 促进剂、碳氟化合物、和/或其他常规的增溶或分散剂。\n上述组合物特别可用于涉及下列疾病的治疗性应用：IL-1介导的 疾病、细胞程序死亡介导的疾病、炎性疾病、自体免疫疾病、破坏性 骨障碍、增殖性障碍、感染性疾病、变性疾病、与细胞死亡有关的疾 病、过量饮食酒精摄入疾病、病毒介导的疾病、眼色素层炎、炎性腹 膜炎、骨关节炎、胰腺炎、哮喘、成人呼吸窘迫综合征、肾小球性肾 炎、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、硬皮病、慢性甲状腺炎、格 雷夫氏病、自体免疫性胃炎、糖尿病、自体免疫性溶血性贫血、自体 免疫性嗜中性白细胞减少、血小板减少、慢性活动型肝炎、重症肌无 力、炎性肠疾病、克罗恩氏病、牛皮癣、特应性皮炎、瘢痕形成、移 植物对宿主疾病、器官移植排斥、骨质疏松、白血病与相关疾病、脊 髓发育不良综合征、与多发性骨髓瘤有关的骨障碍、急性骨髓性白血 病、慢性骨髓性白血病、转移性黑瘤、卡波济氏肉瘤、多发性骨髓瘤、 出血性休克、脓毒症、脓毒性休克、灼伤、志贺氏菌病、阿尔茨海默 氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病、肯尼迪氏病、朊病毒病、脑缺血、 癫痫、心肌缺血、急性与慢性心脏病、心肌梗塞、充血性心力衰竭、 动脉粥样硬化、冠状动脉旁路移植、脊肌萎缩、肌萎缩性侧索硬化、 多发性硬化、与HIV有关的脑炎、老化、脱发、由中风引起的神经损 伤、溃疡性结肠炎、创伤性脑损伤、脊髓损伤、乙型肝炎、丙型肝炎、 庚型肝炎、黄热病、登革热或日本脑炎、各种形式的肝疾病、肾疾病、 polyaptic kidney disease、与幽门螺杆菌有关的胃与十二指肠溃疡 病、HIV感染、结核、和脑膜炎。化合物和组合物还可用于治疗与冠 状动脉旁路移植有关的并发症，和作为免疫疗法的组成部分，用于治 疗各种形式的癌症。\n化合物在上述组合物中的含量应当足以导致疾病严重性或天冬氨 酸特异性半胱氨酸蛋白酶活性和/或细胞程序死亡的可感知的降低，例 如可采用实施例所述测定法加以测量。\n本发明化合物还可用在保存细胞的方法中，例如可以是器官移植 所需的，或者用在保存血液制品的方法中。天冬氨酸特异性半胱氨酸 蛋白酶抑制剂的相似用途已有报道(Schierle等，Nature Medicine (天然医药)，1999，5，97)。该方法涉及用包含天冬氨酸特异性半胱 氨酸蛋白酶抑制剂的溶液处理所要保存的细胞或组织。所需天冬氨酸 特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂的量将取决于抑制剂对给定细胞类型的 有效性和防止细胞编程性细胞死亡所需的时间长度。\n按照另一种实施方式，本发明组合物可以进一步包含另一种治疗 剂。这类药物包括但不限于溶栓剂，例如组织纤溶酶原激活物和链激 酶。当使用第二种药物时，该第二种药物在给药时可以作为单独的剂 型或者作为含有本发明化合物或组合物的单一剂型的一部分。\n还应当理解，关于任意特定患者的具体剂量和治疗方案将取决于 各种因素，包括所用具体化合物的活性、年龄、体重、一般健康状况、 性别、饮食、给药时间、排泄速率、药物组合、主治医师的判断和所 治疗特定疾病的严重性。活性成分的量还将取决于特定化合物，和组 合物种的其他治疗剂，如果有的话。\n在优选的实施方式中，本发明提供治疗患有上述疾病之一的哺乳 动物的方法，包含对所述哺乳动物给以上述药学上可接受的组合物的 步骤。在这种实施方式中，如果患者还接受另一种治疗剂或天冬氨酸 特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂给药，它可以与本发明化合物一起以单 一剂型或者作为单独的剂型而被释放。当作为单独的剂型给药时，另 一种天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制剂或药物可以在包含本发明 化合物的药学上可接受的组合物的给药之前、同时或之后进行给药。\n为了更加充分地理解本发明，列出下列制备例和试验例。这些实 例仅供举例说明，决不被解释为限制发明的范围。\n合成实施例\n下列实施例提供所选择的本发明化合物的合成程序。\n实施例1\n[3S/R]-5-氟-4-氧代-3-[(S)-3-甲基-2-(咔唑-氨基甲酰氧基-丁 酰氨基)-戊酸\n\n方法A：\n(S)-2-(氯氨基甲酰氧基)-3-甲基丁酸，叔丁酯\n\n在0℃下，历经25分钟向二光气(4.55g)的THF(34ml)溶液中滴 加(S)-2-羟基-3-甲基丁酸叔丁酯(关于制备方法，参见Tetrahedron. Lett.(四面体快报)，(1993)，7409)(4.0g)与吡啶(1.82g)的THF (34ml)溶液。\n使所得混合物历经4小时温热至室温。然后通过C盐过滤混合物， 在减压下浓缩滤液。将残余物再次溶于二乙醚(200ml)，再次通过C盐 过滤。在减压下浓缩滤液，得到小标题化合物，为淡黄色油(5.27g)：1H NMR(400MHz，CDCl3)δ0.98-1.10(6H，m)，1.55(9H，s)，2.30(1H， m)，4.83(1H，m).\n方法B：\n(S)-3-甲基-2-(咔唑-氨基甲酰氧基)-丁酸，叔丁酯\n\n在0℃下，向咔唑(15.15g)的二氯甲烷(180ml)与THF(142ml)溶 液中加入颗粒状氢氧化钠(5.45g)，然后加入溴化四丁铵(2.93g)。将 所得混合物搅拌30分钟，然后历经55分钟滴加氯甲酸酯(21.41g)的 THF(81ml)溶液。然后使混合物温热至室温过夜。然后加入二氯甲烷 (1L)和水(350ml)，除去有机相。含水相然后用二氯甲烷萃取(2× 250ml)，合并有机相，用水(200ml)、盐水(200ml)洗涤，干燥(硫酸 镁)，过滤，浓缩。残余物经过快速色谱法纯化(0-5％乙酸乙酯/己烷)， 得到小标题化合物，为无色的油(29.3g)：1H NMR(400MHz，CDCl3)δ 1.15-1.23(6H，m)，1.55(9H，s)，2.52(1H，m)，5.27(1H，d)， 7.36-7.57(4H，m)，8.03(2H，d)，8.47(2H，d).\n方法C：\n(S)-3-甲基-2-(咔唑-氨基甲酰氧基)-丁酸\n\n将三氟乙酸(84ml)滴加到搅拌着的冰冷的(S)-3-甲基-2-(咔唑- 氨基甲酰氧基)-丁酸，叔丁酯(4.11g)的无水DCM(300ml)溶液中。将 混合物在0℃下搅拌2小时，然后在室温下搅拌1小时。在减压下浓 缩混合物，然后将残余物溶于无水DCM，再次在减压下除去溶剂。重 复该过程若干次，目的是除去过量的三氟乙酸。得到酸，为淡绿色胶 状物(3.30g)：1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.12-1.37(6H，m)，2.70 (1H，m)，5.47(1H，m)，7.32-7.56(4H，m)，8.00(2H，d)，8.37 (2H，d).\n方法D：\n[3S/R，4S/R]-5-氟-4-羟基-3-((S)-3-甲基-2-(咔唑)-氨基甲酰 氧基-丁酰氨基)-戊酸，叔丁酯\n\n将搅拌着的(S)-3-甲基-2-(咔唑)-氨基甲酰氧基-丁酸(3.30g)、 3-氨基-5-氟-4-羟基-戊酸叔丁酯(2.42g)、HOBt(1.58g)、DMAP (1.49g)与THF(80ml)的混合物冷却至0℃，然后加入EDC(2.24g)。 使混合物在16小时内温热至室温，然后在减压下浓缩。残余物经过快 速色谱法纯化(15-45％乙酸乙酯/己烷)，得到小标题化合物，为白色泡 沫(4.60g)：1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.09-1.50(15H，m)，2.49-2.80 (3H，m)，3.20-3.62(1H，m)，3.92-4.58(4H，m)，5.32-5.42(1H， d)，6.86(1H，brm)，7.40-7.55(4H，m)，8.02(2H，d)，8.35(2H， m)；19F NMR(376MHz，CDCl3)-229.6，-229.7，-230.8，-231.4.\n方法E：\n[3S/R]-5-氟-4-氧代-3-[(S)-3-甲基-2-(咔唑-氨基甲酰氧基-丁 酰氨基)-戊酸，叔丁酯\n\n在0℃下，将搅拌着的[3S/R，4S/R]-5-氟-4-羟基-3-((S)-3-甲 基-2-(咔唑)-氨基甲酰氧基-丁酰氨基)-戊酸，叔丁酯(4.60g)的无水 DCM(100ml)溶液用1，1，1-三乙酰氧基-1，1-二氢-1，2-苯并二氧杂环 戊烯-3(1H)-酮(4.68g)处理。将所得混合物在0℃下保持2小时，用 乙酸乙酯稀释，然后倒入饱和含水碳酸氢钠与饱和含水硫代硫酸钠的 1∶1混合物中。除去有机层，含水层用乙酸乙酯反萃取。合并有机萃 取液，干燥(硫酸镁)，浓缩。残余物经过快速色谱法纯化(10-40％ 乙酸乙酯/己烷)，得到小标题化合物，为白色固体(3.96g)：1H NMR (400MHz，CDCl3)δ1.85(4.5H，s)，1.94-1.31(6H，m)，1.36(4.5H， s)，2.59(1H，m)，2.70-3.11(2H，m)，4.91-5.31(3H，m)， 5.40-5.49(1H，m)，7.25(1H，brs)，7.42(2H，m)，7.53(2H，m)， 8.04(2H，m)，8.35(2H，m)；19F NMR(376MHz，CDCl3)-232.0， -232.1.\n实施例1A\n[3S/R]-5-氟-4-氧代-3-[(S)-3-甲基-2-(咔唑)-氨基甲酰氧基- 丁酰氨基]-戊酸\n\n利用与上述方法C相似的方法制备它。分离产物，为白色固体(88％ 最后一步)：IR(固体)1721.2，1695.6，1664.9，1449.8，1378.1， 1198.9，1040.1，758.5cm-1；1H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ1.10(6H， brm)，2.41(1H，m)，2.54-3.04(2H，m)，4.31-4.82(1.6H，m，CH2F)， 5.10-5.41(2.4H，m)，7.45(2H，m)，7.57(2H，m)，8.22(2H，m)， 8.30(2H，m)，8.51-8.99(1H，brm)，12.60(1H，brs)；13C NMR (100MHz，d6-DMSO)δ19.0，19.1，19.3，30.4，30.5，30.6，32.9， 34.5，34.7，47.3，47.4，52.0，52.3，80.4，80.8，83.2，83.4，83.4， 85.1，85.2，116.2，116.3，124.1，125.7，125.9，137.9，151.7， 151.9，152.0，168.8，169.0，169.2，172.0，172.1，173.1，173.2， 202.2，202.4，202.5，202.6；19F NMR(376MHz，d6-DMSO)-226.6(t)， -226.8(t)，-230.5(t)，-230.9(t)，-232.9(t)，-233.0(t)；MS (ESI+ve)443(M+H).\n实施例2\n[3S/R]-5-氟-4-氧代-3-[(S)-3-甲基-2-(3-氯咔唑)-氨基甲酰氧 基-丁酰氨基]-戊酸\n\n利用与上述方法A-E相似的方法制备它。分离产物，为白色固体 (99％最后一步)：IR(固体)1721.2，1690.5，1664.9，1444.7，1367.9， 1209.1，1040.1cm-1；1H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ1.02-1.13(6H， m)，2.40(1H，m)，2.50-2.99(2H，m)，4.30-4.85(1.6H，m)， 5.09-5.48(2.4H，m)，7.48(1H，m)，7.56-7.66(2H，m)，8.20-8.32 (3H，m)，8.39(1H，m)，8.55-8.99(1H，brm)，12.5(1H，br)；13C NMR(100MHz，d6-DMSO)δ18.1，18.9，19.1，30.4，30.5，33.0，34.5， 34.7，47.4，52.0，52.3，80.6，80.9，81.1，83.4，83.43，85.1， 85.2，103.8，104.0，117.0，119.3，121.3，122.3，124.3，124.7， 127.2，127.4，127.9，128.5，136.5，138.4，151.5，151.6，151.7， 168.7，168.9，169.0，169.1，172.0，172.1，173.1，173.2，202.2， 202.4，202.44，202.8(C)；19F NMR(376MHz，d6-DMSO)-226.6(t)， -226.8(t)  -230.4(t)，-230.9(t)，-231.0(t)，-232.8(t)， -232.84(t)，-232.9(t)；MS(ESI+ve)477(M+H).\n实施例3\n[3S/R]-5-氟-4-氧代-3-[(S)-3-甲基-2-(3，6-二氯咔唑)-氨基甲 酰氧基-丁酰氨基]-戊酸\n\n利用与上述方法A-E相似的方法制备它。分离产物，为白色固体 (99％最后一步)：IR(固体)1721.2，1659.7，1470.3，1434.4，1367.9， 1209.1，1075.9，1045.2cm-1；1H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ0.98-1.14 (6H，m)，2.30-2.50(1H，m)，2.50-3.01(2H，m)，4.29-4.84(1.5H， m)，5.09-5.41(2.5H，m)，7.66(2H，m)，8.19-8.29(2H，m)，8.45 (2H，m)，8.57-8.99(1H，brm)，12.60(1H，br，OH)；13C NMR(100MHz， d6-DMSO)δ15.5，19.1，19.2，30.4，30.45，30.6，33.0，34.5，34.7， 47.3，47.5，52.0，52.3，80.8，81.1，81.2，83.4，84.43，85.1， 85.2，117.8，121.1，126.3，128.4，128.7，136.9，151.2，151.4， 168.6，168.8，168.9，168.95，172.0，172.04，173.1，173.14， 202.2，202.3，202.4，202.6；19F NMR(376MHz，d6-DMSO)-226.6(t)， -226.8(t)，-230.4(t)，-230.8(t)，-232.8(t)，-232.9(t)；MS (ESI+ve)511/513(M+H).\n实施例4\n[3S/R]-5-氟-4-氧代-3-[(S)-3-甲基-2-(2-氯咔唑)-氨基甲酰氧 基-丁酰氨基]-戊酸\n\n方法F：\n4’-氯-2-硝基联苯\n\n在氮下，向2-溴硝基苯(646mg)的THF(17ml)溶液中加入四(三苯 膦)合钯(0)(900mg)。将所得混合物在室温下搅拌20分钟，然后加入 4-氯苯基硼酸(1.0g)的乙醇(17ml)溶液，将所得混合物在室温下搅拌 1小时。然后加入2M碳酸钠(17ml)，将反应加热至回流达2小时。然 后使混合物冷却，在减压下浓缩。将残余物溶于乙酸乙酯(100ml)，除 去含水层。将有机相用盐水(20ml)洗涤，干燥(硫酸镁)，过滤，浓 缩。残余物经过快速色谱法纯化(0-10％乙酸乙酯/己烷)，得到小标题 化合物，为黄色固体(646mg)：1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.24-7.31 (2H，m)，7.41-7.47(3H，m)，7.52(1H，m)，7.65(1H，m)，7.90 (1H，d).\n方法G：\n2-氯咔唑\n\n将4’-氯-2-硝基联苯(640mg)与亚磷酸三乙酯(1.9ml)的混合物在 150℃下加热3小时。然后使混合物冷却，经过快速色谱法纯化(5-10％ 乙酸乙酯/己烷)，得到小标题化合物，为白色固体(382mg)：1H NMR (400MHz，d6-DMSO)δ7.12-7.23(2H，m)，2.40(1H，m)，7.46-7.54 (2H，m)，8.12(2H，d).\n实施例4\n[3S/R]-5-氟-4-氧代-3-[(S)-3-甲基-2-(2-氯咔唑)-氨基甲酰氧 基-丁酰氨基]-戊酸\n\n利用与上述方法A-E相似的方法制备它。分离产物，为白色固体 (99％最后一步)：IR(固体)1731.4，1695.6，，1664.9，1424.2， 1367.9，1326.9，1193.7，1045.2cm-1；1H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ 1.58-1.70(6H，m)，2.85-3.10(1H，m)，3.10-3.54(2H，m)， 4.85-5.39(1.4H，m)，5.65-5.98(2.6H，m)，7.94-8.20(3H，m)， 8.73-8.90(4H，m)，9.10-9.56(1H，brm)，13.2(1H，br)；13C NMR (100MHz，d6-DMSO)δ17.7，17.9，19.0，19.1，19.2，30.4，30.5， 33.0，34.5，34.7，52.0，52.3，80.6，80.9，81.1，83.4，83.43， 85.1，85.2，104.0，117.1，121.0，122.1，124.2，124.4，124.6， 124.8，129.0，132.0，138.2，138.4，151.6，151.61，168.7，168.9， 169.0，172.0，172.05，202.4，202.42，202.6；19F NMR(376MHz， d6-DMSO)-225.99(t)，-226.2(t)，-229.8(t)，-230.3(t)，-232.3 (t)，-232.4(t)；MS(ESI+ve)477(M+H).\n实施例5\n[3S/R]-5-氟-4-氧代-3-[(S)-3-甲基-2-(2，3-二氯咔唑)-氨基甲 酰氧基-丁酰氨基]-戊酸\n\n利用与上述方法A-E相似的方法制备它。利用与方法F和G所述 相似的方法制备2，3-二氯咔唑。分离产物，为白色固体(98％最后一步)： IR(固体)1721.2，1659.7，1434.4，1367.9，1204.0，1188.6， 1045.2cm-1；1H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ1.04-1.14(6H，m)， 2.29-2.48(1H，m)，2.53-3.00(2H，m)，4.30-4.84(1.7H，m)， 5.09-5.41(2.3H，m)，7.49(1H，m)，7.63(1H，m)，8.20-8.33(2H， m)，8.42-8.49(1H，m)，8.62(1H，m)，8.80-9.00(1H，brm)，12.5 (1H，br)；13C NMR(100MHz，d6-DMSO)δ17.7，17.9，19.0，19.1， 30.5，33.0，34.5，34.7，47.5，52.0，52.3，80.8，81.0，81.2，83.4， 85.1，85.2，116.3，117.9，121.5，122.4，124.1，124.6，126.1， 126.6，129.0，129.7，136.8，138.5，151.4，151.45，168.6，168.9， 172.0，172.03，173.1，202.2，202.3，202.4，202.5；19F NMR (376MHz，d6-DMSO)226.6(t)，-226.8(t)，-230.3(t)，-230.8(t)， -232.8(t)，-232.9(t)；MS(ESI+ve)513(M+H).\n实施例6\n[3S/R]-5-氟-4-氧代-3-[(S)-3-甲基-2-(2-三氟甲基)-咔唑-氨 基甲酰氧基-丁酰氨基]-戊酸\n\n利用与上述方法A-E相似的方法制备它。利用与方法F和G所述 相似的方法制备2-三氟甲基咔唑。分离产物，为白色固体(85％最后一 步)：IR(固体)1731.4，1695.6，1695.7，1434.4，1321.8，1198.9， 1122.1，1065.7cm-1；1H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ1.06-1.15(6H， m)，2.42(1H，m)，2.50-3.01(2H，m)，4.29-4.83(1.6H，m)， 5.08-5.42(2.4H，m)，7.53(1H，m)，7.68(1H，m)，7.83(1H，m)， 8.29-8.40(2H，m)，8.48(1H，m)，8.64(1H，m)，8.80-9.01(1H， m)，12.60(1H，brs)；13C NMR(100MHz，d6-DMSO)δ17.4，17.6，19.0， 19.1，30.4，31.0，32.9，34.5，34.7，52.0，52.3，80.7，80.9，81.1， 81.1，83.4，85.1，113.3，116.3，120.7，1 20.9，123.6，124.4， 126.2，127.2，127.5，127.8，128.1，128.9，137.2，138.9，151.6， 168.6，169.0，172.0，202.2，202.3，202.4，202.6；19F NMR(376MHz， d6-DMSO)-60.4(s)，-226.6(t)，-226.8(t)，-229.9(t)，-230.4 (t)，-231.0(t)，-232.9(t)，233.0(t)；MS(ESI+ve)511(M+H).\n实施例7\n[3S/R]-5-氟-4-氧代-3-[(S)-3-甲基-2-(2-甲基咔唑)-氨基甲酰 氧基-丁酰氨基]-戊酸\n\n利用与上述方法A-E相似的方法制备它。分离产物，为白色固体 (90％最后一步)：IR(固体)1726.3，1700.7，1664.9，1552.2，1460.0， 1552.2，1460.0，1367.9，1332.0，1209.1，1193.7，1040.1cm-1；1H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ1.01-1.19(6H，m)，2.30-3.00(6H，m)， 4.29-4.85(1.5H，m)，5.11-5.52(2.5H，m)，7.29(1H，m)，7.45 (1H，m)，7.55(1H，m)，8.05-8.18(3H，m)，8.27(1H，m)，8.50-9.10 (1H，brm)，12.50(1H，brs)；13C NMR(100MHz，d6-DMSO)δ17.7， 18.0，19.0，19.1，19.2，22.2，30.4，30.5，30.6，30.6，33.0，34.5， 34.7，47.4，52.0，52.3，52.7，80.3，80.6，80.7，80.8，83.2.83.4， 83.5，85.2，85.2，103.8，104.0，116.2，116.3，116.6，120.3， 120.4，123.4，124.0，125.2，125.8，127.3，137.5，137.9，138.2， 151.7，151.9，151.9，168.8，169.0，169.2，169.2，172.0，172.1， 173.1，173.2，202.3，202.4，202.5，202.6；19F NMR(376MHz， d6-DMSO)-226.55(t)，-226.76(t)，-230.43(t)，-230.89(t)， -232.84(t)，-232.97(t).\n实施例8\n[3S/R]-5-氟-4-氧代-3-[(S)-2-(咔唑-氨基甲酰氧基)-丁酰氨 基]-戊酸\n\n利用与上述方法A-E相似的方法制备它。如方法A所述从(S)-2- 羟基丁酸，叔丁酯制备氯甲酸酯。分离产物，为白色固体(90％最后一 步)：IR(固体)1716.1，1654.6，1449.8，1372.9，1326.9，1204.0， 1050.4，1029.9cm-1；1H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ1.03-1.12(3H， m)，1.96-2.15(2H，m)，2.50-3.01(2H，m)，4.31-4.82(1.8H，m)， 5.11-5.43(2.2H，m)，7.45(2H，m)，7.59(2H，m)，8.18-8.32(4H， m)，8.58-9.05(1H，brm)，12.60(1H，brs)；13C NMR(100MHz， d6-DMSO)δ9.8，9.9，9.94，24.9，25.1，25.2，33.0，34.6，34.7， 47.4，52.0，52.3，77.1，77.3，77.4，77.45，83.4，83.5，85.2， 85.22，116.3，120.6，124.0，125.7，127.9，137.9，151.5，151.7， 169.5，169.8，172.0，172.1，173.1，202.3，202.4，202.5，202.6； 19F NMR(376MHz，d6-DMSO)-226.6(t)，-226.8(t)，-230.4(t)， -231.0(t)，232.9(t)，-233.0(t).\n实施例9\n[3S/R]-5-氟-4-氧代-3-[(S)-3，3-二甲基-2-(咔唑-氨基甲酰氧 基)-丁酰氨基]-戊酸\n\n利用与上述方法A-E相似的方法制备它。如方法A所述从(S)-2- 羟基-3，3-二甲基丁酸，叔丁酯(关于制备方法参见Tetrahedron. Lett.(四面体快报)，(1993)，7409)制备氯甲酸酯。分离产物，为白 色固体(94％最后一步)：IR(固体)1782.7，1721.2，1526.6，1444.7， 1373.0，1332.0，1301.3，1198.9，1117.0，1040.1，753.3cm-1；1H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ1.15(9H，s)，2.50-2.98(2H，m)， 4.29-4.88(1.5H，m)，4.97-5.45(2.5H，m)，7.45(2H，m)，7.59 (2H，m)，8.23(2H，m)，8.33(2H，m)，8.50-8.97(1H，brm)，12.50 (1H，brs)；13C NMR(100MHz，d6-DMSO)δ27.3，33.4，34.5，34.6， 34.7，34.8，35.1，52.5，52.9，83.5，83.9，84.0，84.1，84.3，85.7， 85.73，116.7，116.8，121.2，124.6，124.64，126.2，128.4，138.4， 152.2，152.4，152.5，168.4，168.7，168.8，168.9，172.6，172.65， 173.6，202.6，202.8，202.9，203.0；19F NMR(376MHz，d6-DMSO) -226.5(t)，-226.6(t.)，-230.9(t)，-231.5(t)，-232.9(t)， -233.0(t)；MS(ESI+ve)457(M+H).\n实施例10\n[3S/R]-5-氟-4-氧代-3-[(S)-2-(2-氯咔唑-氨基甲酰氧基-丁酰 氨基)-戊酸\n\n利用与上述方法A-E相似的方法制备它。如方法A所述从(S)-2- 羟基丁酸，叔丁酯制备氯甲酸酯。如方法F-G所述制备2-氯咔唑。分 离产物，为白色固体(77％最后一步)：IR(固体)1733.08，1699.89， 1662.97，1448.18，1423.38，1369.84，1332.48，1215.16，1199.62， 1052.26，1033.17，764.57，747.53，720.08，651.85cm-1；1H NMR (400MHz，d6-DMSO)δ1.06-1.10(3H，m)，2.01-2.09(2H，m)， 2.53-2.98(2H，m)，4.34-4.78(1.6H，m)，5.14-5.39(2.4H，m)， 7.45-7.61(3H，m)，8.24-8.31(4H，m)，8.63-8.99(1H，brm)，12.50 (1H，brs)；13C NMR(100MHz，d6-DMSO)δ9.7，23.7，25.0，31.3， 34.6，34.8，52.0，52.3，77.4，77.6，83.4，85.2，110.9，111.6， 116.2，116.3，119.0，119.4，120.7，120.9，121.9，122.1，124.2， 124.3，124.6，124.8，126.3，128.3，130.2，132.0，138.1，138.4， 151.3，169.6，172.1；19F NMR(376MHz，d6-DMSO)-226.60(t)， -226.83(t)，-230.34(t)，-231.88(t)，-232.84(t)，-232.99(t).\n实施例11\n[3S/R]-5-氟-4-氧代-3-[(S)-3-甲基-2-(吲哚)-氨基甲酰氧基- 丁酰氨基]-戊酸\n\n利用与上述方法A-E相似的方法制备它。分离产物，为白色固体 (92％最后一步)：IR(固体)1731.4，1664.9，1536.8，1454.9，1393.5， 1326.9，1239.8，1035.0cm-1；1H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ1.30-1.62 (6H，m)，2.79(1H，m)，3.00-3.48(2H，m)，4.77-5.04(1.6H，m)， 5.42-5.88(2.4H，m)，7.29(1H，m)，7.70-7.90(2H，m)，8.10-8.31 (2H，m)，8.51-8.63(1H，m)，8.91-9.45(1H，m)，13.O(1H，brs)； 13C NMR(100MHz，d6-DMSO)δ15.5，17.3，17.6，18.9，19.2，30.6， 32.9，34.5，34.7，47.4，52.0，52.3，65.3，80.0，80.3，80.5，83.4， 83.41，85.1，85.2，104.02，108.7，108.71，108.8，114.9，122.0， 123.5，125.0，126.3，130.5，135.0，150.4，168.8，169.0，169.1， 169.14，172.0，172.1，173.1，202.2，202.4，202.5，202.6；19F NMR (376MHz，d6-DMSO)-226.1(t)，-226.3(t)，-230.0(t)，-230.5 (t)，232.3(t)，-232.4(t)，-232.5(t)，-232.6(t)；MS(ESI+ve) 393(M+H).\n实施例12\n[3S/R]-5-氟-4-氧代-3-[(S)-3-甲基-2-(吩噻嗪)-氨基甲酰氧基 -丁酰氨基]-戊酸\n\n方法H：\n(S)-3-甲基-2-(吩噻嗪)-氨基甲酰氧基-丁酸，叔丁酯\n\n在0℃下，向搅拌着的(S)-2-羟基-3-甲基丁酸叔丁酯(关于制备 方法参见Tetrahedron.Lett.(四面体快报)，(1993)，7409)(300mg) 的THF(5ml)溶液中加入氢化钠(60％矿物油分散液，72mg)。将所得混 合物搅拌30分钟，然后加入吩噻嗪-10-碳酰氯(450mg)，使混合物历 经12小时温热至环境温度。反应混合物然后用乙酸乙酯(15ml)和水 (3ml)稀释。分离有机相，含水相用2×5ml乙酸乙酯萃取。合并有机 相，然后用盐水(5ml)洗涤，干燥(硫酸镁)，过滤，浓缩。残余物经 过快速色谱法纯化(0-10％乙酸乙酯/己烷)，得到小标题化合物，为无 色的油(528mg)：1H NMR(400MHz，CDCl3)δ0.75-0.96(6H，m)，1.58 (9H，s)，2.20(1H，m)，4.86(1H，d)，7.12-7.45(6H，m)，7.70 (2H，m).\n(S)-3-甲基-2-(吩噻嗪)-氨基甲酰氧基-丁酸\n\n如方法C所述利用三氟乙酸进行(S)-3-甲基-2-(吩噻嗪)-氨基甲 酰氧基-丁酸，叔丁酯(528mg)的去保护，得到该酸，为白色固体 (440mg)：1H NMR(400MHz，CDCl3)δ0.77-1.00(6H，m)，2.29(1H， m)，5.02(1H，d)，7.15-7.48(6H，m)，7.70(2H，m).\n实施例12\n[3S/R]-5-氟-4-氧代-3-[(S)-3-甲基-2-(吩噻嗪)-氨基甲酰氧基 -丁酰氨基]-戊酸\n\n利用与方法C-E所述相似的方法制备它。分离产物，为白色固体 (98％最后一步)：IR(固体)1782.7，1710.9，1521.5，1465.2，1260.3， 1219.4，1168.1，1045.2，758.5cm-1；1H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ 0.64-0.87(6H，m)，1.96-2.16(1H，m)，2.40-2.98(2H，m)， 4.50-5.42(4H，m)，7.28(2H，m)，7.39(2H，m)，7.49(2H，m)， 7.68(2H，brm)，7.88-8.91(1H，brm)，12.61(1H，brs)；13C NMR (100MHz，d6-DMSO)δ16.8，17.1，19.0，19.2，30.3，30.5，33.0， 33.2，34.5，34.8，47.3，52.0，52.4，79.3，79.6，79.7，83.4，83.5， 85.1，85.2，103.8，127.1，127.2，127.3，127.4，131.4，138.0， 138.1，152.6，152.8，158.82，169.3，169.5，169.7，172.0，172.1， 172.13，202.3，202.4，202.6，202.8；19F NMR(376MHz，d6-DMSO) -226.6(t)，-226.8(t)，-230.3(t)，-231.3(t)，-232.9(t)， -233.0(t)；MS(ESI+ve)475(M+H).\n实施例13\n[3S/R]-5-氟-4-氧代-3-[(S)-3-甲基-2-(2-氯吩噻嗪)-氨基甲酰 氧基-丁酰氨基]-戊酸\n\n方法I：\n2-氯吩噻嗪氨基甲酰氯\n\n向2-氯吩噻嗪(2g)的二甲苯(20ml)悬液中加入二光气(3.4g)。将 混合物加热至140℃达18小时。然后冷却混合物，在减压下除去二甲 苯。残余物经过快速色谱法纯化(2-5％乙酸乙酯/己烷)，得到小标题化 合物，为褐色固体(2.04g)：1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.26-7.43(4H， m)，7.45-7.51(1H，m)，7.59-7.68(2H，m).\n实施例13\n[3S/R]-5-氟-4-氧代-3-[(S)-3-甲基-2-(2-氯吩噻嗪)-氨基甲酰 氧基-丁酰氨基]-戊酸\n\n利用与方法H和C-E所述相似的方法制备它。通过反相HPLC分离 产物，为白色固体(61％最后一步)：IR(固体)1732，1460，1365，1207 cm-1；1H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ0.70-0.87(6H，m)，2.02-2.10(1H， m)，2.58-2.90(2H，m)，4.34-5.37(4H，m)，7.27-7.88(7H，m)， 8.31-8.81(1H，m)；13C NMR(100MHz，d6-DMSO)δ16.7/16.9， 18.9/19.1，30.3/30.3，34.5/34.8，52.0/52.4，79.6/80.0， 84.2/84.3，127.0，127.3，127.3，127.6，128.0，129.0，130.5， 130.9，131.7，137.5/137.5，139.1/139.1，152.3/152.5， 169.6/169.7，172.0/172.1，202.3/202.7(2d，J 14.1/14.0；19F NMR (376MHz，d6-DMSO)-226.6(t)，-226.8(t)，-233.0(t)，-233.1 (t).\n实施例14\n[3S/R]-5-氟-4-氧代-3-[(S)-3-甲基-2-(3-氯吩噻嗪)-氨基甲酰 氧基-丁酰氨基]-戊酸\n\n利用与方法H、I和C-E所述相似的方法制备它。按照J.Chem.Soc. (英国化学会志)(1970)，2437-2441所述方法制备吩噻嗪。分离产物， 为白色固体(89％最后一步)：IR(固体)1717，1527，1469，1350，1322， 1217，1042cm-1；1H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ0.67-0.85(6H，m)， 2.00-2.06(1H，m)，2.58-2.87(2H，m)，4.33-4.86(2.6H，m)， 5.12-5.36(1.4H，m)，7.27-7.30(1H，m)，7.38-7.51(3H，m)， 7.63-7.68(3H，m)，8.24-8.82(1H，m)；13C NMR(100MHz，d6-DMSO) δ17.3/17.6(CH3)，19.4/19.5(CH3)，30.8/30.8，35.0/35.3， 52.5/52.9，80.0/80.1，84.7/84.8，127.2，127.3，127.6，127.9， 128.6，130.7，131.2，133.7，136.9/137.0，137.8/137.8， 153.0/153.2，170.1/170.2，172.5/172.6，202.9/203.2；19F NMR (376MHz，d6-DMSO)-226.7(br)，-226.9(br)，-233.0(t)；MS(ESI +ve)509/511(M+H).\n实施例15\n[3S/R]-5-氟-4-氧代-3-[(S)-3-甲基-2-(3，7-二氯吩噻嗪)-氨基 甲酰氧基-丁酰氨基]-戊酸\n\n利用与方法H、I和C-E所述相似的方法制备它。按照J.Chem.Soc. (英国化学会志)(1970)，2437-2441所述方法制备吩噻嗪。通过反相 HPLC分离产物，为白色固体(76％最后一步)：IR(固体)1793，1721， 1521，1465，1317，1214，1086，1044cm-1；1H NMR(400MHz，d6-DMSO) δ0.71-0.76(3H，m)，0.84-0.88(3H，m)，2.05-2.12(1H，m)， 2.58-2.92(2H，m)，4.31-4.87(2.5H，m)，5.09-5.36(1.5H，m)， 7.47-7.56(2H，m)，7.67-7.71(2H，m)，7.72-7.81(1H，m)， 8.39-8.87(1H，m)；13C NMR(100MHz，d6-DMSO)16.7/16.7/17.0， 19.0/19.1/19.2/19.3，30.3/30.3/30.4，34.5/34.8，52.0/52.4， 79.8/80.1，84.2/84.3，127.3，127.4，127.7，128.5，129.2，129.7， 131.4/131.4，132.0，133.1/133.2，136.4/136.5，138.8/138.9， 152.2/152.3，169.5/169.6，172.0/172.1，202.4/202.5；19F NMR (376MHz，d6-DMSO)-226.5(br)，-226.8(t)，-232.9(t)，-233.0 (br).\n实施例16\n[3S/R]-5-氟-4-氧代-3-[(S)-3-甲基-2-(3，4-二氯吩噻嗪)-氨基 甲酰氧基-丁酰氨基]-戊酸\n\n利用与方法H、I和C-E所述相似的方法制备它。按照J.Chem.Soc. (英国化学会志)(1970)，2437-2441所述方法制备吩噻嗪。通过反相 HPLC分离产物，为白色固体(58％最后一步)：IR(固体)1736，1436， 1365，1222，1050cm-1；1H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ0.66-0.85(6H， m)，2.00-2.08(1H，m)，2.57-2.93(2H，m)，4.30-5.35(4H，m)， 7.31-7.71(6H，m)，8.27-8.83(1H，m)；13C NMR(100MHz；d6-DMSO) δ16.8/17.1，19.0/19.1，30.3，34.5/34.8，52.0/52.4，79.7/80.0， 84.2/84.3，179.2/178.6，127.1，127.3，127.5，128.2，128.5， 128.5，129.6，130.0，133.7，137.3/137.3，137.6/137.6，152.5， 169.5/169.5，172.0/172.1，202.3；19F NMR(376MHz，d6-DMSO) -226.6(t)，-226.8(t)，-232.9(t).\n实施例17\n[3S/R]-5-氟-4-氧代-3-[(S)-3-甲基-2-(9，10-二氢菲啶)-氨基 甲酰氧基-丁酰氨基]-戊酸\n\n利用与方法H、I和C-E所述相似的方法制备它。按照J.Chem.Soc. (英国化学会志)(1951)，3207-3211所述制备9，10-二氢菲啶。通过 反相HPLC分离产物，为白色固体(56％最后一步)：IR(固体)1732， 1365，1226，1212，1203cm-1；1H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ0.84(6H， m)，2.05(1H，m)，2.55-2.90(2H，m)，4.28-5.36(6H，m)， 7.26-7.43(5H，m)，7.75-7.77(1H，m)，7.89-7.91(2H，m)， 8.24-8.81(1H，m)；13C NMR(100MHz，d6-DMSO)δ17.1/17.4， 18.9/19.0，30.3/30.4，34.4/34.8，46.9，51.9/52.4，79.0/79.4， 84.2/84.3，123.8，124.3，125.1，125.7，126.2，128.0，128.2， 128.3，128.5，131.5，134.1，136.9，153.1，170.0/170.1， 172.0/172.1，202.4/202.8；19F NMR(376MHz，d6-DMSO)-226.7(br)， -226.9(br)，-233.1(t)；MS(ESI-ve)455(M-H).\n实施例18\n二苯并[b，f]氮杂-5-羧酸1-(1-羧甲基-3-氟-2-氧代-丙基氨基 甲酰基)-2-甲基-丙基酯\n\n利用与方法H、I和C-E所述相似的方法制备它。分离产物，为白 色固体(100％最后一步)：IR(固体)1791.2，1714.9，1683.4，1525.6， 1492.6，1370.1，1325.6，1229.3，1212.5，1053.4，1032.7，798.4 cm-1；1H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ0.50+0.68(6H，2xm)，1.90(1H， m)，2.54-2.93(2H，m)，4.20-5.44(4H，m)，7.02(2H，s)， 7.30-7.80(8H，m)；13C NMR(100MHz，d6-DMSO)δ18.73，19.17， 30.34，34.56，52.18，84.37，127.92，128.61，128.69，129.63， 130.83，134.40，153.90，169.64，172.23，202.29，202，43，202.63 202.76；19F NMR(376MHz，d6-DMSO)-226.83(t)，-226.87(t)， -232.93(t)，-233.07(t)，-233.10(t)，-233.32(t)；MS(ESI+ve) 469(M+H).\n实施例19\n10，11-二氢-二苯并[b，f]氮杂-5-羧酸1-(1-羧甲基-3-氟-2-氧 代-丙基氨基甲酰基)-2-甲基-丙基酯\n\n利用与方法H、I和C-E所述相似的方法制备它。分离产物，为白 色固体(100％最后一步)：IR(固体)1796.9，1683.9，1521.8，1491.5， 1368.3，1324.8，1278.6，1213.4，1201.9，1108.0，1056.4，931.1， 776.5，746.7cm-1；1H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ0.50-0.95(6H，m)， 1.90(1H，m)，2.55-3.00(2H，m)，4.20-5.30(8H，m)，7.10-7.50 (8H，m)；13C NMR(100MHz，d6-DMSO)δ15.24，16.79，39.44，52.43， 78.36，84.34，126.80，1227.89，128.43，130.29，136.29，154.09， 169.58，170.03，172.19，173.12，202.28，202.42；19F NMR(376MHz， d6-DMSO)-226.76(t)，-233.01(t)，-233.11(t)，-233.38(t)； MS(ESI+ve)471(M+H).\n实施例20\n[3S/R]-5-氟-4-氧代-3-((S)-2，3-二氢吲哚-1-氨基甲酰氧基-3- 甲基-丁酰氨基)-戊酸\n\n方法J：\n(S)-2-(咪唑氨基甲酰氧基)-3-甲基丁酸，苄基酯\n\n向搅拌着的(S)-2-羟基-3-甲基丁酸苄基酯(关于制备参见J.Med. Chem.(药物化学杂志)，(1996)， 39，982，1.5g)的THF(20ml)溶液 中加入羰基二咪唑(1.17g)，将所得混合物在室温下搅拌12小时。在 减压下浓缩反应混合物，将残余物再次溶于乙酸乙酯(30ml)。将溶液 用1％磷酸(2×10ml)和盐水(10ml)洗涤，干燥(硫酸镁)，过滤，浓 缩，得到小标题化合物，为无色的油(1.89g)：1H NMR(400MHz，CDCl3) δ1.02(3H，d)，1.11(3H，d)，2.47(1H，m)，5.15(1H，d)， 5.18-5.32(2H，m)，7.11(1H，s)，7.18-7.60(6H，m)，8.20(1H， m).\n方法K：\n(S)-(2，3-二氢吲哚-1-氨基甲酰氧基)-3-甲基丁酸，苄基酯\n\n在0℃下，向搅拌着的(S)-2-(咪唑氨基甲酰氧基)-3-甲基丁酸， 苄基酯(355mg)的THF(7ml)溶液中加入三氟甲磺酸甲酯(0.13ml)。将 所得溶液搅拌30分钟。然后加入二氢吲哚(280mg)，使混合物历经12 小时温热至室温。在减压下浓缩反应混合物，将残余物溶于乙酸乙酯 (30ml)。将溶液用饱和碳酸氢钠溶液(5ml)、1M盐酸(2×5ml)和盐水 (5ml)洗涤，干燥(硫酸镁)，过滤，浓缩。残余物经过快速色谱法纯 化(5-7％乙酸乙酯/己烷)，得到小标题化合物，为无色的油(342mg)：1H NMR(400MHz，CDCl3)δ0.86-1.18(6H，m)，2.35(1H，m)，3.08-3.25 (2H，m)，4.05-4.25(2H，m)，4.95-5.32(3H，m)，6.95-7.91(9H， m).\n方法L：\n(S)-(2，3-二氢吲哚-1-氨基甲酰氧基)-3-甲基丁酸\n\n向搅拌着的(S)-(2，3-二氢吲哚-1-氨基甲酰氧基)-3-甲基丁酸， 苄基酯(342mg)的甲醇(25ml)溶液中加入10％钯/碳(80mg)。使混合物 在室温下氢化2小时。然后通过C盐过滤混合物，浓缩滤液，得到小 标题化合物，为无色的油(255mg)：1H NMR(400MHz，CDCl3)δ 0.95-1.21(6H，m)，2.40(1H，m)，3.20(2H，m)，4.01-4.25(2H， m)，4.95-5.15(1H，m)，6.97-7.99(4H，m).\n实施例20\n[3S/R]-5-氟-4-氧代-3-((S)-2，3-二氢吲哚-1-氨基甲酰氧基-3- 甲基-丁酰氨基)-戊酸\n\n利用与方法C-E所述相似的方法制备它。分离产物，为白色固体 (94％最后一步)：IR(固体)1680.2，1485.6，1413.9，1137.4，1050.4， 758.5cm-1；1H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ0.95(6H，brm)，2.17(1H， brm)，2.50-2.94(2H，m)，3.12(2H，brm)，3.84-4.23(2H，brm)， 4.27-5.39(4H，m)，6.98(1H，m)，7.22(2H，m)，7.67(1H，brm)， 7.78-8.30(1H，brm)，12.50(1H，brs)；13C NMR(100MHz，d6-DMSO) δ17.2，19.0，19.2，27.3，30.4，30.6，32.9，34.5，34.6，47.3， 47.35，52.0，52.2，78.3，83.4，85.1，104.0，114.2，123.0，125.4， 127.5，131.7，170.0，172.07，172.1，173.2，173.25，202.3，202.5， 202.6；19F NMR(376MHz，d6-DMSO)-226.7(t)，-226.8(t)，-233.1 (t)，-233.3(t)；MS(ESI+ve)395(M+H).\n实施例21\n[3S/R]-5-氟-4-氧代-3-[(S)-3-甲基-2-(咔唑)-氨基甲酰氧基- 丁酰氨基]-戊酸，二乙基酰胺\n\n方法M：\n在0℃下，向搅拌着的酸(实施例1，如方法A-E所述制备)(100mg) 的THF(2ml)溶液中加入二乙胺(16mg)的THF(0.5ml)溶液，然后加 入盐酸1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)(48mg)。然后使 混合物历经12小时温热至室温。在减压下除去溶剂，残余物经过快速 色谱法纯化(50-60％乙酸乙酯/己烷)，得到酰胺，为白色固体(54mg)：1H NMR(400MHz，CDCl3)δ0.69-1.38(12H，m)，2.42-3.37(7H，m)， 4.85-4.92(1H，m)，5.01-5.55(3H，m)，7.31-7.70(5H，m)， 7.90-8.05(2H，m)，8.25-8.42(2H，m)；19F NMR(376MHz，CDCl3) -232.6(t)，-232.8(t)；MS(ESI+ve)498(M+H).\n实施例22\n[3S/R]-5-氟-4-氧代-3-[(S)-3-甲基-2-(咔唑)氨基甲酰氧基-丁 酰氨基]-戊酸，乙基酰胺\n\n利用与方法M所述相似的方法制备它。分离产物，为白色固体(62％)： 1H NMR(400MHz，CDCl3)δ0.96-1.31(9H，m)，2.21-2.45(1H，m)， 2.48-2.80(2H，m)，3.15-3.48(2H，m)，4.23-4.76(3H，m)， 5.05-5.42(1H，m)，6.42-6.84(1H，m)，7.38-7.60(4H，m)， 7.95-8.09(2H，m)，8.20-8.41(2H，m)；19F NMR(376MHz，CDCl3) -223.8(t)，-224.5(t)，-226.5(t)，-227.1(t)，-231.9(t)，-232 (t)；MS(ESI+ve)452(M+H2O).\n实施例23\n[3S/R]-5-氟-4-氧代-3-[(S)-3-甲基-2-(咔唑)-氨基甲酰氧基- 丁酰氨基]-戊酸，哌嗪酰胺\n\n利用与方法M所述相似的方法制备它。分离产物，为白色固体(78％)： 1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.10-1.35(6H，m)，1.80-3.55(14H，m)， 4.82-4.98(1H，m)，5.00-5.45(3H，m)，7.38-7.60(5H，m)， 7.95-8.08(2H，m)，8.27-8.45(2H，m)；19F NMR(376MHz，CDCl3) -232.5(t)，-232.7(t)；)；MS(ESI+ve)525(M+H).\n实施例24\n[3S/R]-5-氟-4-氧代-3-[(S)-3-甲基-2-(咔唑)-氨基甲酰氧基- 丁酰氨基]-戊酸，N，N-二甲氨基乙基酰胺\n\n利用与方法M所述相似的方法制备它。分离产物，为白色固体(49％)： 1H NMR(400MHz，CDCl3)δ1.14-1.31(6H，m)，1.88-3.04(13H，m)， 3.88-4.41(3H，m)，4.57-4.74(1H，m)，5.33-5.61(1H，m)， 6.86-7.12(1H，m)，7.33-7.56(4H，m)，8.01-8.05(2H，m)， 8.27-8.41(2H，m)；19F NMR(376MHz，CDCl3)-222.4(t)，-222.5 (t)；MS(ESI+ve)513(M+H).\n实施例25\n[3S/R]-5-氟-4-氧代-3-[(S)-3-甲基-2-(咔唑)氨基甲酰氧基-丁 酰氨基]-戊酰胺\n\n方法N：\n向搅拌着的来自实施例1的[3S/R]-5-氟-4-氧代-3-[(S)-3-甲基 -2-(咔唑-氨基甲酰氧基-丁酰氨基]-戊酸(150mg)的二氯甲烷(1.5ml) 与二甲基甲酰胺(0.075ml)溶液中加入羰基二咪唑(66mg)。将混合物搅 拌2小时，然后冷却至0℃，同时通入氨。混合物用乙酸乙酯/10％硫 酸氢钾溶液稀释。除去有机相，含水相用乙酸乙酯萃取。合并有机相， 经硫酸镁干燥，过滤，浓缩。残余物经过快速色谱法纯化(5％甲醇/二 氯甲烷)，得到酰胺，为白色固体(80mg)：1H NMR(400MHz，CDCl3) 1.10-1.28(6H，m)，2.12-2.75(3H，m)，4.10-4.85(4H，m)，5.29 (1H，m)，6.36，6.55，6.78，6.98(1H，4xs)，7.17(1H，m)，7.42 (2H，m)，7.50(2H，m)，7.99(2H，m)，8.29(2H，m)；19F NMR(376MHz， CDCl3)-225.47(t)，226.00(t)，-227.33(t)，-227.50(t)， -228.43(t)；MS(ESI+ve)424(M-H2O+H).\n实施例26\n[3S/R]-5-氟-4-氧代-3-[(S)-3-甲基-2-(咔唑)-氨基甲酰氧基- 丁酰氨基]-戊酸，环己酯\n\n利用与方法M所述相似的方法制备它。分离产物，为白色固体(37％)： 1H NMR(400MHz，CDCl3)δ0.90-1.80(16H，m)，2.59(1H，m)， 2.75-3.15(2H，m)，4.40(0.5H，m)，4.64(0.5H，m)，4.95-5.45 (4H，m)，7.25(1H，m)，7.42(2H，m)，7.52(2H，m)，8.05(2H， m)，8.36(2H，m)；19F NMR(376MHz，CDCl3)-231.95(t)，-232.08 (t).\n实施例27\n[3S/R]-5-氟-4-氧代-3-[(S)-3-甲基-2-(咔唑)氨基甲酰氧基-丁 酰氨基]-戊酸，正丙基酯\n\n利用与方法M所述相似的方法制备它。分离产物，为白色固体(82％)： 1H NMR(400MHz，(CDCl3)δ0.80(3H，m)，1.13-1.36(6H，m)，1.42 (1H，m)，1.58(1H，m)，2.60(1H，m)，2.80-3.08(2H，m)，3.70 (1H，m)，3.98(1H，m)，4.92-5.50(4H，m)，7.21(1H，m)，7.40 (2H，m)，7.50(2H，m)，8.00(2H，m)，8.32(2H，m)；19F NMR(376MHz， CDCl3)232.00(t)，-232.01(t)；MS(ESI+ve)485(M+H).\n实施例28\n[3S/R]-5-氟-4-氧代-3-[(S)-3-甲基-2-(咔唑)-氨基甲酰氧基- 丁酰氨基]-戊酸，异丙基酯\n\n利用与方法M所述相似的方法制备它。分离产物，为白色固体(7 ％)：1H NMR(400MHz，CDCl3)δ0.90-1.33(12H，m)，2.55(1H，m)， 2.78-3.15(2H，m)，4.80-5.50(5H，m)，7.25(1H，brs)，7.43(2H， m)，7.55(2H，m)，8.05(2H，m)，8.36(2H，m)；19F NMR(376MHz CDCl3)-232.00(t)，232.03(t).\n实施例29\n[3S/R]-5-氟-4-氧代-3-[(S)-3-甲基-2-(咔唑)-氨基甲酰氧基- 丁酰氨基]-戊酸，甲基酯\n\n利用与方法M所述相似的方法制备它。分离产物，为白色固体(81％)： δ1H NMR(400MHz CDCl3)1.20(6H，m)，2.58(1H，m)，2.80-3.05 (2H，m)，3.42，3.61(3H，2xs)，4.98-5.26(3H，m)，5.41(1H， m)，7.20(1H，brs)，7.45(2H，m)，7.55(2H，m)，8.04(2H，m)， 8.35(2H，m)；19F NMR(376MHz CDCl3)-231.99(t)，-232.00(t)； MS(ESI+ve)457(M+H).\n实施例30\n[3S/R]-5-氟-4-氧代-3-[(S)-3-甲基-2-(咔唑)-氨基甲酰氧基- 丁酰氨基]-戊酸。胆固醇酯\n\n利用与方法N所述相似的方法制备它，使用羰基二咪唑作为偶联 试剂。分离产物，为白色固体(12％)：1H NMR(400MHz，CDCl3)δ 0.65-2.35(47H，m)，2.58(1H，m)，2.75-3.15(2H，m)，4.25(0.5H， m)，4.48(0.5H，m)，4.97-5.46(5H，m)，7.30(1H，m)，7.44(2H， m)，7.58(2H，m)，8.05(2H，m)，8.33(1H，m)；19F NMR(376MHz CDCl3)-231.91(t)，-232.03(t).还分离到对应的缩酮，为白色固 体(21％)：1H NMR(400MHz CDCl3)δ0.65-2.10(48H，m)，2.35-3.15 (2H，3xm)，3.42-3.69(1H，m)，4.10-4.96(4H，m)，5.15-5.65(2H， m)，6.78(1H，m)，7.45(2H，m)，7.57(2H，m)，8.05(2H，m)，8.34 (2H，m)；19F NMR(376MHz CDCl3)-230.57(t)，-230.67(t).\n试验方法\n酶测定法\n天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶抑制作用的测定法基于荧光底物 被重组的纯化人天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1、-3、-7或-8裂解。 测定法基本上与Garcia-Calvo等报道的相同(J.Biol.Chem.(生物 化学杂志)273(1998)，32608-32613)，所用底物对每种酶是特异性 的。天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1的底物是乙酰基 -Tyr-Val-Ala-Asp-氨基-4-甲基香豆素。天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋 白酶-3、-7和-8的底物是乙酰基-Asp-Glu-Val-Asp-氨基-4-甲基香 豆素。\n利用非线性最小二乘法分析计算机程序(PRISM 2.0；GraphPad software)，通过数据与得自Thornberry等的方程(Biochemistry(生 物化学)33(1994)，3943-3939)的直接拟合，计算在特定抑制剂浓 度下所观察到的酶失活率kobs。为了获得第二级速率常数kinact，将kobs 值对它们各自的抑制剂浓度作图，随后通过计算机线性回归计算kinact 值。试验了很多本发明化合物，对天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1 的kinact值在25,000与1,500,000M-1s-1之间；对天冬氨酸特异性半胱 氨酸蛋白酶-3的kinact值在9,000与1,500,000M-1s-1之间；对天冬氨 酸特异性半胱氨酸蛋白酶-8的kinact值在10,000与700,000M-1s-1之间。\n从外周血液单核细胞(PBMC)混和种群分泌IL-1β的抑制作用\n利用各种细胞来源在细胞培养物中可以测量天冬氨酸特异性半胱 氨酸蛋白酶-1对pre-IL-1β的加工。来自健康供体的人PBMC提供淋巴 细胞与单核细胞的混和种群，它们响应于很多种类的生理刺激物而产 生一系列白介素和细胞因子。\n实验程序\n将供试化合物溶于二甲亚砜(DMSO，Sigma#D-2650)，得到100mM 储备溶液。将其稀释在由RPMI组成的完全培养基中，其中含有10％热 灭活的FCS(Gibco BRL#10099-141)、2mM L-谷氨酰胺(Sigma #G-7513)、100U青霉素和100μg/ml链霉素(Sigma#P-7539)。经过八 个稀释步骤，供试化合物的最终浓度范围从100μM至6nM。该测定中 供试化合物的最高浓度相当于0.1％DMSO。\n在Ficoll-Paque白细胞分离培养基(Amersham，#17-1440-02)上 利用离心作用从来自血库的血沉棕黄层分离人PBMC，在无菌96孔平 底平皿(Nunc)中进行细胞测定。每孔含有100μl细胞悬液、1×105 细胞、50μl化合物稀释液和50μl LPS(Sigma#L-3012)，最终浓度 为50ng/ml。对照由细胞+/-LPS刺激物和按照与化合物相同方式稀释 的一系列DMSO稀释液组成。在5％CO2&95％湿度气氛下，将平皿在 37℃下温育16-18小时。\n16-18小时后，在18℃下，在100xg下离心15分钟，收获上清 液，测定它们的IL-1β含量。上清液中成熟IL-1β的测量是利用 Quantikine试剂盒(R&D Systems)按照厂商的指导进行的。在PBMC的 阳性对照孔中观察到成熟IL-1β水平约为600-1500pg/ml。\n化合物的抑制效力可以由IC50值表示，它是与阳性对照相比在上 清液中检测到50％成熟IL-1β时的抑制剂浓度。表5显示按照上述方法 测定的、所选择的本发明化合物对从外周血液单核细胞分泌IL-1β的 抑制作用。\n在该测定法中试验了所选择的化合物，它们抑制IL-1β的释放，IC50 值在0.04μM与20μM之间。\n抗-Fas诱导的细胞程序死亡测定法\nFas配体(FasL)与其受体CD95(Fas)的结合可以诱导细胞程序死 亡。CD95是相关受体家族中的一员，已知称为死亡受体，它能够经由 天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶级联的活化作用激发细胞程序死亡。 衔接分子FADD/MORT-1与CD-95受体-配体配合物的胞质结构域结合， 引发该过程。天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-8然后结合FADD，变为 活化，引发涉及下游天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶活化和随后细胞 程序死亡的事件级联。利用抗体而不是FasL交联细胞表面CD95，还 可以在表达CD95的细胞内诱导细胞程序死亡，例如Jurkat E6.1 T 细胞淋巴瘤细胞系。抗-Fas诱导的细胞程序死亡也是经由天冬氨酸特 异性半胱氨酸蛋白酶-8的活化作用而被激发的。这提供了基于细胞的 测定法的基础，以筛选抑制天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-8介导的 细胞程序死亡途径的化合物。\n实验程序\n在完全培养基中培养Jurkat E6.1细胞，培养基由RPMI-1640 (Sigma No)+10％胎牛血清(Gibco BRL No.10099-141)+2mM L-谷 氨酰胺(Sigma No.G-7513)组成。在生长的对数期收获细胞。将浓度 为5-8×105细胞/ml的100ml细胞转移到无菌50ml Falcon离心试管 内，在室温下，在100xg下离心5分钟。除去上清液，合并细胞的 粒状沉淀，再悬浮在25ml完全培养基中。计数细胞，用完全培养基调 整浓度至2×106细胞/ml。\n将供试化合物溶于二甲亚砜(DMSO)(Sigma No.D-2650)，得到 100mM储备溶液。将其在完全培养基中稀释至400μM，然后连续稀释在 96孔平皿内，再加入到细胞测定平皿内。\n将100μl细胞悬液(2×106细胞)加入到无菌96孔圆底聚口平皿 (Costar No.3790)内。向小孔内加入50μl适当稀释的化合物溶液和 50μl抗-Fas抗体CH-11克隆体(Kamiya No.MC-060)，最终浓度为 10ng/ml。对照孔没有抗体、没有化合物，但是含有DMSO的系列稀释 液作为载体对照。在5％CO2与95％湿度下，将平皿在37℃下温育16-18 小时。\n利用来自Boehringer-Mannheim，No.1544675的“细胞死亡检测 法”，通过DNA片段化的量化，测量细胞程序死亡。温育16-18小时 后，在室温下，将测定平皿在100xg下离心5分钟。除去150μl上 清液，用150μl新鲜的完全培养基代替。然后收获细胞，向每孔加入 200μl由该测定试剂盒提供的溶解缓冲液。研制细胞，以确保完全溶 解，在4℃下温育30分钟。然后将平皿在1900xg下离心10分钟， 得到按1∶20稀释在温育缓冲液中的上清液。然后按照由试剂盒提供的 厂商指导测定100μl该溶液。加入最后的底物后，在SPECTRAmax Plus 平皿读数器(Molecular Devices)中测量OD405nm。将OD405nm对化合 物浓度作图，利用曲线拟合程序SOFTmax Pro(Molecular Devices) 计算化合物的IC50值，使用四参数拟合选项。\n在该测定法中试验了所选择的化合物，它们抑制Fas诱导的 Jurkat细胞程序死亡，IC50值在0.001μM与0.15μM之间。\n尽管我们已经描述了本发明的大量实施方式，不过显然，我们的 基本实施例经过变化可以提供采用本发明化合物和方法的其他实施方 式。因此，本发明的范围将受所附权利要求书而非具体实施方式的限 制，具体实施方式已由实施例所代表。\n相关申请\n本申请要求2000年3月29日提交的美国临时专利申请 60/192,826的优先权。