一种露湿漆斑菌A553抗单端孢霉烯自我保护基因mfs1及其\n应用\n技术领域\n[0001] 本发明属于基因工程领域，具体涉及一种露湿漆斑菌A553抗单端孢霉烯自我保护\n基因mfs1及其应用。\n背景技术\n[0002] 露湿漆斑菌(Myrothecium roridum)A553是一株从广药植物广藿香中分离得到的\n真菌，从其发酵液中分离得到了新型化合物单端孢霉烯毒素，具有很强的抗肿瘤活性。从露\n湿漆斑菌A553中共获得单端孢霉烯毒素3种，其中1种为新型单端孢霉烯毒素。单端孢霉烯\n毒素具有抗肿瘤、抗真菌、抗疟疾和植物毒活性，因此在抗肿瘤、抗真菌感染和抗疟疾等药\n物开发方面具有良好的研究前景。\n[0003] 单端孢霉烯的毒性主要源于靶向真核细胞中普遍保守的Rpl3，并抑制蛋白合成，\n所以它不仅对动植物细胞，而且对宿主菌也有毒性。已有报道宿主菌体内存在某种机制抵\n抗单端孢霉烯对它的毒性，而这种机制的引入对提高工业化生产菌株对毒素的耐受极为关\n键。禾谷镰刀菌中单端孢霉烯毒素的生物合成基因簇已经被报道，已证实基因簇中的Tri12\n和Tri101基因涉及到了宿主对单端孢霉烯产生的抗性，但它们并不是唯一的机制。已有文\n献研究表明，菌株的mfs1类基因(major facilitator superfamily I)是宿主自我保护机\n制的重要组成部分。(Qinhu Wang,Daipeng Chen,Mengchun Wu,Jindong Zhu,Cong Jiang,\nJin‑Rong Xu and Huiquan Liu.MFS Transporters and GABA Metabolism Are Involved \nin the Self‑Defense Against DON in Fusarium graminearum.Frontiers in Plant \nScience.April 2018,Volume 9,Article 438)\n发明内容\n[0004] 本发明的第一个目的是提供一种抗单端孢霉烯自我保护基因mfs1，所述的抗单端\n孢霉烯自我保护基因mfs1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。\n[0005] 本发明的抗单端孢霉烯自我保护基因mfs1通过以下方法获得的：通过转录组测序\n结果预测编码抗单端孢霉烯自我保护基因mfs1的序列，在其上下游设计特异性引物，其引\n物序列为msf1‑F:5'‑ATGTTTATCGCCGCCCGTGT‑3'；mfs1‑R:5'‑TTAATCAAGAGGCCCACCCGT‑3'，\n以由露湿漆斑菌A553转录组反转录而得的cDNA文库为模板，通过PCR扩增获得产物并纯化\n回收片段，获得目的基因mfs1(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)。\n[0006] 本发明利用同源重组法将mfs1基因插入到酵母载体YEp352‑TEF1‑CYC1的表达盒\n内部。首先设计含有同源臂的mfs1基因的上下游引物，其引物序列为msf1‑U:5'‑\nCAATCTAATCTA AGTCTAGAATGTTTATCGCCGCCCGTGT‑3'；msf1‑D:5'‑TGCGGCCCGTCGACTTAATCAA \nGAGGCCCACCCGT‑3'(下划线序列为同源臂片段)，通过PCR扩增获得产物并纯化回收片段。对\n已构建的YEp352‑TEF1‑CYC1载体采用内切酶Sal I和Xba I双酶切，然后使用ClonExpress \nII One Step Cloning Kit C112(Vazyme)将片段和酶切载体重组连接并转化至大肠杆菌\n感受态细胞，涂布于氨苄青霉素抗性平板筛选出阳性克隆。经过此轮分子克隆，目的基因\nmfs1(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)插入到启动子TEF1和终止子CYC1之间，构建得到\nYEp352‑TEF1‑mfs1‑CYC1载体，将其电转入酿酒酵母BJ5464‑D细胞中，利用尿嘧啶缺陷型的\nSD培养基平板进行筛选和验证。与转入YEp352‑TEF1‑CYC1质粒(阴性对照)的酿酒酵母\nBJ5464‑D相比，含有重组载体YEp352‑TEF1‑mfs1‑CYC1的酿酒酵母生长速度明显加快，培养\n相同时间内菌落密度更高，证明功能基因mfs1能有效协助酿酒酵母抵抗外源单端孢霉烯\nDON毒素，为在酿酒酵母内重构单端孢霉烯生物合成通路奠定基础。\n[0007] 本发明的第二个目的是提供一种表达载体，含有上述的抗单端孢霉烯自我保护基\n因mfs1。\n[0008] 本发明的第三个目的是提供一种宿主细胞，含有上述的表达载体。\n[0009] 所述的宿主细胞优选为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BJ5464。\n[0010] 本发明的第四个目的是提供上述的抗单端孢霉烯自我保护基因mfs1在协助宿主\n细胞抵抗单端孢霉烯毒素中的应用。\n[0011] 所述的宿主细胞优选为露湿漆斑菌(Myrothecium roridum)A553或酿酒酵母\n(Saccharo myces cerevisiae)BJ5464。\n[0012] 本发明的第五个目的是提供一种表达盒，该表达盒含有上述的抗单端孢霉烯自我\n保护基因mfs1。\n[0013] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：\n[0014] 本发明所涉及的露湿漆斑菌(Myrothecium roridum)A553分离自广药植物广藿\n香，本课题组前期对该菌进行了转录组测序并对单端孢霉烯毒素生物合成相关基因进行了\n注释。鉴于目前关于露湿漆斑菌A553抗单端孢霉烯自我保护基因的研究尚未见报道，而转\n录组测序及文献调研结果也表明，该菌株自有的mfs1类基因可能同Tri12基因一起在露湿\n漆斑菌抵抗单端孢霉烯毒素方面发挥了重要作用。因此本发明从露湿漆斑菌A553的cDNA文\n库中获得了抗单端孢霉烯自我保护基因mfs1序列，并成功导入到酿酒酵母S.cerevisiae \nBJ5464中进行了抗毒功能验证，从而为后期提高酿酒酵母抗单端孢霉烯的能力，提升单端\n孢霉烯毒素的异源表达水平并获得新型单端孢霉烯毒素奠定分子生物学基础。\n[0015] 本发明的露湿漆斑菌(Myrothecium roridum)A553，其公开于文献：Hong‑Xin \nLiu,Wei‑Zhen Liu,Yu‑Chan Chen,Zhang‑Hua Sun,Yu‑Zhi Tan,Hao‑Hua Li&Wei‑Min \nZhang(2016):Cytotoxic trichothecene macrolides from the endophyte fungus \nMyrothecium roridum,Journal of Asian Natural Products Research,DOI:10.1080/\n10286020.2015.1134505。该菌种本申请人也持有，保证自发明的申请日起20年内向公众提\n供。\n附图说明\n[0016] 图1为露湿漆斑菌A553 mfs1基因序列获得：以露湿漆斑菌A553 cDNA文库为模板，\n基因mfs1扩增产物的电泳图；\n[0017] 图2为重组载体YEp352‑TEF1‑mfs1‑CYC1的构建；其中A为YEp352‑TEF1‑CYC1载体\n图谱；B为YEp352‑TEF1‑mfs1‑CYC1载体图谱；C为基因mfs1的菌落PCR扩增产物的电泳图；\n[0018] 图3为三种酿酒酵母在YPD平板和YPD‑DON平板(100μM)培养36h的效果图。A，酿酒\n酵母BJ5464；B，酿酒酵母BJ5464‑D(YEp352‑TEF1‑CYC1)；C，酿酒酵母BJ5464‑D(YEp352‑\n‑2 ‑3 ‑4\nTEF1‑mfs1‑CYC1)。10 、10 、10 分别代表OD600约为0.01、0.001、0.0001的5μL菌液样品。\n具体实施方式\n[0019] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。\n[0020] 本实施例中所用的SD固体培养基(尿嘧啶缺陷型的SD培养基)的配方为：每升含有\n葡萄糖20g、Do supplement 0.62g(‑Leu/‑Trp/‑Ura，Clontech)、无氨基酵母氮源YNB 6.7g\n(普博欣)、亮氨酸0.06g、色氨酸0.04g和琼脂粉20g，余量为蒸馏水，配制方法：将培养基各\n成分混合，搅拌溶解，灭菌，即得。单端孢霉烯DON毒素购买于Sigma。\n[0021] 本实施例中所用的YPD固体培养基的配方为：每升含有酵母粉10g、蛋白胨20g、葡\n萄糖20g和琼脂粉20g，余量为蒸馏水，配制方法：将培养基各成分混合，搅拌溶解，灭菌，即\n得。\n[0022] 实施例1露湿漆斑菌(Myrothecium roridum)A553抗单端孢霉烯自我保护基因\nmfs1序列的获得\n[0023] 基因mfs1的扩增：将植物内生真菌露湿漆斑菌(Myrothecium roridum)A553接种\n于YPD培养基平板，于37℃培养72h，挑取新鲜的菌丝体，利用真菌RNA提取试剂盒提取RNA，\n再用All‑in‑one RT Master Kit逆转录获得cDNA。根据转录组测序结果预测编码抗单端孢\n霉烯自我保护基因mfs1序列，设计上下游引物msf1‑F:5'‑ATGTTTATCGCCGCCCGTGT‑3'和\nmfs1‑R:5'‑TTAATCAAGAGGCCCACCCGT‑3'，以cDNA文库为模板扩增，获得PCR产物(图1)。纯化\n回收产物并用pEASY‑T1试剂盒进行TA克隆，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布于氨\n苄青霉素抗性平板筛选出阳性克隆，以通用引物M13‑F(5′‑GTAAAACGACGGCCA GT‑3′)和\nM13‑R(5′‑CAGGAAACAGCTATGAC‑3′)进行菌液PCR验证阳性克隆并测序，获得目的基因mfs1\n序列(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)。\n[0024] 实施例2抗单端孢霉烯自我保护基因mfs1的功能验证\n[0025] 利用同源重组法将基因mfs1插入到酵母载体YEp352‑TEF1‑CYC1中(YEp352‑TEF1‑\nCYC1为早期构建质粒，携带有组成型启动子TEF1和终止子CYC1，YEp352‑TEF1‑CYC1载体图\n谱见图2A，为现有技术中的已知产品：Xiaodan Ouyang,Yaping Cha,Wen Li,Chaoyi Zhu,\nMuzi Zhu,Shuang Li,Min Zhuo,Shaobin Huang and Jianjun Li.Stepwise engineering \nof Saccharomyces cerevisiae to produce(+)‑valencene and its related \nsesquiterpenes,RSC Adv.,2019,9,30171,DOI:10.1039/c9ra05558d)。首先设计针对基因\nmfs1(SEQ ID NO.1)扩增的上下游引物msf1‑U:5'‑CAATCTAATCTAAGTCTAGAATGTTTATCGCCG\nCCCGTGT‑3'；msf1‑D:5'‑TGCGGCCCGTCGACTTAATCAAGAGGCCCACCCGT‑3'(下划线序列为同源\n臂片段)，以实施例1的cDNA文库为模板，通过PCR扩增获得产物并纯化回收片段。对载体\nYEp352‑TEF1‑CYC1采用Sal I和Xba I双酶切并回收产物，然后使用ClonExpress II One \nStep Cloning Kit C112(Vazyme)将PCR扩增片段和酶切载体重组连接并转化至大肠杆菌\nDH5α感受态细胞中，涂布于氨苄青霉素抗性平板筛选出阳性克隆。采用引物msf1‑U和msf1‑\nD进行菌落PCR验证，结果表明基因mfs1成功插入YEp352‑TEF1‑CYC1载体中(图2C)，并通过\n测序予以确认，得到YEp352‑TEF1‑mfs1‑CYC1载体(载体图谱见图2B)。\n[0026] 制备单端孢霉烯毒素敏感型酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BJ5464‑D\n(relevant genotype:Δpdr5Δpdr10Δpdr15)的感受态细胞(为现有技术中的已知产品，\n该菌株对毒性化合物单端孢霉烯更加敏感：Wolfgang Schweiger,Jayanand Boddu,\nSanghyun Shin,Brigitte Poppenberger,Franz Berthiller,Marc Lemmens,Gary \nJ.Muehlbauer,and Gerhard Adam.Validation of a Candidate Deoxynivalenol‑\nInactivating UDP‑Glucosyltransferase from Barley by Heterologous Expression \nin Yeast,MPMI,2010,Vol.23,No.7,DOI:10.1094/MPMI‑23‑7‑0977)。将YEp352‑TEF1‑\nmfs1‑CYC1质粒载体以及YEp352‑TEF1‑CYC1质粒载体(阴性对照)分别电转入酿酒酵母\nBJ5464‑D细胞中(1500V，5ms)，均匀涂布于尿嘧啶缺陷型的SD平板(SD固体培养基)中，在30\n℃培养2d，利用菌落PCR筛选阳性克隆，获得分别含有YEp352‑TEF1‑mfs1‑CYC1质粒以及\nYEp352‑TEF1‑CYC1质粒的酿酒酵母BJ5464‑D细胞。\n[0027] 分别将酿酒酵母BJ5464、酿酒酵母BJ5464‑D(含有YEp352‑TEF1‑CYC1质粒)、酿酒\n酵母BJ5464‑D(含有YEp352‑TEF1‑mfs1‑CYC1质粒)接种于相应尿嘧啶缺陷型的SD培养基\n(SD固体培养基)中，在30℃培养2d。用分光光度计测量各菌液OD600，将各菌液用无菌水稀释\n‑1\n到OD600≈1.0作为原液，再以100μL的原液加900μL的无菌水的方式稀释成10 ，以同样的方\n‑2 ‑3 ‑4 ‑2 ‑3 ‑4\n式稀释成10 、10 、10 。各取5μL不同菌株的10 、10 、10 的稀释液分别在YPD平板和YPD‑\nDON平板(含有100μM单端孢霉烯DON毒素)的点板，在30℃培养并实时观察。培养36小时的平\n板结果显示(图3)，酿酒酵母BJ5464、酿酒酵母BJ5464‑D(含有YEp352‑TEF1‑CYC1质粒)、酿\n酒酵母BJ5464‑D(含有YEp352‑TEF1‑mfs1‑CYC1质粒)在不添加任何毒素的YPD平板上生长\n状况是近乎一致的，但在含有100μM单端孢霉烯DON毒素的YPD平板上，阴性对照酿酒酵母\n‑3 ‑4\nBJ5464‑D(含有YEp352‑TEF1‑CYC1质粒)明显生长受阻，10 和10 两个梯度的菌液几乎没\n有生长。而导入mfs1功能基因的酿酒酵母BJ5464‑D(含有YEp352‑TEF1‑mfs1‑CYC1质粒)则\n生长良好，其不同稀释度下的菌体密度与正常酿酒酵母(酿酒酵母BJ5464)相当，说明来源\n于露湿漆斑菌A553的mfs1功能基因部分或全部恢复了酿酒酵母BJ5464‑D对外源添加毒素\n的耐受性，有效帮助酿酒酵母在含有毒素的环境下正常生长。\n[0028] 以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对\n本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的\n普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改\n进和润饰也应视为本发明的保护范围。
