用甲醇酵母（Pichia Pastoris）生产神经营养素－3（NT－3）的方法及应用

1，一种用甲醇酵母(Pichia pastoris)工程菌生产人神经营养素NT-3 的方法，其特征包括以下步骤：
人脑基因组DNA的提取和纯化；
NT-3基因的扩增，克隆和测定；
NT-3重组表达载体的构建；
NT-3基因的定点突变；
含有NT-3重组表达载体的甲醇酵母(Pichia pastoris)工程菌的构建：
NT-3在甲醇酵母(Pichia pastoris)工程菌中的诱导表达。
2，根据权利要求1所述的用甲醇酵母工程菌生产人神经营养素NT-3 的方法，其中，所述的人脑基因组DNA的提取和纯化方法，是以胎儿脑 组织为原料提取和纯化脑组织总的DNA。
3，根据权利要求1所述的用甲醇酵母工程菌生产人神经营养素NT- 3的方法，其中，所述的NT-3基因的扩增，克隆和测定的方法，是用如 下所示的引物I和引物II，以纯化的脑组织总DNA为模板，扩增NT-3 基因，
引物I：5’-TCT AAG AGA GAG GCT GAG GCT TAC GCG GAG CAT AAG AGT

划线处为5’末端非配对区，虚线为XhoI酶切位点，引物II：
5’-CAC TTA TCT TCC GAT CTT TCT GGA C-3’ 虚线为EcoRI位点。
4，根据权利要求1所述的用甲醇酵母工程菌生产人神经营养素NT-3 的方法，其中，所述的NT-3基因的扩增，克隆和测定的方法，NT-3基 因由357个核苷酸组成，其序列如下所示：
TACGCGGAGCATAAGAGTCACCGAGGGGAGTACTCGGTATGTGACAGTGAGAGTCTGTGG
GTGACCGACAAGTCATCGGCCATCGACATTCGGGGACACCAGGTCACGGTGCTGGGGGAG
ATCAAAACGGGCAACTCTCCCGTCAAACAATATTTTTATGAAACGCGATGTAAGGAAGCC
AGGCCGGTCAAAAACGGTTGCAGGGGTATTGATGATAAACACTGGAACTCTCAGTGCAAA
ACATCCCAAACCTACGTCCGAGCACTGACTTCAGAGAACAATAAACTCGTGGGCTGGCGG
TGGATACGGATAGACACGTCCTGTGTGTGTGCCTTGTCGAGAAAAATCGGAAGAACA
5、根据权利要求1所述的用甲醇酵母工程菌生产人神经营养素NT-3 的方法，其中，所述的重组表达载体的构建，是利用SK-NT-3重组载体 与表达载体pPIC9K酶切，连接，转化，构建为NT-3重组表达载体pPIC9K -NT-3。
6、根据权利要求1所述的用甲醇酵母工程菌生产人神经营养素NT-3 的方法，其中，所述的NT-3基因的定点突变，是在不改变编码氨基酸 的前提下，对原NT-3基因序列中的转录提起终止位点突变，突变后的 基因序列如下所示：
TACGCGGAGCATAAGAGTCACCGAGGGGAGTACTCGGTATGTGACAGTGAGAGTCTGTGG
GTGACCGACAAGTCATCGGCCATCGACATTCGGGGACACCAGGTCACGGTGCTGGGGGAG
ATCAAAACGGGCAACTCTCCCGTC AAGCAATACTTCTACGAAACGCGATGTAAGGAAGCC
AGGCCGGTCAAAAACGGTTGCAGGGGTATTGATGATAAACACTGGAACTCTCAGTGCAAA
ACATCCCAAACCTACGTCCGAGCACTGACTTCAGAGAACAATAAACTCGTGGGCTGGCGG
TGGATACGGATAGACACGTCCTGTGTGTGTGCCTTGTCGAGAAAAATCGGAAGAACA
7、根据权利要1的用甲醇酵母工程菌生产人神经营养素NT-3的方 法，其中，所述的NT-3重组甲醇酵母(Pichia pastoris)工程菌的构 建，重组表达载体pPIC9K-NT-3利用原生质球方法转化甲醇酵母 (Pichia pastoris)，得到重组含有NT-3表达载体的重组甲醇酵母转化 子CGMCC，NO.0549。
8、权利要求4或6或7任选一项的方法在生产制备神经性疾病药物 中的应用。

技术领域\n本发明属于基因工程药物领域，具体地说，涉及利用工程菌甲醇酵 母(Pichia pastoris)生产制备神经营养素-3(NT-3)，以及在制备治 疗维持和促进多种神经元早期的增殖、分化、损伤的感觉和运动神经元、 胆碱能神经元、多巴胺能神经元和听神经元和糖尿病所致外周神经炎和 化疗引起的神经疾病等多种疾病药物中的应用。\n背景技术\n到目前为止尚未有在原核系统中表达出有活性NT-3的报道。Gotz 曾在真核系统中表达了NT-3，但表达水平较低，仅为128μg·L-1。1994 年Meyer和Negro同时报道大鼠NT-3在昆虫系统中的表达，分别获得 30-50μg/L和20ug/L NT-3纯品。国内的穆援越等也在昆虫杆状病毒 表达系统中表达了生物活性的NT-3，200ml培养上清经CM Sepharose Fast 纯化得到200μg NT-3纯品，其最大生物效应浓度为4ng/ml。陈谦等构 建人的NT-3重组腺病毒，并感染神经系统细胞，可在局部释放有活性 的NT-3，不失为一种可行性方法，但表达量低。袁静明等以融合蛋白形 式在E.coli中表达NT-3，并利用内蛋白子体外剪接系统去除N末端的融 合部分而无需额外的蛋白酶切割。但产物以包涵体形式存在，需要经变 性，复性等多步后处理。\n从目前已有技术而言，虽然动物细胞表达系统得到的NT-3蛋白活性 较高。但动物细胞培养条件要求高，成本高，表达量低，当前还主要处 在实验室摸索阶段；大肠杆菌表达系统本身较成熟，易培养，对大规模 生产更有利，但是仍然存在严重的缺陷，必须解决复性问题，而且产率 也不高。\n作为真核表达系统，甲醇酵母具有许多其它蛋白表达系统所不可比 拟的优点。可概括如下：(1)具有强有力的乙醇氧化酶基因(AOX1) 启动子，可严格调控外源蛋白的表达；(2)作为真核表达系统，可对表 达的蛋白进行翻译后的加工和修饰，从而使表达出的蛋白具有生物活性； (3)营养要求低，生长快，培养基廉价，便于工业化生产；(4)可高密 度发酵培养，在发酵罐中细胞干重甚至可达130g/L以上；(5)表达量高， 许多蛋白可达到每升克以上水平，如破伤风毒素C片段表达量高达 12g/L；(6)在甲醇酵母(Pichia Pastoris)中表达的蛋白既可存在于胞内， 又可分泌至胞外。Pichia自身分泌的蛋白(背景蛋白)非常少，十分有 利于纯化。如表达的重组水蛭素(HIR)，仅经过二步层析纯化，纯度就 高达97％以上；(7)糖基化程度低。和酿酒酵母相比，甲醇酵母中加到 翻译蛋白上的糖链长度平均每条侧链为8-14个甘露糖残基，较之酿酒 酵母每条侧链平均50-150甘露糖残基短得多。\n甲醇酵母系统是近年来发展起来的一种蛋白表达宿主。它兼顾了动 物细胞表达系统和大肠杆菌表达系统的优点而克服了彼此的不足(动物 细胞表达系统：成本高、表达量低、培养条件高，难于工业化生产；大 肠杆菌表达系统：产率也不高，纯化繁琐，需要复杂的变性和复性才能 恢复生物活性)。\n目前，国内外还未见有NT-3和用作医药产品出售，美国Promega公 司有分子生物学试剂级产品，NT-3为$240/5ug包装($4.8万/mg)，抗 体为$255/200ug包装。因为用大肠杆菌表达NT-3表达量低，纯化繁琐， 需要复杂的变性、复性才能恢复生物活性，并且复性率也不高(成熟NT-3 含三对二硫键，容易形成不正确的二硫键连接)。这些问题造成成本过高， 价格如此昂贵也就不足为奇了。\n发明内容\n基于上述问题，本发明的目的在于提供一个新的具有实用价值的甲 酵酵母表达系统，提供一个由甲酵酵母表达NT-3的制备方法，提供在 制备治疗神经营养因子NT-3药物中的应用。\n发明人克隆NT-3基因于甲醇酵母分泌型表达载体pPIC9K，测序、 转化、筛选，得到多拷贝转化予。然而转化子经甲醇诱导后，根本检测 不到表达。通过检查NT-3基因全序列，发现了转录提前终止位点的存在， Northern杂交证实了诱导后的NT-3基因转录出的是截短而非全长mRNA。 定点突变消除转录提前终止位点并克隆突变基因于载体pPIC9K，再一次 原生质球转化甲醇酵母。选出的高拷贝转化子经甲醇诱导，得到了14kD 的产物，表明NT-3在甲醇酵母中得到表达。表达产物能刺激培养的PC12 细胞的分化，证明具有生物学活性。该工程菌已交中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心保存，登记入册编号为CGMCC NO. 0549。该方法包括以下步骤：\n1.基因组DNA的提取和纯化\n2.NT-3基因的扩增，克隆和测序\n3.重组表达载体的构建、转化、转化子的筛选\n4.NT-3的诱导表达\n5.NT-3高抗性转化子RNA提取和Northern杂交\n6.NT-3基因的定点突变及突变的NT-3基因的克隆\n7.突变的NT-3基因的测序，转化，转化子的筛选及诱导表达\n8.表达产物NT-3的生物学活性测定\n到目前为止，国内外有关NT-3在甲醇酵母中的还未见任何报道。本 发明NT-3在甲醇酵母中的表达无论表达生物量以及提取制备步骤都优 于其它表达体系，为NT-3药物的生产和应用成为现实。\n以下的实施例可以使本专业技术领域的技术人员更全面地理解本发 明，但不以任何方式限制本发明。本发明的载体pPICqK.甲醇酵母 GS115、SMD1168购自Invitrogen公司，载体SK购自MBI Ferments公 司。\n具体实施方式\n1.基因组DNA的提取和纯化.\n取0.6g中国人胎儿脑组织，研磨后加入盛有5ml提取裂解液(3M 异硫氰酸胍，0.01M醋酸钠)的离心管中，30℃摇床中温和振荡1h。用 大口径吸管将脑组织裂解液加入盛有18ml乙醇的离心管液面以下，用 玻棒缓慢搅拌至完全混匀。回收DNA，滴干乙醇后溶于2ml TE中，过 DEAE微型柱纯化。\n引物\n根据Jones等报道的NT-3基因序列，设计了NT-3基因5’末端(引 物I)和3’末端引物(引物II)。引物I：\n5’-TCT AAG AGA GAG GCT GAG GCT TAC GCG GAG CAT AAG AGT CAC AGA G\n  \n划线处为5’末端非配对区，虚线为XhoI酶切位点。引物II：\n5’-CAC TTA TCT TCC GAT CTT TCT GGA C-3’ 虚线为EcoRI位点。\n此外为了消除基因内部转录提前终止位点，设计了引物III和引物 IV，也在上海生工合成：\n引物III：5’-GAA GTA TTG CTT GAC GGG-3’\n引物IV：5’-TAC GAA ACG CGA TGT AAG-3’\n2.NT-3基因的扩增，克隆和测序\n以提取的DNA为模板，以引物I和引物II进行扩增。PCR条件为：94 ℃40sec，60℃ 40sec，72℃ 60sec，反应30个循环，结束后72 ℃延伸10min。利用PCR产物两端的EcoRI和XhoI位点，将其克隆于 载体SK。连接、转化均按分子克隆进行。重组表达载体pPIC9K-NT-3 的构建如图1所示。经序列测定，BDNF基因是由如序列表所示的357bp 的核苷酸组成(见图2)。\n3.重组表达载体的转化、转化子的筛选\n重组表达载体pPIC9K-NT-3用SacI酶切线性化，原生质球方法转 化甲醇酵母。转化子长出后在含G418的抗性平板上筛选，并不断提高G418 的浓度，以得到高抗性的转化子，抽提高抗性转化子DNA，用引物I和 引物II PCR扩增，以确证NT-3基因的整合。\n4.原生质球法转化甲醇酵母GS115方法：\n试剂\na)SOS：1M山梨醇，0.3X YPD，10mmol/L CaCl2\nb)SE：1M山梨醇，25mmol/L EDTA(pH8.0)\nc)SCE：1M山梨醇，10mmol/L柠檬酸钠缓冲液pH5.8\nd)CaS：1M山梨醇，10mmol/L Tris-HCl(pH7.5)，10mmol/L CaCl2\ne)CaT：20mmol/L Tri-HCl(pH7.5)，20mmol/L CaCl2\n原生质球的制备\na)将甲醇酵母SMD1168接种YPD平板，30℃培养2-3天，挑取单一克隆 并接种到盛有10ml YPD培养基的100ml摇瓶，30℃，300rpm培养过夜。\nb)接种10μl上述菌悬液到含200ml YPD的500ml摇瓶。30℃ 300rpm 培养至OD600为0.2-0.3时，1500g离心5min，去掉上清。\nc)分别用20ml无菌水、20mlSED、20ml 1M山梨醇各洗涤细胞一次，每 次洗完1500g离心5min，去上清。最后加20ml SCE重悬细胞。分成10ml 的A、B两管。\nd)取19支无菌干净的1.5ml EP管，每管加800μl 5％ SDS，并分别标上 0、2、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、28、30、32、35、38、40、 45分别代表Zymolyase消化细胞壁的时间(min)。从上述A管中取200 μl菌悬液加入后，放入冷冻中，作为Zymolyase消化分钟的对照管。 加7.5μl Zymolyase(2.25Units)到A管，轻轻混匀，根据管中标记 的时间，每次从A管取200μl正在消化的细胞悬液至装有0.8ml 5％SDS 的EP管中，并立即放置冰中，以终止酶反应。\ne)依下列公式计算每个时间点形成原生质球的百分比：\n原生质球％＝100-[(OD800(tmin)/OD800(0min))×100] 并决定形成70％原生质球的反应时间。加7.5μl Zymolyase到B管，30 ℃保温，反应时间的长短依上述步骤确定(形成70％原生质球)。\nf)室温750g离心10min，去上清，分别用10ml 1M山梨醇、10ml CaS洗涤原生质球，去上清，最后用0.6ml CaS重悬原生质球，在30分钟之 内用于转化。\n转化\na)将10μg线性化的pPIC9K-NT-3载体与100μl刚制备的原生质球轻 轻混合，室温放置10min。\nb)加1ml新配制的PEG/CaT(1∶1)溶液，轻轻混合，室温再放置10min。\nc)750g离心10min，尽可能吸去上清，用150μl SOS重悬细胞并静置 20min，加850μl 1M山梨醇。\nd)每150μl已转化的原生质球与10ml熔化的RD琼脂糖培养基混合， 并铺在RDB平板上层，28-30℃，培养4-6天并观察结果。\n5.NT-3的诱导表达\n高拷贝转化子接种于BMGY培养基，30℃摇瓶培养约24h后，离心， 弃上清，用BMMY培养基悬浮酵母菌体，摇床培养，每隔24h加一次甲 醇，并且每隔24h取2ml发酵液，离心去菌体。用0.1％SDS-12％PAGE 和Western Blotting分析上清。\n6.NT-3高抗性转化子RNA提取和Northern杂交\n同时提取NT-3高抗性转化子和分泌表达的BDNF重组菌株的RNA，在 同一块胶上(2％甲醛变性琼脂糖凝胶)电泳。电泳完毕后把凝胶一分为二， 一块含NT-3转化子RNA，另一块含BDNF重组菌株RNA，将两者分别转移 至NC膜上。以pUC-BDNF和pUC-NT-3质粒为模板，α-32P-dCTP为同位 素，随机引物标记法分别制备BDNF基因探针和NT-3基因探针。制备好的 探针分别与对应的NC膜上的RNA杂交(见图3)。\n7.NT-3基因的定点突变及突变的NT-3基因的克隆\n以pUC-NT-3质粒为模板，以引物I和引物III为一对引物，引物II 和引物IV为另一对引物，分别PCR扩增，得到的产物分别命名为片段 A和片段B。(见图4)PCR条件为：94℃ 40sec，55℃ 40sec，72℃ 60 sec，反应30个循环，结束后72℃延伸10min。片段A、B回收后，T4 DNA 聚合酶削平片段A、B 3’末端。XhoI酶切片段A，EcoRI酶切片段B， 两者分别回收。回收后的片段A、B经T4多核苷激酶处理后，直接连接 过夜，连接产物和XhoI，EcoRI双切的载体pPIC9K再一次连接(见图5)。 转化，Amp筛选。转化子XhoI，EcoRI双酶切鉴定。\n8.突变的NT-3基因的测序，转化，转化子的筛选及诱导表达 见上面(图6、7、8)。\n9.表达产物的纯化\n发酵培养液离心去除菌体，上清加硫酸铵至80％饱和度，4℃下沉淀 6小时。离心得沉淀。沉淀溶解后，对25mM硼酸钠，pH9.0溶液长时间 透析。透析好的样品上DEAE-Sephadex阴离子交换柱(2.5×12cm，已 用25mM，pH9.0硼酸钠溶液平衡)。用0.1-1.0M NaCl(溶于平衡缓冲液 中)梯度分部洗脱。合并有ELISA反应的分管，浓缩后对25mM磷酸 缓冲液(PBS)、pH7.0溶液透析。透析好的样品上S-sepharose柱(2.5× 20cm，预先用25mM PBS，pH7.0溶液平衡)，用0.1-0.5M NaCl溶液洗脱。 收集有ELISA反应的部分，电泳分析。\n10 表达产物NT-3的生物学活性测定\n甲醇酵母表达产物NT-3经小型离子交换柱纯化后(纯度达95％以上)， 采用微量考马氏亮蓝CBBG-250染料结合法测其蛋白含量。37℃，5％CO2 培养箱中培养的PC12细胞传3-4代后，调整细胞悬液至浓度为0.8×105-1 ×105个/mL，加入24孔培养板(已用多聚赖氨酸液包被)，每孔1mL， 培养箱中培养1天。待细胞贴壁后，吸去培养液，加入1ml新鲜培养基， 并加入不同浓度的纯化的NT-3样品(1至100ng范围内)，以不加样品 的培养孔为阴性对照，以NGF为阳性对照，继续培养2-4天。相差倒置显 微镜下进行观察、计数(见图9-13)。结果重复三次，计数结果取平均 值。\n下面结合附图对本发明作进一步详细发明。\n附图说明\n图1 重组表达载体pPIC9K-NT-3的构建\n图2 NT-3基因序列\n图3 RNA杂交比较转录mRNA的大小(1：pPIC9k-BDNF重组菌株RNA 与BDNF基因探针杂交\n2：对照3：pPIC9k-NT-3转化子与NT-3基因探针杂交)\n图4 NT-3基因的分段PCR(1：片段A的PCR扩增  2：片段B的 PCR扩增)\n图5 NT-3基因的突变和克隆\n图6 突变后的NT-3基因的序列测定结果(其中划线处代表突变 位点，此处原序列为AAACAATATTTTTAT)\n图7 基因突变后表达产物的电泳分析\n图8 突变后表达产物的Western blotting分析\n图9 未加NTF处理的PC12细胞(阴性对照)\n图10阳性对照NGF促进PC12细胞长出突起\n图11阳性对照NGF促进PC12细胞分化曲线\n图12分泌表达的NT-3促进PC12细胞长出突起\n图13分泌表达的NT-3促进PC12细胞分化曲线