聚多巴胺/氧化石墨烯/BSA的制备方法

1.聚多巴胺/氧化石墨烯/BSA的制备方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：
（1）利用聚多巴胺的强粘附性能将氧化石墨烯固定于PDMS微流控芯片分离通道内：将
2 mg/mL多巴胺和40 μg/mL氧化石墨烯在10 mM pH 8.5的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液中混匀，反应2小时，用真空泵抽入PDMS微流控芯片分离通道内，连续抽5分钟使溶液布满整个分离通道，室温下静置反应2小时，即得到聚多巴胺/氧化石墨烯功能化的PDMS微流控芯片；
（2）聚多巴胺/氧化石墨烯/BSA功能化PDMS微芯片的制备：用20 mM、pH 7.17的磷酸盐缓冲溶液对上述步骤制备的聚多巴胺/氧化石墨烯功能化的PDMS微流控芯片分离通道冲洗5分钟，再用真空泵将1 mg/mL的BSA溶液抽入分离通道内，连续抽2分钟，在4 °C下静置反应4小时，即得到聚多巴胺/氧化石墨烯/BSA功能化的PDMS微流控芯片，置于4 °C条件下保存。

聚多巴胺/氧化石墨烯/BSA的制备方法\n技术领域\n[0001] 本发明涉及一种以聚多巴胺/氧化石墨烯为二级反应平台在PDMS微芯片通道内实现BSA固定的方法及其在手性分离中的应用。\n背景技术\n[0002] 手性是自然界存在的普遍现象，手性化合物分为D-型和L-型。在非手性环境中，D-型和L-型异构体的物理性质和化学性质相似。而在手性环境中，特别是在生物环境中，它们表现出不同的药理性质和生物活性。因此，在制药和生物化学领域中，手性分离显得尤为重要。由于手性对映体的物理和化学性质相似，它们的分离难以实现。毛细管电色谱(CEC)同时兼具了毛细管电泳的高效和液相色谱选择性好的优点，在过去的几十年里，CEC已经成为一种很有发展前景的手性分离技术。在手性选择性开管毛细管电色谱(OT-CEC)中，手性选择剂作为固定相被固定于毛细管内，由于易制备、没有气泡产生和电渗流稳定等优点，OT-CEC受到了越来越多研究人员的关注。目前，很多文献报道采用各种各样的OT柱来分离手性对映体。然而，在OT-CEC中固定相的量相对较少，使得相比和柱容量较低，大大限制了OT-CEC在分离中的应用。因此，寻求有效的涂层方法来增大柱的比表面积和增强分析物与固定相之间的作用至关重要。\n[0003] 为了提高相比和柱容量，很多涂层方法(聚合物涂层、多孔硅层、蚀刻、溶胶-凝胶、纳米粒子等)已经被应用于制备OT-CEC。Messersmith等受到贻贝表面蛋白质良好的粘附性能的启发，提出了一种既新颖又简单的强粘附性能的表面涂层方法。这种涂层方法的关键在于一种神经递质小分子多巴胺(DA)的自聚合作用。在碱性条件下，DA发生自聚合在许多材料表面形成强粘附性能的聚多巴胺(PDA)薄膜，同时，DA的邻苯二酚基团被氧化形成醌式结构，进而与含巯基和氨基等官能团的物质通过迈克尔加成或席夫碱反应相结合。\n[0004] 此外，DA也常被用来作为一种捕获剂，通过自聚合制备聚合物复合材料。PDA既可作为捕获剂也可以作为粘附剂，从而将氧化石墨烯(GO)固定于PDMS通道内。GO不仅具有大的比表面积，还含有大量的含氧官能基团，使得无需添加任何交联剂或表面修饰过程，仅通过GO与生物分子之间的疏水作用、π-π共轭和氢键等作用即可实现对生物分子的高效固定化。\n发明内容\n[0005] 本发明的目的在于提供了一种以PDA/GO为二级反应平台在PDMS微芯片通道内实现BSA固定的方法及其在手性分离分析中的应用，具有绿色环保、成本低廉、操作简单快速、且能实现氨基酸和二肽对映体有效分离等优点。\n[0006] 本发明是这样来实现的，以PDA/GO纳米复合材料为二级反应平台固定BSA于PDMS微芯片通道中，制备了OT-CEC手性固定相，用于手性氨基酸和二肽的分离。由于PDA极强的粘附性和良好的亲水性，使得PDA/GO纳米复合材料在PDMS芯片通道表面形成了一个稳定的、生物相容性好和亲水性的薄膜。该生物分子固定方法不仅简单稳定，而且，PDA/GO功能化PDMS微芯片还兼具GO比表面积大的特点，大大提高了BSA在PDMS微芯片通道中的负载量，提高了相比和柱容量，改善了氨基酸和二肽对映体的分离效果；此外，通过PDA/GO与生物分子之间的疏水、π-π和氢键等作用将BSA固定于PDMS微芯片通道内，在整个修饰过程中，无需额外添加任何如有机溶剂等其它化学试剂，具有绿色环保、成本低廉、操作简单且快速等优点。测试结果表明，PDA/GO/BSA修饰的PDMS微芯片通道具有良好的手性选择性能，成功用于对手性氨基酸和二肽的分离分析。\n[0007] 本发明采用以下技术方案：\n[0008] （1）利用PDA的强粘附性能将GO固定于PDMS微流控芯片分离通道内：将一定浓度的DA和GO在pH 8.5的Tris-HCl缓冲溶液中混匀，用真空泵抽入PDMS微流控芯片分离通道内，连续抽5 min使溶液布满整个分离通道，室温下静置反应2 h，即得到PDA/GO功能化的PDMS微流控芯片；\n[0009] （2）PDA/GO/BSA功能化PDMS微芯片的制备：用PBS缓冲溶液对上述步骤制备的PDA/GO功能化的PDMS微流控芯片分离通道冲洗5 min，再用真空泵将1 mg/mL的BSA溶液抽入分离通道内，连续抽2 min，在4 °C下静置反应4 h，即得到PDA/GO/BSA功能化的PDMS微流控芯片，置于4 °C条件下保存。\n[0010] 聚多巴胺/氧化石墨烯/BSA功能化PDMS微芯片的应用：色氨酸对映体、苏氨酸对映体和二肽对映体在聚多巴胺/氧化石墨烯/BSA功能化PDMS微芯片上都实现了基线分离，分离度分别为1.58、1.76和1.74，表明聚多巴胺/氧化石墨烯/BSA功能化PDMS微芯片对氨基酸对映体和二肽对映体具有良好的手性选择性。\n[0011] 上述方法中，所述的DA和GO的浓度分别为2 mg/mL和40 μg/mL，反应时间为2 h；所述的Tris-HCl缓冲液的浓度为10 mM，pH为8.5；所述的BSA溶液用20 mM、pH 7.17的PBS缓冲溶液配制。\n[0012] 本发明的技术效果是：本发明利用DA在碱性条件下的自聚合作用生成PDA，PDA极强的粘附性，使得其在自聚合的同时将GO成功地组装于PDMS微芯片通道内，再以PDA/GO为二级反应平台进一步高效固定BSA，制备成以PDA/GO/BSA为手性固定相的功能化的PDMS微流控芯片，实现了对手性氨酸和二肽的高效分离。在整个制备过程中，无需额外添加任何如有机溶剂等其它化学试剂，具有绿色环保、成本低廉、操作简单快速、且能高效分离氨基酸和二肽对映体等优点。\n附图说明\n[0013] 图1为本发明涉及的PDMS微流控芯片结构示意图。\n[0014] 图2是(a) PDMS芯片，(b) PDA/GO修饰PDMS芯片，(c) PDA/GO/BSA修饰PDMS芯片的ATR-FT-IR图。\n[0015] 图3是(a) PDMS芯片，(b) PDA/GO修饰PDMS芯片，(c) PDA/GO/BSA修饰PDMS芯片的接触角表征图。\n[0016] 图4是EOF在(a) PDMS芯片和(b) PDA/GO/BSA修饰PDMS芯片上随运行缓冲溶液pH值的变化关系图。\n[0017] 图5是(A) D,L-色氨酸、(B) D,L-苏氨酸、(C)手性二肽在(a) PDMS芯片和(b) PDA/GO/BSA修饰PDMS芯片上的电色谱分离图。\n[0018] 图6是(A)不同浓度缓冲溶液和(B)不同分离电压下，3.5 mM D-色氨酸和7.0 mM L-色氨酸在PDA/GO/BSA功能化PDMS芯片上的电色谱分离图。\n[0019] 在图中，1、样品池，2、缓冲溶液池，3、样品废液池。\n具体实施方式\n[0020] 下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步阐述，本发明并不限于此。\n[0021] 实施例1\n[0022] PDMS芯片的制作：以SU-8阳模（博奥生物有限公司）为模板，制作典型的十字型PDMS微流控芯片通道，如图1所示。具体制作过程如下：取一定量的PDMS单体和固化剂按\n10:1（质量比）混合均匀、除气，倾注于SU-8模板上，在 70 ºC下固化2小时。待冷却后从模板上剥下含十字型通道的PDMS芯片，用刀片切割成所需形状，用打孔器在缓冲液池、样品池和样品废液池等三处打孔，形成直径为3 mm的孔。同时，以平滑玻璃板为模板，按照同样步骤制备不含微通道的PDMS芯片为盖片。将含十字通道的PDMS芯片和不含通道的PDMS盖片分别用二次水、甲醇、二次水超声清洗10分钟，在红外灯下烘干，随即将两片PDMS封合，形成一块可逆的PDMS芯片。PDMS分离通道长42 mm（有效分离长度37 mm），进样通道长10 mm。所制得的PDMS分离通道呈梯形，上底宽50 μm，下底宽65 μm，深18 μm。\n[0023] 实施例2\n[0024] （1）利用PDA的强粘附性能将GO固定于PDMS微流控芯片分离通道内：将一定浓度的DA和GO在pH 8.5的Tris-HCl缓冲溶液中混匀，用真空泵抽入PDMS微流控芯片分离通道内，连续抽5 min使溶液布满整个分离通道，室温下静置反应2 h，即得到PDA/GO功能化的PDMS微流控芯片；\n[0025] （2）PDA/GO/BSA功能化PDMS微芯片的制备：用PBS缓冲溶液对上述步骤制备的PDA/GO功能化的PDMS微流控芯片分离通道冲洗5 min，再用真空泵将1 mg/mL的BSA溶液抽入分离通道内，连续抽2 min，在4 °C下静置反应4 h，即得到PDA/GO/BSA功能化的PDMS微流控芯片，置于4 °C条件下保存。\n[0026] 采用ATR-FT-IR对PDA/GO/BSA修饰前后的PDMS芯片进行表征(图2)。由图可-1 -1\n见，与裸PDMS芯片(图2a)相比，PDA/GO修饰PDMS芯片在1615 cm 和3420 cm 出现了-1\nPDA的特征吸收峰及在1725 cm 出现了GO的特征吸收峰(图2b)，说明PDA/GO已被成功-1 -1\n地修饰在PDMS芯片通道表面。进一步与BSA反应后，在1655 cm 和1542 cm 处分别出现了酰胺一键(C=O伸缩振动)和酰胺二键(N–H弯曲振动和C–N伸缩振动)的特征吸收峰(图2c)，表明BSA已被成功地组装于PDMS微芯片通道表面，且保持了良好的二级结构。\n[0027] 采用接触角对PDA/GO/BSA修饰前后PDMS微芯片的亲水性进行了表征。众所周知，PDMS芯片对分析物的非特异性吸附是由于其表面的疏水性所致。为了克服这一缺点，需对PDMS芯片进行改性，使其表面由疏水性变为亲水性。由图3可见，裸PDMS芯片的接触角高达112°(图3a)；经PDA/GO修饰后，其接触角减小为22°(图3b)；当通过席夫碱反应和π-π共轭等作用将BSA组装到PDA/GO修饰PDMS芯片表面时，接触角增大为50°(图\n3c)。结果表明，经PDA/GO/BSA修饰的PDMS芯片的亲水性得到了大大改善，该芯片放置几周后接触角几乎不变，表明本方法有效抑制了PDMS芯片疏水性的恢复。\n[0028] 稳定的电渗流(EOF)是获得良好分析重现性的必备条件。图4是PDMS芯片和PDA/GO/BSA修饰后PDMS芯片的EOF随PBS缓冲溶液pH(3-11)的变化关系曲线。由图可见，在裸芯片上，EOF随pH值的增加迅速增大(图4a)，使得EOF很难控制，稳定性较差，不利于电色谱分离；而在PDA/GO/BSA修饰PDMS芯片上，EOF随pH的变化则较为平缓(图4b)。当−4 2 −1 −1\npH为7.17时，裸芯片上EOF为2.4×10 cm V s ，PDA/GO/BSA修饰芯片的EOF减小−4 2 −1 −1\n为2.0×10 cm V s 。此外，当pH为7.17时，PDA/GO/BSA修饰芯片上EOF的相对标准偏差仅为0.5% (n=3)，是裸芯片上的七分之一，表明PDA/GO/BSA修饰PDMS芯片的稳定性得到了有效提高。\n[0029] 实施例3\n[0030] PDA/GO/BSA功能化PDMS微流控芯片的应用：\n[0031] （1）微流控芯片的一个重要应用是进行分析物的分离，图5为(A) 3.5 mM D-色氨酸和7.0 mM L-色氨酸、(B) 3.5 mM D-苏氨酸和7.0 mM L-苏氨酸、(C) 4 mM Gly-D-Phe和4 mM Gly-L-Phe在(a) PDMS芯片和(b) PDA/GO/BSA修饰PDMS芯片上的电色谱分离曲线。实验是在20 mM pH7.17的PBS缓冲液中、进样电压为800 V、分离电压为1300 V和检测电位为+0.6 V的条件下进行的。由图5可见，在PDMS芯片微通道内，手性氨基酸和二肽都只出现了一个峰，无法实现有效分离；然而，在PDA/GO/BSA修饰PDMS芯片微通道内，色氨酸、苏氨酸和二肽等对映体都获得了高效分离，分离度分别为1.57、1.76和1.74。以上结果表明，本发明方法制备的PDA/GO/BSA修饰PDMS微流控芯片对氨基酸对映体和二肽对映体具有良好的手性选择功能。\n[0032] (2) 缓冲溶液浓度和分离电压对电色谱分离的影响\n[0033] 图6A考察了缓冲溶液浓度对电色谱分离检测的影响，当缓冲溶液浓度为10 mM时，色氨酸对映体的分离度为0.8；当浓度为20 mM时，色氨酸对映体在PDA/GO/BSA修饰PDMS芯片上实现了基线分离；当浓度超过20 mM时，色氨酸对映体的分离效率下降，同时，峰展宽严重，这是由于过大的缓冲溶液浓度会产生更多的焦耳热，导致分离效率和灵敏度降低。因此，本实验选择的PBS缓冲溶液最优浓度为20 mM。\n[0034] 图6B考察了分离电压对电色谱分离检测的影响，在PDA/GO/BSA修饰的PDMS微芯片通道内，随着分离电压的增加，安培响应信号逐渐上升，同时，D,L-色氨酸的迁移时间逐渐缩短，这主要是因为分离电压与工作电极之间的耦合作用导致检测电位伴随着分离电压的增加而增大，结合安培检测电位增加和分离电场增强的影响，使得峰电流不断增大。由图可见，分离电压低于1300 V时，分析物不能达到有效分离；当分离电压为1300 V时，分析物达到了较好的基线分离且峰形变得更加对称；然而，当分离电压高于1300 V时，D,L-色氨酸的分离度降低，而且，产生的焦耳热使得噪音增大。综合考虑分析时间、灵敏度、信噪比等各方面因素，本实验选择最优分离电压为1300 V。