一种土壤改良、抗重茬多功能生物制剂

1.一种土壤改良、抗重茬多功能生物制剂，其特征在于所述生物制剂的组分包括拟康氏木霉和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)复合微生物以及土壤改良剂黄腐酸和硫酸锌；其中，拟康氏木霉菌株为拟康氏木霉(Trichoderma pseudokiningii)DLD1，该菌株已经在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，编号为CGMCC NO.3221；
枯草芽孢杆菌菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DLD2，该菌株已经在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，编号为CGMCC NO.3222；各组分的重量份数为：
上述每100ml拟康氏木霉发酵液中含有木霉菌丝干重0.9-1.0g，
每毫升枯草芽孢杆菌发酵液中枯草芽孢杆菌含量30亿/ml。
2.如权利要求1所述的生物制剂，其特征在于所述生物制剂的组分还包括维生素C和/或α奈乙酸和/或绿原酸和/或氨基水杨酸及糊精。
3.如权利要求1或2所述的生物制剂，其特征在于各组分的重量份数如下：
上述每100ml拟康氏木霉发酵液中含有木霉菌丝干重0.9-1.0g，
每毫升枯草芽孢杆菌发酵液中枯草芽孢杆菌含量30亿/ml。
4.如权利要求1或2所述的生物制剂，其特征在于各组分的重量份数如下：
上述每100ml拟康氏木霉发酵液中含有木霉菌丝干重0.9-1.0g，
每毫升枯草芽孢杆菌发酵液中枯草芽孢杆菌含量30亿/ml。
5.如权利要求1或2所述的生物制剂，其特征在于所述的生物制剂的制备方法如下：
①制取拟康氏木霉发酵液：将拟康氏木霉(Trichoderma pseudokiningii)DLD1菌株利用PDA平板活化，接到液体PDA培养基中，灭菌后在摇床上培养，制得到种子液；然后以土豆、麸皮培养基为发酵培养基，先后在种子罐、二级种子罐和发酵罐中搅拌通气发酵；然后混匀、包埋、浓缩，制得拟康氏木霉发酵液；
②制取枯草芽孢杆菌发酵液：将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DLD2菌种经LB平板活化，接到液体LB培养基在摇床上培养；然后接种进行种子罐、二级种子罐、发酵罐中搅拌通气培养；再进入乳化罐中乳化、包埋，再进入双效浓缩器浓缩制得枯草芽孢杆菌培养物；菌液中菌含量达到30亿/ml制的枯草芽孢杆菌发酵液；
③将上述两种发酵培养物混合得到微生物成分A备用；
④将黄腐酸，硫酸锌加入50-60℃的水中充分搅拌溶解，螯合，逐步降温至30±2℃；作为土壤改良成分B备用；
⑤氨基水杨酸，绿原酸，α奈乙酸，维生素C加入50-60℃的水中充分搅拌溶解，逐步降温至30±2℃，作为植物诱导因子C备用；
⑥最后将上述备用的微生物成分A，土壤改良成分B，植物诱导因子成分C在配料罐中合并、混匀、添加糊精成分并进行乳化，再经检测合格，即为生物制剂成品。

一种土壤改良、抗重茬多功能生物制剂 \n技术领域\n[0001] 本发明涉及土壤改良剂和土壤抗重茬剂领域，特别是一种土壤改良与抗重茬剂二效合一的多功能生物制剂及其制备方法。 \n背景技术\n[0002] 良好的土壤条件是作物丰产的必要条件，但是由于气候干旱，化肥过度使用，不合理的栽培和管理，连作等原因引起土壤生态恶化，作物减产，造成了巨大的经济损失。土壤生态的恶化对作物的影响主要是土壤板结引起的根系水、汽、肥失衡和重茬病原菌引起的重茬病害。探索有效地方法打破土壤板结，控制重茬病害具有巨大的经济效益和社会意义。 [0003] 目前，打破土壤板结的方法主要是机械深耕和施用土壤改良剂。机械深耕是利用大马力农业机械，翻耕土壤厚度达到60cm以上，疏松硬化的土壤，重构团粒结构，提高土壤肥力，保水保墒，这种方法无污染，不破坏有益菌群。缺点是土壤翻动量大，容易形成高低垄，影响土壤平整度，并且劳动强度大，成本高。施用土壤改良剂能够有效改良土壤团粒结构，起到通风通气、保水保墒的作用。土壤改良剂包括人工合成改良剂和天然改良剂。聚丙烯酰胺，沥青乳剂等人工合成改良剂成本高，持续时间短，对生态环境有不利影响。天然改良剂如多聚糖、腐殖酸、泥炭具有同样的改良效果，但成本相对要低，绿色化环保，具有明显的优势。 \n[0004] 抗重茬病害主要方法有：高温处理，化学药剂处理，微生物菌剂处理。高温处理是通过覆盖地膜等方式提高土壤温度(40-50℃，15天)达到杀灭病原菌的效果。此法只能对地表进行浅层灭菌，对深层土壤没有显著效果。化学药剂处理的方法，以氯化苦和溴甲烷使用较多，优点是对土壤病原菌的毒性强，效果显著。缺点是对环境造成不利影响，在杀灭病原菌的同时，将土壤中的有益菌群破坏，对作物生长不利，对人畜有毒害作用。微生物杀菌剂通过外施生防菌，固氮、解磷、解钾等有益菌种，利用微生物间的竞争，拮抗，重寄生等作用，抑制或杀灭病原菌，保护并促进植物根系生长，提高土壤肥力。是一种高效环保的抗重茬病害的方法。 \n[0005] 土壤的板结与重茬病害往往是相伴而生的，但是目前还没有一种有效的方法，同时具备土壤改良和重茬病害防治的效果。 \n发明内容\n[0006] 本发明目的在于提供一种结合了天然土壤改良剂的土壤改良效果和微生物土壤杀菌剂防治重茬病害效果的多功能生物制剂。其效果在于(1)利用生防微生物阻断有害菌群侵染植物并杀灭病原菌，诱导植物产生抗病性，防死苗烂棵；(2)利用微生物与黄腐酸复配的增效功能，诱导根系生长，实现生根壮苗和抗重茬病害；(3)利用黄腐酸、硫酸锌，打破土壤板结，形成团粒结构，实现免深耕作，保水保墒、缓解肥害、提高地力。 [0007] 本发明所述生物制剂的组分包括：拟康氏木霉(Trichoderma pseudokiningii)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的复合微生物以及土壤改良剂黄腐酸和硫酸锌等，复配制成土壤改良、抗重茬多功能生物制剂。 \n[0008] 所述拟康氏木霉菌株是从济南市历城区玉米秸杆上分离，利用PDA培养平板进行培养、筛选的生长旺盛的菌株，命名为拟康氏木霉(Trichoderma pseudokiningii)DLD1，已于2009年8月12日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，编号为CGMCCNO.3221，地址为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所。 [0009] 拟康氏木霉(Trichoderma pseudokiningii)DLD1有以下特征： \n[0010] 该微生物菌种能够在25℃-30℃范围内快速生长，最适生长温度为28℃，在高于\n35℃的环境中抑制生长；在PDA培养平板中，菌丝白色，孢子梗主轴次级分支结构复杂，具有2-3回分支；瓶梗基部收缩明显，中间膨大，顶部变细，终极瓶梗延长，基部不变细，产孢细胞大小为(3.00-7.50)μm×(1.25-2.00)μm，分生孢子呈短圆柱形，大小为(2.5-4.5)μm×(2.0-2.5)μm。 \n[0011] 所述枯草芽孢杆菌菌株是从山东寿光菜园土壤中分离，使用牛肉膏、蛋白胨培养基，利用涂布平板法培养筛选得到的，命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DLD2，该菌种已于2009年8月12日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，编号为CGMCC NO.3222，地址为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所。 [0012] 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DLD2有以下特征： \n[0013] 单个细胞0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。\n最适生长温度为28℃。 \n[0014] 所述的拟康氏木霉(Trichoderma pseudokiningii)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的复合微生物为用拟康氏木霉发酵液和枯草芽孢杆菌发酵液的混合而成的复合微生物发酵液 \n[0015] 拟康氏木霉发酵液的制备方法如下： \n[0016] 首先将拟康氏木霉(Trichoderma pseudokiningii)DLD1菌株利用PDA平板活化，接到液体PDA培养基中，灭菌后在摇床上培养，制得到种子液；再以土豆、麸皮培养基为发酵培养基，先后在种子罐、二级种子罐和发酵罐中搅拌通气发酵；然后混匀、包埋、浓缩，制得拟康氏木霉发酵液。 \n[0017] 具体制备方法为： \n[0018] 拟康氏木霉种子培养： \n[0019] 首先将拟康氏木霉菌株利用PDA平板活化24h，后接到液体PDA培养基(马铃薯\n200g/L，蔗糖100g/L)三角瓶中，灭菌后在摇床上培养，培养条件为28℃、100rpm，培养36h，得到种子液。 \n[0020] 拟康氏木霉发酵： \n[0021] 发酵培养基为马铃薯、麸皮培养基，成分如下：麸皮40g/L，马铃薯50g/L，蔗糖\n20g/L，KH2PO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，CaCl2 0.25g/L。 \n[0022] 发酵培养的条件：pH5-7，培养温度28℃、转速20-50rpm、接种量3％-7％。 [0023] 发酵方法：按接种量将菌种接到种子罐中，搅拌通气培养36h，然后进入二级种子罐搅拌通风培养36h，再注入发酵罐中搅拌通气培养96h；然后进入高速剪切机混匀，包埋，再进入双效浓缩器，在45℃的温度下，浓制拟康氏木霉培养物，制得拟康氏木霉发酵液。所得的每100ml拟康氏木霉发酵液中含有木霉菌丝干重0.1-1.0g，较好的发酵培养效果为每\n100ml拟康氏木霉发酵液中含有木霉菌丝干重0.9-1.0g \n[0024] 枯草芽孢杆菌发酵液的制备方法如下： \n[0025] 将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DLD2菌种经LB平板活化，接到液体LB培养基中，进行摇床培养；再接种进入种子罐、二级种子罐、发酵罐，搅拌通气发酵；然后进入乳化罐中乳化、包埋，再进入双效浓缩器浓缩制得枯草芽孢杆菌培养物，即为枯草芽孢杆菌\n9 10\n发酵液。菌液中菌含量达到1×10-3×10 /ml，理想的菌含量为30亿/ml。 \n[0026] 具体制备方法为： \n[0027] 枯草芽孢杆菌种子培养： \n[0028] 枯草芽孢杆菌的发酵：将枯草芽孢杆菌菌种经LB平板活化，再接到液体LB培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L)中，在28℃、转速120rpm下，摇床培养\n24h。 \n[0029] 发酵培养基为：蔗糖20g/L、硫酸铵5g/L、麸皮50g/L、柠檬酸三钠2.5g/L、K2HPO4·3H2O0.3g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、FeSO4·7H2O 0.05g/L。 \n[0030] 发酵培养的条件如下：发酵温度30℃，初始pH值7.2，接种量3％-7％，最适接种量5％。 \n[0031] 发酵方法：按接种量送入种子罐中搅拌通气培养24h，再进入二级种子罐中搅拌通气培养24h，然后注入发酵罐中搅拌通气培养48h；发酵液进入乳化罐中乳化、包埋，再进入双效浓缩器，在45℃的温度下浓缩制枯草芽孢杆菌，制得枯草芽孢杆菌发酵液。菌液中菌\n9 10\n含量达到1×10-3×10 /ml。 \n[0032] 本发明所述生物制剂的组分包括：拟康氏木霉发酵液和枯草芽孢杆菌发酵液的复合微生物以及土壤改良剂黄腐酸和硫酸锌，其组分重量份数如下： \n[0033] \n[0034] 为了提高应用效果和改善制剂性能，本发明所述土壤改良、抗重茬多功能生物制剂中还可添加如下辅助组分：维生素C和/或α奈乙酸和/或绿原酸和/或氨基水杨酸及糊精等。 \n[0035] 配制本发明土壤改良、抗重茬多功能生物制剂的具体原料组分和重量份数如下： [0036] \n[0037] 其中： \n[0038] 拟康氏木霉发酵液：100ml发酵液中含有木霉菌丝干重0.9-1.0g； [0039] 芽孢杆菌发酵液：每毫升芽孢杆菌发酵液中芽孢杆菌30亿； \n[0040] 其他组分含量按100％计。 \n[0041] 本发明所述土壤改良、抗重茬多功能生物制剂的制备方法为： \n[0042] ①制备康氏木霉发酵液。 \n[0043] ②制备枯草芽孢杆菌发酵液。 \n[0044] ③将上述两种发酵液混合得到复合微生物成分A备用。 \n[0045] ④将黄腐酸，硫酸锌加入50-60℃的水中充分搅拌溶解，螯合，逐步降温至\n30±2℃；作为土壤改良成分B备用。 \n[0046] ⑤氨基水杨酸，绿原酸，α奈乙酸，维生素C加入50-60℃的水中充分搅拌溶解，逐步降温至30±2℃，作为植物诱导因子C备用。 \n[0047] ⑥最后将上述备用的复合微生物成分A，土壤改良成分B，植物诱导因子成分C在配料罐中合并、混匀、添加糊精成分并进行乳化，再经检测合格，即为本发明的成品。 [0048] 有益效果 \n[0049] 本发明所述的拟康氏木霉(Trichoderma pseudokiningii)DLD1，是一种具有多种抗病机制的植物生防菌，对人畜无害，不产生环境污染，生长力极强。该菌能够在作物根系快速繁殖，形成保护结构，阻断病原菌侵染。同时能够通过重寄生作用，分泌各种杀菌物质和细胞壁溶解酶类，起到杀灭病原菌的效果。此外，拟康氏木霉能够诱导作物产生抗病性并促进植物生长。实现了作物生根壮苗，有效减少了死苗烂棵。 \n[0050] 本发明所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DLD2，是一种自然环境中广泛存在的对人畜无害的生防微生物。枯草芽孢杆菌能够通过生态位的竞争作用降低细菌性病原菌的侵染，通过溶菌作用降低真菌性病原菌侵染。此外，还能分泌抗菌物质和细胞壁溶解酶类杀灭病原菌。枯草芽孢杆菌是一类植物促生根圈细菌(Plant growth-promoting rhizobaceria)，能够促进作物生长。 \n[0051] 本发明所述拟康氏木霉和枯草芽孢杆菌的混合微生物扩大了该制剂的抗病谱，能够有效对抗129种病原真菌和细菌。在两种微生物的相互增效作用下，该制剂能够在土壤中产生多种土壤改良成分和植物抗病诱导因子。两者的混合效果好于单一作用。 [0052] 本发明所述的黄腐酸，属于腐植酸类，能够促进土壤团粒形成，使土壤疏松，具有良好的吸附性。从而保肥、稳肥、保水、透气，克服土壤的板结现象，为提高土壤肥力打下基础。腐植酸还能够通过促进作物呼吸作用，促进根系生长发育实现壮苗。腐植酸是一种高效环保的天然土壤改良剂，并且制造工艺简单，价格低廉。 \n[0053] 本发明所述的硫酸锌是一种补充微量元素。由于作物的重茬种植，不断吸收土壤中的特定的微量元素且得不到补充，尤其是锌元素最易在重茬连作土壤中缺乏，补充硫酸锌有助于 缓解重茬引起的减产。 \n[0054] 氨基水杨酸，绿原酸，α奈乙酸，维生素C作为植物诱导因子C，有利于促进作物生长、提高抗病能力。 \n[0055] 上述各组分的合理复配，能够产生协同增效作用。 \n[0056] 本发明具有土壤改良和抗重茬病害双重效果，较全面解决了土壤生态恶化引起土壤板结和重茬病害问题。 \n具体实施方式：\n[0057] 例1、本发明土壤改良、抗重茬多功能生物制剂由以下按重量(份)比的原料配制而成： \n[0058] 拟康氏木霉发酵液18、芽孢杆菌发酵液22、黄腐酸15、硫酸锌4、维生素C 7、α奈乙酸0.8、绿原酸10、氨基水杨酸7、糊精8、加水至100份。 \n[0059] 例2、本发明土壤改良、抗重茬多功能生物制剂由以下按重量(份)比的原料配制而成： \n[0060] 拟康氏木霉发酵液15、芽孢杆菌发酵液20、黄腐酸10、硫酸锌3、维生素C 6、α奈乙酸0.7、绿原酸9、氨基水杨酸6、糊精7、加水至100份。 \n[0061] 例3、本发明土壤改良、抗重茬多功能生物制剂由以下按重量(份)比的原料配制而成：拟康氏木霉发酵液20、芽孢杆菌发酵液25、黄腐酸20、硫酸锌5、维生素C 7、α奈乙酸0.8、绿原酸9、氨基水杨酸6、糊精8、加水至100份。 \n[0062] 上述土壤改良、抗重茬多功能生物制剂的制备方法为： \n[0063] ①拟康氏木霉发酵的制取方法：加工中应无菌操作；首先将拟康氏木霉菌株利用PDA平板活化24h，后接到液体PDA三角瓶中，28℃，100r/min培养36h得到种子液，按3％接种量接到种子罐中，搅拌通气培养36h，再进入二级种子罐搅拌培养36h，然后注入发酵罐中搅拌通气培养96h，再进入高速剪切机混匀，包埋，再进入双效浓缩器在45℃的温度下浓制的木霉培养物；在发酵培养中培养基为土豆、麸皮培养基(麸皮40g/L，马铃薯50g/L，蔗糖20g/L，KH2PO40.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，CaCl2 0.25g/L，pH5-7，培养温度28℃、转速20-50rpm、接种量3％-7％)。 \n[0064] ②枯草芽孢杆菌发酵的制取方法：加工中应无菌操作；将枯草芽孢杆菌菌种经NA平板活化，接到液体NA培养基在摇床上培养24h，按3％接种量进行种子罐中搅拌通气培养\n24h，在进入二级种子罐中搅拌通气培养24h，然后注入发酵罐中搅拌同期培养48h，再进入乳化罐中乳化包埋，在进入双效浓缩器在45℃的温度下浓缩制的枯草芽孢杆菌培养物； [0065] ③将上述两种发酵培养物混合得到微生物成分A备用。 \n[0066] ④将黄腐酸，硫酸锌加入50-60℃的水中充分搅拌溶解，螯合，逐步降温至\n30±2℃；作 为土壤改良成分B备用。 \n[0067] ⑤氨基水杨酸，绿原酸，α奈乙酸，维生素C加入50-60℃的水中充分搅拌溶解，逐步降温至30±2℃，作为植物诱导因子C备用。 \n[0068] ⑥最后将上述备用的枯微生物成分A，土壤改良成分B，植物诱导因子成分C在配料罐中合并、混匀、添加糊精成分并进行乳化，再经检测合格即为本发明的成品； [0069] 具体使用方法可以灌根、随水浇灌、喷施、蘸根。 \n[0070] 具体应用实例及应用效果： \n[0071] 实例1： \n[0072] (1)土壤改良活化剂的原料配比参照例1； \n[0073] (2)使用方法：于山东曲阜市董家乡草莓大棚进行。使用本发明稀释60倍喷施地面，结合整地翻入地下。在草莓定植后使用本发明稀释300-400倍喷施地面，连用3-4次，\n2\n喷施间隔10-15天。每666.7m 用量每次2-3升。草莓品种为美王1号。 \n[0074] 在相邻地块以不施用本发明作为对照。每小区面积为100m2，三次重复。其他管理全部同常规。 \n[0075] 对幼苗期的根、茎、叶的生长状况进行了调查。 \n[0076] 试验结果见表1： \n[0077] 表1本发明对草莓幼苗期根、茎、叶的影响 \n[0078] \n[0079] 由表1可知，施用本发明后，平均单株根系数、根长度、毛细根数量分别增加了\n55.6％、22.7％和73.0％，平均茎粗度增加了1.25倍，叶片数量、生长速度，有效叶龄，分别提高了83.3％、22.2％和46.7％。说明使用本发明可以改善土壤环境，促进草莓生根壮苗，效果非常显著。 \n[0080] 实例2 \n[0081] (1)土壤改良活化剂的原料配比参照例1。 \n[0082] (2)使用方法：于山东金乡县进行，这一地区棉花重茬种植在5年以上，化肥不合理使用引起的土壤板结严重，土传病害盛行。试验作物为棉花。使用本发明稀释60倍喷施\n2\n地面和有机肥拌施，结合整地翻入地下。每666.7m 用量2-3升。 \n[0083] 在相邻地块以不施用本发明作为对照。每小区面积为100m2，三次重复。其他管理全部同常规。 \n[0084] 进行苗期病害防治效果调查，分别为定植后10天、20天、30天、40天、45天，对这一阶段由因土传病、倒春寒、气温、地温、高湿引起的猝倒病、立枯病、根腐病、红腐病等苗期病害，进行调查统计。 \n[0085] 试验结果见表2： \n[0086] 表2本发明对棉花苗期抗病能力的影响 \n[0087] \n[0088] 由表2可知，施用了本发明后，病死苗，染病苗在整个苗期(10天-45天)得到了有效地控制，维持了较高的健康苗率，表明该发明能够在棉花易感病的苗期，改善土壤环境，有效控制土传病害的发生。对于多年连作引起的重茬病害具有显著的预防效果。 [0089] 实例3 \n[0090] (1)土壤改良、抗重茬多功能生物制剂的配方参照配方实施例1。 [0091] (2)使用方法：于山东大学生物化学与分子生物学研究所试验田进行土壤改良测试。以试验田土作为实验对象。使用本发明稀释60倍喷施土壤，以喷施蒸馏水为对照组。\n取样、测定方法参照中华人民共和国国家标准土壤环境质量标准(GB15618-1995)。分别测定对照组和施用本发明的实验组的土壤有机质含量、持水量、容重。 \n[0092] 表3本发明对土壤有机质、含水量、容重的影响 \n[0093] \n[0094] 由表3可知，施用本发明后，土壤有机质、持水量、土壤容重都有显著提高。结果表明本发明能够有效改善土壤颗粒度，打破土壤板结，提高土壤肥力和持水量。具有明显的土壤改良效果。 \n[0095] 实例4 \n[0096] (1)土壤改良、抗重茬多功能生物制剂的配方参照配方实施例1。