用于保护肉制品颜色的乳酸菌株

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用于保护肉制品颜色的乳酸菌株\n技术领域\n[0001] 本发明涉及食品加工领域，具体涉及一种用于保护肉制品颜色的乳酸菌株。\n背景技术\n[0002] 肉制品的色泽和稳定性是一项重要感官品质，它直接决定消费者的购买意欲，因此如何使肉品保持鲜红色是肉品保鲜的重要研究课题。\n[0003] 动物肌肉的红色主要是由肌肉细胞中的肌红蛋白（Myoglobin，Mb；70%~80%）和微血管中的血红蛋白（Hemyoblobin, Hb; 20%-30%）构成，在屠宰放血后的酮体肌肉中90%以上是肌红蛋白呈色，因此肌红蛋白的含量与肉色有一定的正相关性，Mb含量越多，肉色越深。生鲜肉的色泽主要取决于肉中肌红蛋白（Mb）的三种不同化学存在形式和稳定性，即脱氧肌红蛋白（Mb-H2O）、氧合肌红蛋白（MbO2）和高铁肌红蛋白（Metmyoglobin，MetMb)的含量和分布。Mb的呈色作用源于其分子内的血红素辅基，血红素辅基中铁离子的价态以及结合的不同的基团，它们共同作用使Mb及其衍生物在吸收光谱上有所不同，因而表现出不同的颜色。在生鲜肉的贮藏期间，Mb的三种形式不断地相互转变，它们的相对含量决定着肌肉的颜色。\n[0004] 现有生鲜肉护色的方法和技术都存在不同程度的不足和缺陷。目前人们研发了多种生鲜肉护色方法，如亚硝酸盐处理、NO或CO气调包装、高氧气调包装、添加天然抗氧化剂（如茶多酚、肌肽、维生素E等）、添加带咪唑基的氨基酸（如组氨酸和半胱氨酸）等。但是被广泛采用的只有亚硝酸盐（或硝酸盐）处理，或CO气调包装和高氧气调包装等方法。国内外肉类加工企业普遍采用这亚硝酸盐（或硝酸盐）作为发酵肉品的发色剂，来获得肉制品理想的色泽和风味，延长保质期。但是，硝酸盐和亚硝酸盐的安全性问题一直困扰着人类：过量的亚硝酸盐进入血液后，可使正常的血红蛋白（二价铁）变成高铁肌红蛋白（三价铁），失去携氧功能，导致组织缺氧；硝酸盐和亚硝酸盐能与多种氨基化合物（主要来自蛋白质分解产物）反应，产生强致癌的N-亚硝基化合物，如亚硝胺等，因此开发出亚硝酸盐发色剂的替代品很有必要。\n[0005] 同样地，CO和高氧气调包装在肉类护色应用中也存在不足之处。CO与Mb结合形成碳氧肌红蛋白，呈现稳定的亮红色。Mb与CO的结合能力比其与氧的结合力高240倍左右，因此，微量的CO就能保持肌肉的鲜红色，形成的碳氧肌红蛋白同氧合血红蛋白的吸收光谱非常相似，稳定性较高，不易氧化，色泽稳定。然而使用CO气调存在毒性问题，尽管挪威肉类专家按照有毒气体检测的国际标准ISO在对气调冷却肉中使用CO气体的毒性检测后，得出结论：低浓度CO混合气体（0.5%-1.0%)对消费者并不存在任何有毒危害，但是自国际市场上出现食用CO护色金枪鱼而造成中毒的案例以后, 人们对CO 护色技术的应用提出质疑, 利用CO 进行生鲜肉护色仍存争议, 尚需深入研究。\n[0006] 高氧气调包装的原理是在密封袋中通入高浓度氧，促进氧合肌红蛋白的形成，从而使肌肉呈现鲜红色，但是高浓度氧气会加速脂肪氧化，影响肉质。总之，气调包装的使用存在商榷的地方，如何搭配使用混合气体，如何合理使用CO等都是研究的热点。\n[0007] 除了上述几种肉类护色剂之外，近几年, 有许多关于微生物对发酵肉制品颜色影响的报道，即应用微生物将肌红蛋白（Mb）转变成红色的衍生物(Arihara K, Kushida H, Kondo Y, et al. Conversion of metmyoglobin to bright red myoglobin derivatives by Chromobacterium violaceum, Kurthiasp., and Lactobacillus fermentum JCM1173. J. Food Science, 1998(53): 38-42)。研究发现，发酵乳杆菌JCM1173能将高铁肌红蛋白（Met-Mb）转变成亮红色的NO-Mb。Morita (Morita H, Yoshikawa H, Sakata R, et al. Synthesis of nitric oxide from the two equivalent guanidino nitrogens of L-arginine by Lactobacillus fermentum. J Food Sci, 1997(12):7812-7815) 对10株发酵乳杆菌进行研究发现，在MRS培养基中它们全部能够将Met-Mb转变成NO-Mb，其中IFO3956的转化能力最强，从而推测发酵乳杆菌IFO3956可能含有细菌一氧化氮合酶（NOS）。Moler (Moler J K S, Jensen J S, Skibsted L H, et al. Microbial formation of nitrite-cured pigment, nitrosylmyoglobin, from metmyoglobin in model systems and smoked fermented sausages by Lactobacillus fermentum strains and a commercial starter culture. Eur. Food Res. Technol., 2003, 216:463-469) 将发酵乳杆菌JCM1173和IFO3956应用到无硝发酵肠生产中，获得了稳定的腌肉颜色 。\n[0008] 除乳酸菌外，也有研究报道了葡萄球菌的发色作用。Morita研究发现几种葡萄球菌能够使发酵肠产生理想的红色，而且在某些情况下形成的颜色要比亚硝酸盐腌制肉还稳定(Morita H, Sakata R, Nagata Y. Nitric oxide complex of iron and bacterial influence on its formation. J Food Sci., 1996(61):1021-1023; Morita H, Sakata R, Nagata Y. Nitric oxide complex of iron(Ⅱ) myoglobin converted from metmyoglobin by Staphylococcus xylosus. J Food Sci, 1998(63):352-355)。\n[0009] 中国专利“一种戊糖片球菌菌株和以该菌株支撑的发酵剂及该发酵剂在肉食品中的应用”（专利号 ZL03126227.9）将戊糖片球菌和木糖葡萄球菌制成的复合发酵剂用于肉制品如发酵香肠的生产过程中，发色效果良好，且风味浓郁，提高了产品的风味品质.。\n[0010] 以上报道和专利均局限于利用乳酸菌或葡萄球菌对发酵类肉制品的发色效果，但并未见关于生鲜肉护色文献资料。\n[0011] 随着人们对食品安全性的认识和要求的提高，人们希望有一种新型的护色剂可以代替亚硝酸和气调包装，它既能保持肉品原有的风味，又能维护或延长生鲜肉鲜艳的颜色。\n利用公认安全的（GRAS）食品级微生物的代谢产物进行生鲜肉护色具有较大的发展潜力。\n发明内容\n[0012] 本发明的目的在于根据现有技术中存在的上述不足，提供一种保护肉制品颜色的乳酸菌株，命名为H菌株。\n[0013] 本发明的另一目的是提供上述乳酸菌株的应用。\n[0014] 本发明通过以下技术方案实现上述目的：\n[0015] 一种用于保护肉制品颜色的乳酸菌株，所述菌株为唾液乳杆菌H株（唾液乳杆菌 H strain）Lactobacillus salivarius H strain，保藏单位为中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC NO：M 2010374，保藏地址为中国. 武汉. 武汉大学，保藏日期为2010年12月31日。\n[0016] 上述用于保护肉制品颜色的乳酸菌株，菌落形态为：菌落呈圆形、隆起、乳白色、表面光滑、菌落直径1～2mm；菌丝粘稠，无特有色素；无芽孢，革兰氏阳性菌；细胞呈短杆状，单个或成双排列；不运动，兼性厌氧；主要生化特征：接触酶阴性，亚硝酸盐还原酶阳性，一氧化氮合酶阳性，高铁肌红蛋白还原酶阳性，无氨基酸脱羧酶活性；葡萄糖、乳糖、蔗糖、半乳糖、麦芽糖、甘露醇、果糖和海藻糖发酵产酸实验阳性；葡萄糖酸盐发酵产酸实验阴性；\n不产过氧化氢，不产硫化氢，不水解明胶和淀粉，不水解精氨酸；乳酸定性阳性，V-P反应阴性；生物安全性检验H菌株无致病性。\n[0017] 上述用于保护肉制品颜色的乳酸菌株，其16S rRNA序列如SEQ ID NO:1所示。\n[0018] 一种肉制品护色剂，其特征在于包括上述用于保护肉制品颜色的乳酸菌株。\n[0019] 上述肉制品护色剂的制备方法，包括以下步骤：\n[0020] （1）菌种的发酵培养：选择菌龄在12~18小时的H菌株种子，接种量为3%~5%（V/V或V/W），液体改良MRS培养基37℃发酵培养，发酵时间18~24小时；\n[0021] 上述液体改良MRS培养基配制：葡萄糖20g，蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母提取物\n5g，柠檬酸二铵2g，磷酸氢二钾2g，乙酸钠 5g，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4·4H2O 0.25g，吐温80（即Tween 80） 1mL，碳酸钙15g，蒸馏水1000mL，pH6.4~7.0，121℃，灭菌15~30min。 [0022] （2）发酵完成后收集菌体，加入稀释剂，混合即得到肉制品护色剂。\n[0023] 所述稀释剂优选无菌水、纯净水或蒸馏水。\n[0024] 所述菌体与稀释剂的质量比优选为1~10：10~19。\n[0025] 所述肉制品护色剂在保护肉制品颜色中的应用，尤其在新鲜或冷冻的肉制品加工过程中的应用。采用浸泡法或喷淋法将护色剂附着在新鲜或冷冻的肉制品表面；所述浸泡法是将肉制品放在护色剂中浸泡，晾干后真空包装，再置于20℃保存；所述喷淋法是将护色剂加入到乳酸溶液中，喷洒到肉制品表面，喷洒剂量约为50~100ml护色剂/1000g肉制品。\n[0026] 本发明具有以下有益效果：\n[0027] 本发明的用于保护肉制品颜色的乳酸菌株为安全菌株，无致病性，且具有较强的护色能力，既能保持产品原有的风味，又能保持发酵肉或生鲜肉鲜艳的颜色。可以避免因使用亚硝酸盐发色剂而产生的食品安全问题，也不会像气调包装那样可能会导致CO中毒或者产生脂肪氧化问题。\n附图说明\n[0028] 图1. 实施例1中筛选H菌株菌落形态；\n[0029] 图2. 油镜下H菌株形态；\n[0030] 图3. H菌株分离、筛选流程图；\n[0031] 图4. H菌株的16S rRNA分析比对结果图，其中1：FJ390111(植物乳杆菌)，2：\nAB470238(米酒乳杆菌)，3：AB470231(乳酸链球菌)，4：H菌株，5：AY137588(唾液乳杆菌)，6：EU694139(保加利亚杆菌)，7：EF468098(嗜酸乳杆菌)，8：AB375445(弯曲乳杆菌)，9：AF182720(发酵乳杆菌)；\n[0032] 图5. 各处理猪肉放置1天后的颜色比较图，其中A为无菌蒸馏水的空白对照组，B为添加NaNO2的阳性对照组，C为添加H菌株组（H菌株组），D组添加发酵乳杆菌J；\n[0033] 图6. 各处理猪肉放置2天后的颜色比较图，其中A为无菌蒸馏水的空白对照组，B为添加NaNO2的阳性对照组，C为添加H菌株组（H菌株组），D组添加发酵乳杆菌J；\n[0034] 图7. 各处理猪肉放置3天后的颜色比较图，其中A为无菌蒸馏水的空白对照组，B为添加NaNO2的阳性对照组，C为添加H菌株组（H菌株组），D组添加发酵乳杆菌J；\n[0035] 图8. 不同菌剂处理猪肉的明度值（L值）随时间的变化图；\n[0036] 图9. 不同菌剂处理猪肉的红度值（a值）随时间的变化图；\n[0037] 图10. 不同菌剂处理猪肉的黄度值（b值）随时间的变化图；\n[0038] 图11. 各处理猪肉放置1天后的光谱扫描结果图；\n[0039] 图12. 各处理猪肉放置2天后的光谱扫描结果图；\n[0040] 图13. 各处理猪肉放置3天后的光谱扫描结果图；\n[0041] 图14. 各处理冷鲜肉放置0天后的颜色比较图，其中A为无菌蒸馏水的空白对照组，B为添加NaNO2的阳性对照组，C为添加H菌株组（H菌株组）；\n[0042] 图15. 各处理冷鲜肉放置2天后的颜色比较图，其中A为无菌蒸馏水的空白对照组，B为添加NaNO2的阳性对照组，C为添加H菌株组（H菌株组）；\n[0043] 图16. 各处理冷鲜肉放置4天后的颜色比较图，其中A为无菌蒸馏水的空白对照组，B为添加NaNO2的阳性对照组，C为添加H菌株组（H菌株组）；\n[0044] 图17. 各处理冷鲜肉放置6天后的颜色比较图，其中A为无菌蒸馏水的空白对照组，B为添加NaNO2的阳性对照组，C为添加H菌株组（H菌株组）；\n[0045] 图18. 不同处理冷鲜肉的红度值（a值）随时间的变化图；\n[0046] 图19. 不同处理冷鲜肉的黄度值（b值）随时间的变化图。\n具体实施方式\n[0047] 下面以实施例解释本发明的技术方案，但不以任何方式限制本发明。\n[0048] 实施例1 \n[0049] 1. 菌株的初步分离、筛选\n[0050] （1）配制培养基\n[0051] 改良MRS固体培养基：葡萄糖20g，蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母提取物5g，柠檬酸二铵2g，磷酸氢二钾2g，乙酸钠 5g，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4·4H2O 0.25g，吐温80（即Tween 80）1mL，碳酸钙15g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH6.8，121℃，灭菌15 min。\n[0052] （2）样品分离、筛选菌株\n[0053] 从发酵火腿中取样品1.0g加入到10.0ml无菌水中混匀，此为稀释10倍，取10倍\n2\n稀释样液1.0ml，再加入9.0mL的无菌水中混匀稀释，此即为稀释10 倍，依此法逐步稀释到\n10\n10 倍，然后取稀释液1.0ml于培养皿中并加入20ml，50℃的改良MRS固体培养基，摇匀，在\n37℃培养箱中培养18~24h，挑取各培养基中溶钙圈较大的单菌落，重复此步骤，每一步纯化都要镜检观察，直到细胞形态一致后将单菌株划线于改良MRS固体培养基中培养24h，之后用无菌甘油封存于4℃或-20℃保存。\n[0054] （3）筛选能转化血红蛋白的菌株\n[0055] 将血红蛋白溶液加入到已冷却至50℃的改良MRS固体培养基中，高铁血红蛋白终浓度为2-5mg/ml。将步骤（2）所得的菌株用稀释倒平板法接种到含有血红蛋白的改良MRS固体培养基中，于37℃培养24~48h，挑选具有明显亮红色或褐红色的菌落，进一步做划线分离，每一步纯化都镜检观察，直到细胞形态一致后将单菌株划线于改良MRS固体培养基中，37℃培养24h后无菌甘油封存于4℃或-20℃保存。\n[0056] 2. 对步骤1中所得菌株进行初步鉴定\n[0057] 对步骤1所得的菌株进行初步鉴定，包括革兰氏染色、乳酸菌生理生化鉴定、16S rRNA测序和生物安全性检验，具体方法如下：\n[0058] （1）革兰氏染色\n[0059] 1）涂片固定；2）草酸铵结晶紫染1分钟；3）自来水冲洗；4）加碘液覆盖涂面染约\n1分钟；5）水洗，用吸水纸吸去水分；6）加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，20秒后水洗，吸去水分；7）蕃红花染色2min后，自来水冲洗。干燥，镜检。革兰氏阳性菌体呈紫色，阴性菌体呈红色。\n[0060] （2）乳酸菌生理生化鉴定，包括以下部分：\n[0061] （a）过氧化氢酶试验，挑选过氧化氢酶阴性菌株。用接种环挑取固体培养基上的菌落，置于洁净试管，滴加3%过氧化氢溶液2ml，观察结果。0.5min内产生气泡者为阳性菌株，否则为阴性菌株。\n[0062] （b）乳酸定性实验。取菌液10ml，加入10% H2SO4 1ml，再加入2% KMnO41ml。取含氨的硝酸银溶液浸湿的滤纸条，横搭在试管口上，水浴加热试管，如滤纸变黑，为乳酸定性阳性，否则为阴性。\n[0063] （c）需氧试验：将分菌株分别接种于装有9cm液体MRS培养基的试管内，37℃静置培养12h后，观察生长情况。凡液体清亮，管底大量菌体沉淀，或者管壁有絮状凝为厌氧菌；\n液面上层清亮0.8~1.2cm厚，下层混浊，管底大量沉淀为微好氧菌；液体自下而上均匀混浊为兼性厌氧；液体清亮，液面有菌膜、菌环为好氧菌。\n[0064] （d）淀粉水解试验：将淀粉琼脂倾倒入灭菌培养皿内，凝固后采用划线法接种菌株，划“十”字或数条线，37℃培养48h，滴加碘液于平板上，使碘液能均匀铺满整个平面，如能水解淀粉，则菌苔周围淀粉被分解而与碘液不显紫色，形成无色区，根据无色区域的大小，也可说明该菌株分解淀粉能力的大小。\n[0065] （e）明胶液化试验： 将菌株接种于明胶基础培养基中，37℃恒温培养，一支未接种的试管作为对照。将接种的和未接种的对照管置于冰箱或冷水中观察实验结果。如对照管凝固时，接种管液化为阳性反应，凝固为阴性反应；其中明胶基础培养基包括以下组分：蛋白胨1.0g，酵母提取物3g，葡萄糖0.1g，明胶12.0g，盐溶液4.0ml，蒸馏水100ml，pH \n7.0，121℃灭菌20min。\n[0066] （f）V-P试验：将试验菌株接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中，37℃恒温培养\n24~48h。取菌液1mL，加0.6ml 5%ɑ-萘酚溶液及0.2ml 40%氢氧化钾混合，用力振荡，再放入37℃温箱中保温15min～30min，以加快反应速度。如培养基渐呈红色，即表示V-P反应阳性，于4h内不显红色时即可称为阴性；其中葡萄糖蛋白胨水培养基包括以下组分：胰蛋白胨 5g，葡萄糖 5g，磷酸二氢钾 5g，蒸馏水1000ml，pH 7.5，121℃灭菌20min。\n[0067] （g）运动性检查：将菌株用直针穿刺接种于含有1％琼脂的半固体MRS培养基，\n37℃培养48h，观察结果，如若培养物只生长在接种的穿刺线上，边缘十分清晰，则表示菌株无运动性。如培养物生长由穿刺线向四周呈云雾状扩散，其边缘模糊呈云雾状，表示菌株有运动性。\n[0068] （h）碳水化合物发酵产酸试验：各种糖类包括葡萄糖、葡萄糖酸钠、乳糖、蔗糖、半乳糖、山梨醇、麦芽糖、甘露醇果糖以及海藻糖，分别配制成1%的糖溶液，115℃灭菌20min，以无菌操作把糖液加入基础培养基中。接种于混合后培养基中，37℃培养，培养液由紫变黄为产酸阳性，否则为产酸阴性；基础培养基包括以下组分：蛋白胨10g，氯化钠5g，1.6%溴甲o\n酚紫溶液5ml，蒸馏水1000mL，pH 7.4，121C灭菌20min。\n[0069] （3）16SrRNA测序\n[0070] 提取步骤1所得菌株的总基因组DNA，用PCR进行扩增。PCR反应程序：94℃预变性5min，94℃变性45s，51℃退火45s，72℃延伸90s，30个循环，最后72℃延伸8min。\n[0071] PCR反应在TaKaRa的PCR仪上进行。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后在紫外检测仪下观察。PCR产物经纯化后，由上海英骏生物技术有限公司进行测序，要求测通。将接拼后的结果上网：http://www.NCBI.nlm.nih.gov/，利用BLAST软件，将测定得到的基因序列与GenBank数据库进行序列比对分析，进行同源性比较。\n[0072] （4）生物安全性检验\n[0073] 用大肠杆菌O78( Escherichia coli O78)作为致病菌株，健康的昆明（KM）小白鼠为试验动物。小鼠分为阴性对照组(Ⅰ组)：无H菌株，无攻毒大肠杆菌；Ⅱ组：无H菌株，灌胃攻毒大肠杆菌；Ⅲ组：无攻毒大肠杆菌，灌胃H菌株；Ⅳ组：先灌胃活的H菌株，后灌胃攻毒大肠杆菌；Ⅴ组：先灌胃攻毒大肠杆菌，后灌胃活的H菌株。H菌株和大肠杆菌均取培\n8\n养至对数期后期菌液，用生理盐水稀释至10 个/ml。定期采取小鼠粪便约0.1g，用M17和EMB选择培养基测定粪便中H菌株和大肠杆菌的数量。每天观察记录各组小鼠生长健康状况包括发病（外观、毛发整齐光滑与否、活不活动），腹泻（粪便拉稀）与死亡；每天记录各组动物的摄食量，体重变化。\n[0074] （5）检测结果与分析\n[0075] （a）形态学特征\n[0076] 在37℃培养48小时后，H菌株菌落呈圆形、隆起、乳白色、光滑、直径1～2 mm，菌丝粘稠，无特有色素（如图1所示）。\n[0077] 用革兰氏染色法进行染色，油镜观察，革兰氏染色呈紫色，是无芽孢革兰氏阳性菌。细胞呈短杆状，单个或成双排列，为典型杆菌形态（如图2所示）。\n[0078] （b）生理生化特征，结果见表1和表2。\n[0079] 表1 H菌株的生理生化特征\n[0080] \n[0081] 注：+表示阳性反应，－表示阴性反应\n[0082] 表2 碳水化合物发酵的鉴别特征\n[0083] \n[0084] 注：+表示阳性反应，－表示阴性反应\n[0085] （c）H菌株的16S rRNA测序分析\n[0086] H菌株的16S rRNA序列如SEQ ID NO:1，长度：1464 bp。\n[0087] （d）通过生物安全性检验可知H菌株无致病性，有一定的抑制大肠杆菌O78的能力。 \n[0088] 根据H菌株的生理生化特征，按照Bergey’s细菌鉴定手册有关乳酸菌的鉴定标准及16S rRNA测序分析，结果显示H菌株与唾液乳杆菌的同源性最高（100%），从生理生化特征及分子系统学角度证实H菌株为唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius），且H菌株无致病性，为安全菌株。\n[0089] 实施例2 H菌株的护色性能筛选试验\n[0090] 对H菌株进行护色性能筛选试验。理想的具有护色效果的菌株必须同时满[0091] 足以下条件：不产过氧化氢，不产硫化氢，不水解精氨酸、发酵葡萄糖产酸不产气和无氨基酸脱羧酶活性；亚硝酸盐还原酶阳性，一氧化氮合酶阳性，高铁肌红蛋白还原酶阳性。具体试验步骤如下：\n[0092] （1）配制培养基\n[0093] 检测培养基1：牛肉膏0.5g，酵母膏0.5g，吐温80 0.05ml，MnSO4·4H2O 0.01g，蒸馏水1000ml，琼脂15g，pH6.5。121℃灭菌15min后，添加10g经过 115℃、20min灭菌的葡萄糖。\n[0094] 4%MnO2的检测培养基1：在检测培养基1配方的基础上，添加MnO2 40g，121灭菌\n15min后，添加10g经过 115℃、20min灭菌的葡萄糖。\n[0095] 检测培养基2：蛋白胨10g，NaCl 5g，牛肉膏10g，半胱氨酸0.5g，蒸馏水1000mL，pH 7.0~7.4，112℃灭菌20~30min。\n[0096] 检测培养基3：精氨酸30g，葡萄糖0.5g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，柠檬酸钠2g，磷酸氢二钾2g，乙酸钠 5g，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4·4H2O 0.25g，吐温80 1ml，蒸馏水\n1000ml，pH6.8~7.0，121℃，灭菌15 min。\n[0097] 检测培养基4：蛋白胨10g，氯化钠5g，葡萄糖10g，1.6%溴甲酚紫溶液5ml，蒸馏水\n1000mL，pH 7.4，121℃，灭菌15min。\n[0098] 检测培养基5：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母提取物5 g，K2HPO4 2g，柠檬酸二铵2 g，乙酸钠5 g，葡萄糖0.5 g，吐温80 1ml，MgSO4.7H2O 0.5 g，MnSO4 0.25 g，CaCO3 0.2g，维生素B6 5mg，1.6％澳甲酚紫乙醇溶液0.625ml，所述的氨基酸，蒸馏水1000ml，pH5.5，\n121℃，灭菌10min。\n[0099] （2）筛选具护色能力的菌株，筛选指标为：不产过氧化氢，不产硫化氢，不水解精氨酸、发酵葡萄糖产酸不产气和无氨基酸脱羧酶活性。具体测试步骤如下：\n[0100] （a）过氧化氢试验。将菌株用划线法接种于检测培养基1上面，然后在检测培养基\n1上面倾注一层2ml厚的4%MnO2的检测培养基1，30℃培养5天，连续观察菌落周围MnO2黑色的变化，黑色溶解者为产H2O2阳性，产生H2O2；否则为阴性，不产生H2O2。\n[0101] （b）产硫化氢试验。将菌株接种在检测培养基2中，然后把用浓度为80g/L的乙酸铅浸透，80℃烘干，121℃，灭菌15min后，悬挂于接种试管内，置于室温培养，纸条变黑为阳性反应，即产生硫化氢；否则为阴性反应，不产硫化氢。\n[0102] （c）水解精氨酸试验。将菌株接种到带有倒置杜氏小管的检测培养基3中，并加入经过121℃、20min灭菌液体，液体石蜡覆盖培养基液面，30℃培养24h。观察杜氏小管内是否有气泡产生，有气泡产生为阳性，产生氨气，水解精氨酸；否则为阴性，不产氨气，不水解精氨酸。\n[0103] （d）发酵葡萄糖试验。将菌株接种到带有倒置杜氏小管的葡萄糖产气培养基中，\n30℃培养24h。观察杜氏小管内是否有气泡产生和培养液的颜色是否有变化。杜氏小管内有气泡产生为阳性试验，产气；否则为阴性，不产气。培养液由紫变黄为阳性，产酸；否则为阴性，不产酸。\n[0104] （e）氨基酸脱羧酶试验。将菌株分别接种到添加有0.5%酩氨酸、0.25%组氨酸、\n0.25%赖氨酸、0.25%精氨酸的检测培养基5的试管内，在30℃连续培养并观察7天。培养液呈紫色或红色的为阳性，产氨基酸脱羧酶；呈黄色者为阴性，不产氨基酸脱羧酶。\n[0105] （f）亚硝酸盐还原酶阳性。\n[0106] ①亚硝酸还原酶粗酶的提取：取培养至对数期后期菌液于冷冻离心机中10000 rpm 4℃离心20min收集菌体，加入pH7.5磷酸盐缓冲液清洗菌体2~3次。采用超声波细胞破碎法（工作/间歇时间均为3s，350W，15min，冰浴）破碎菌体，于冷冻离心机中10000 rpm \n4℃离心20 min，收集上清液。\n[0107] ②亚硝酸盐还原酶酶活的测定（采用Na2S2O4-甲基紫精法）：\n[0108] 溶液 ：称取0.4g磺胺，放入盛有160mL去离子水的200mL容量瓶中，在沸水浴上加热溶解。冷却后（必要时过滤）加入20mL盐酸（ρ=1.19g/mL），用去离子水定容，避光保存。\n[0109] 溶液 ：称取0.1g二盐酸-1-萘乙二胺（含量98.5%以上），放入100mL容量瓶中，加去离子水溶解后定容，避光保存。\n[0110] 溶液 ：量取445ml盐酸（ρ=1.19g/ml），放入1000ml容量瓶中，加去离子水稀释定容。\n[0111] 反应液组成（2ml）：0.1 mol/L Tris-HCl 1ml，pH 7.5；0.01 mol/L NaNO2 0.3 mL；\n0.02 mol/L甲基紫精 0.1 mL；0.12 mol/L Na2S2O4 0.1mL；酶液0.5 mL。\n[0112] 测定时先将0.1 mol/L Tris-HCl 1mL、0.01mol/LNaNO2 0.3mL、0.02 mol/L甲基紫精 0.1mL种溶液加入试管，再加入0.5 mL酶液，然后加入0.12mol/L Na2S2O4 0.1mL并开始计时，30℃下保温 20min，取出摇动至无色时立即吸出 0.1mL反应液，加入 5.9mL去离子水中，加入溶液 1mL，再加入溶液 0.6mL，混匀。置于室温遮光处，再加入溶液 0.2mL混匀，3min后用水定容至10mL。于15min内，用1cm比色杯，以空白溶液调零，在波长538 nm处测其吸光度。从标准曲线上查得相应的亚硝酸离子质量，以不加甲基紫精的为对照。\n[0113] ③酶活测定：在30℃，pH为7.5的条件下，每分钟（min）转化1nmoL亚硝酸盐（以-\nNO2 计）所需的酶量（mL）为一个酶活单位（U）\n[0114] （g）一氧化氮合酶阳性。\n[0115] ①一氧化氮合酶粗酶的提取：取培养至对数期后期菌液于冷冻离心机中10000 rpm、4℃离心20min收集菌体，加入pH 7.5磷酸盐缓冲液清洗菌体2~3次。采用超声波细胞破碎法（工作/间歇时间均为3s，350W，15min，冰浴）破碎菌体，于冷冻离心机中10000 rpm 、4℃离心20min，收集上清液。\n[0116] ②一氧化氮合酶酶活测定： \n[0117] 反应液组成（1mL）：pH 7.0磷酸缓液50mM，CaCl2 1.0mM，FAD 10mM，FMN 10mM，H4B \n80μM，NADPH 1.0mM，酶液0.5mL。\n[0118] 加入L-Arg 1.0mM时反应开始，于30℃下振荡反应30min。于15min内，用1cm比色杯，以空白溶液调零，在波长340nm处测其吸光度，以没有加L-Arg的培养物为空白对照。\n从标准曲线上查得相应的NADPH质量，以不加L-Arg的为对照。\n[0119] ③酶活测定：在30℃，pH为7.0的条件下，每分钟（min）转化1nmol NADPH所需的酶量（mL）为一个酶活单位（U）。\n[0120] （h）高铁肌红蛋白还原酶阳性试验。\n[0121] ①高铁肌红蛋白还原酶粗酶的提取：取培养至对数期后期菌液于冷冻离心机中\n10000 rpm、4℃离心20min收集菌体，加入pH 7.5磷酸盐缓冲液清洗菌体2~3次。采用超声波细胞破碎法（工作/间歇时间均为3s，350W，15min，冰浴）破碎菌体，于冷冻离心机中\n10000 rpm 、4℃离心20min，收集上清液。\n[0122] ②高铁肌红蛋白还原酶酶活测定：\n[0123] 反应液组成（1mL：5.0mmol/L Na2EDTA 0.1mL、50.0mmol/L柠檬酸钠缓冲液(pH \n5.65) 0.1mL、3.0mmol/L亚铁氰化钾0.1mL、0.75mmol/L猪MetMb还原酶底物0.2mL、蒸馏水0.2mL、酶液0.2mL、1.0mmol/L NADH(pH 7.0) 0.1mL。最终混合物pH值为6.4, 测试温度为30℃。\n[0124] 添加NADH时反应开始，580nm波长下，每隔15s(共计2min)记录吸光度。 MbO2和\n4\nMetMb在580nm波长处的吸光度差最大，两者的摩尔消光系数为1.2×10。\n[0125] ③酶活测定：一个酶活力单位(1U)定义为，每分钟还原1nmol MetMb所需的酶量，MetMb还原酶比活性(U/g样品)表示为反应初始阶段每克样品中含有的酶活力单位。\n[0126] 结果与分析：菌株H不产过氧化氢，不产硫化氢，不水解精氨酸，发酵葡萄糖产酸不产气和无氨基酸脱羧酶活性；亚硝酸盐还原酶阳性，一氧化氮合酶阳性，高铁肌红蛋白还原酶阳性。故菌株H具有较强的护色能力，可用于肉类护色的研究。\n[0127] 实施例3 用H菌株制备鲜肉护色剂\n[0128] 将实施例1方法分离、筛选出来的菌株制备成鲜肉护色剂，具体制备方法如下： [0129] （1）H菌株培养基制备，菌种筛选培养基是以固体MRS培养基作为基本培养基，加入0.1%CaCO3，pH值为6.4，121℃灭菌20min，备用。\n[0130] （2）H菌株的发酵培养，发酵培养基是以液体培养基作为基本培养基，pH值为6.4，\n121℃灭菌30min，备用。种子菌龄12~18小时，接种量为3%~5%（V/V或V/W）。发酵时间\n18~24小时，发酵温度为37℃。\n[0131] （3）离心：发酵液3000r/min离心15min，去上清液，收集菌体。\n[0132] （4）菌体加入稀释剂，50克H菌株发酵成分加入950克蒸馏水，充分混合即得到鲜肉护色剂。\n[0133] 实施例4 护色剂的应用和护色效果比较\n[0134] 1. 材料与方法\n[0135] 供试护色剂菌种：H菌株，分离自实验室自制腌肉；发酵乳杆菌JCM1173（以下简称发酵乳杆菌J），购于中科院微生物研究所。\n[0136] 2. 肉类处理工艺方法\n[0137] 肉块随机分成4组，每组9块，A组为无菌蒸馏水的空白对照组；B组为添加NaNO2-5\n（5×10 mol/L）的阳性对照组； C组为添加H菌株组（H菌株组）；D组添加发酵乳杆菌J（J菌株组）。将切好的肉块置于各处理液中浸泡1min，取出晾干，用真空包装袋包装，随后置于\n20℃培养箱。每天取样，对各处理肉进行各项指标的测定。将不同处理的肉块置于20℃，分别于存放1d、2d、3d后取样观测，结果如图5、图6、图7所示。\n[0138] （1）感官评定\n[0139] 请由经过专门训练的10人组成评定小组，对不同试验组肉块的外观、颜色、风味和总体接受性等进行评分，评分级别1-9分（l-4：外观有缺陷，颜色暗淡，无香味或有异味，接受性差；4.1-6：外观正常，颜色玫瑰红，有轻微香味，可接受；6.1-9：外观好，颜色鲜艳，香味浓郁，接受性好）。\n[0140] 从图5可以看出处理肉在20℃存放1天后，各组颜色发生了较明显的变化。其中，H菌株组呈现较鲜艳的红色，肌肉组织结构明显，汁液流失量小。其他组肉色深浅依次是NaNO2组、J菌株组和阴性对照组。J菌株组的颜色与阴性对照组的颜色在肉眼上观察相差无几。到了第3天（图7），虽然各组的汁液流失量增大，看不到明显肌肉组织的结构，肉色变得灰白，但 H菌组较其他三组任保持一定的红色。\n[0141] 拍照后，取出各处理组肉块，对其颜色，外观，气味进行观察，并记录，按照评分标准对各处理组进行评定，最后得出的感官值如下表3所示：\n[0142] 表3\n[0143] \n[0144] 将各处理肉放置1天后，与阴性对照组相比，NaNO2组和H菌组呈现良好的色泽，其感官评定值分别达到4.8分和4.5分，接下来是J菌组（3.3分）和空白对照组（2.5分）。\n随着存放时间的延长，各组处理肉的感官评定值均呈下降趋势。第2天，NaNO2组和空白对照组的下降趋势较为明显。其总体接受性由原来的4.8、2.5分分别下降到3.8、1.5分，分别下降了21%和40%。而H菌组的变化最小，仅为11%，J菌组下降了12%。第3天，各组的感官评定值均在第2天的基础上有所下降，但变化不大，除阴性对照组以外，其余三组变化率均维持在15%以下。\n[0145] （2）色差测定\n[0146] 取样，将样品压平后，立即用色差计分析，重复测定五次，记录样品的明度值（L）、红度值（a）和黄度值（b）。\n[0147] 用色差计分别测定各组样品新鲜切面的三相颜色坐标值，即明度值（L值），红度值（a值）和黄度值（b值）。结果如图8、图9、图10所示。\n[0148] 从各图中可看出，总体上，各处理组的L值和b值差异不明显。随着时间的变化，L值和b值发生的变化也不大。而a值即肉的红度具有较明显的差异。从图9中可以看出， H菌组与空白对照组（蒸馏水组）对比，a值的差异显著( P< 0. 05)。随着存放时间的延长，各组的a值都有所下降。与空白对照组和阳性对照相比，H菌组与J菌组a值下降率比较小，其中H菌的下降率最小，3天下降了4%，J菌株组下降了17%，这与感官评定结果呈现相关性。证明用H菌株处理肉在颜色保持上具有良好的效果。\n[0149] （3） 光谱扫描\n[0150] 取肉样10g，加入90mL0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液，12000r/min均质2min。而后将混合物离心（4℃,12000r/min）20min，取上清液用Φ = 0.45um的微孔滤膜过滤。滤液放在暗处冰浴中，2h内测定。随后在400-650nm波长范围内连续记录色素提取液的光谱吸收值。\n[0151] 从光谱扫描结果可以看出，各组肉样放置1天后除了空白对照组外，其他处理组均有典型的NOMb吸收光谱，即在540nm和580nm附近各有一个吸收峰且540nm处的吸收更强，见图11。其中NaNO2组的吸收值最高，其次是H菌组> J菌组。2天后，NaNO2组仍保持原有的NOMb吸收曲线，但与1d相比吸收值下降了47%。H菌组和J菌组的吸收曲线则发生了明显的变化，在540nm和580nm的吸收峰均已消失，而出现了与空白对照组相似的吸收光谱，即在530nm处有一较平缓的吸收峰，见图12。放置3天后， NaNO2组在530nm处出现平缓吸收峰，其他组的吸收峰仍与2天的吸收峰相似，且吸收值都有相应的升高，见图13。\n[0152] 实施例5护色剂对冰鲜肉护色效果\n[0153] 1. 材料与方法\n[0154] 供试护色剂菌种：H菌株，分离自实验室自制腌肉，按实施案例3制备成H菌鲜肉护色剂。\n[0155] 2. 冰鲜肉处理工艺\n[0156] 将刚屠宰的猪肉预冷，分割切块并随机分成3组，A组为无菌蒸馏水的空白对照-5\n组；B组为添加NaNO（2 5×10 mol/L）的阳性对照组；C组为添加H菌株组（H菌株组）。将肉块置于各处理液中浸泡1mim，取出沥干1min，用真空包装袋包装，随后立即放入4℃冰箱储藏6天，隔天取样，结果如图14、图15、图16和图17所示。将样品压平后，用色差计分析，重复测定五次。\n[0157] 包装后的冰鲜肉在储藏过程中颜色呈紫红色，因为真空包装使猪肉处于低氧分压状态，鲜肉表面肌红蛋白无法以还原状态存在；当拆开包装发色半小时后，肉色即恢复鲜红色。在6天储藏过程中，NaNO2组和护色剂处理的冰鲜肉一直保持诱人的鲜红色。由图18可知，储藏6天后，经过H菌护色剂和NaNO2处理的冰鲜肉红色值a值下降率较小，分别为\n7.6%和5.8%，而蒸馏水处理的冰鲜肉a值下降率为16%。H菌护色剂组保持较低的b值，在\n4.7~5.0之间，但是蒸馏水处理组和NaNO2组b值较高，分别在5.0~5.7和5.9~6.2之间（图\n19）。另外经过H菌鲜肉护色剂处理的冰鲜肉汁液流失量较少，肌肉组织结构较明显，较好地保证了鲜肉制品的品质又达到延长货价期的目的。因此H菌鲜肉护色剂对冰鲜肉也有一定的护色作用。 \n[0158] 结论与讨论\n[0159] 本发明结果表明，所获得的一株唾液乳杆菌H株具有潜在的护色发色能力。H菌处理的鲜肉无论在感官评定还是色差测定上都优于发酵乳杆菌J组，同时也优于传统的发色剂NaNO2处理的结果。\n[0160] 根据分析，H菌株能产生亚硝酸盐还原酶、一氧化氮合酶和高铁肌红蛋白还原酶，使肌肉呈现良好色泽。说明H菌株对鲜肉有较好的护色效果。