无细胞马立克氏病病毒疫苗的制备方法

1.制备一种保护家禽对抗马立克氏病之疫苗的方法，其包括：
a1).将血清型2马立克氏病病毒在细胞培养物中传代，直至 能够产生足量的无细胞病毒；
a2).在细胞培养物中培养所述的传代病毒，直至能够得到制 备有效免疫剂量所必需的足够量无细胞病毒；
b).破碎细胞，
c).然后收集无细胞病毒，以及
d).使步骤c得到的材料至少经受下列的一种处理：
i).经离心和/或过滤澄清之；
ii).加入缓冲液；
iii).加入稳定剂；
iv).将该材料装入小瓶内；
v).冷冻干燥。
2.根据权利要求1的方法，特征在于经步骤b后无细胞病毒的 滴度至少为104pfu/ml。
3.根据权利要求1的方法，特征在于所述疫苗含有无细胞马立 克氏病血清型2病毒及药理上可接受的载体。
4.根据权利要求1的方法，特征在于所述疫苗含有无细胞SB -1病毒。
5.根据权利要求1的方法，特征在于所述疫苗含有无细胞B -24病毒。
6.根据权利要求1的方法，特征在于无细胞马立克氏病血清型 2病毒的剂量至少为每只鸡2.2pfu。
7.根据权利要求4的方法，特征在于所说的剂量为至少每只鸡 2.7pfu。
8.根据权利要求5的方法，特征在于所说的剂量为至少每只鸡 3.2PFU。
9.根据权利要求1-6的方法，特征在于所述疫苗还含有无细 胞HVT。
10.根据权利要求1-6的方法，特征在于所述疫苗是被冻干 的。

本发明涉及抗家禽马立克氏病的疫苗及制备这种疫苗的方法。\n马立克氏病(Marek′s  Disease，MD)是由一种疱疹病 毒——马立克氏病病毒(Marek′s  Disease virus， MDV)引起的家禽的恶性淋巴增殖性疾病。MD是一种普通发生于 全世界家禽生产国家的家禽疾病。于集约化生产体系下饲养的鸡将不 可避免地遭受MD带来的损失。MD影响大约6周令的鸡，12- 24周令最易感染。\n临床上已识别了三种形式的MD：典型MD、急性型MD和短暂 麻痹型MD。\n典型MD的特征是由淋巴样浸润和脱髓鞘引起末梢神经肿大，且 以麻痹为主要临床症状。死亡率可有所不同，但一般为10-15％。\n对于急性型MD，家禽内脏器官可见有多发和散在的淋巴瘤，这 种类型MD的死亡率一般比典型MD高。在未免疫的群体中，普遍发 病率为10-30％，但也可见有高达70％者。典型和急性MD的 病理学改变基本上是相似的，包括恶性转化之T淋巴细胞增殖并浸润 到正常组织内，其中典型MD侵害末梢神经，而急性MD则侵害内脏 器官。\n另外，已表明MDV是小鸡脑炎的致病因子，其临床表现是小鸡 突发麻痹。\nMD相关病毒的血清学分类可分成三种血清型：\nI型：对鸡有致病性和致瘤性的马立克氏病病毒的强毒性病毒株， 以及由之衍生的减毒非致病病毒株，\nII型：天然出现的马立克氏病病毒的非致病病毒株。\nIII型：对鸡无致病性的火鸡疱疹病毒(“HVT”)。\n目前使用的有几种类型的马立克氏病疫苗，包括从MD病毒的致 病性血清型I病毒株衍生的疫苗。这些病毒株经过系列传代后，发现 失去了致病性和致癌性，但仍保留其免疫原性。从病毒株HPRS- 16衍生的减毒病毒，即原生型MD疫苗(Churchill，A.E. et al.，J.Gen.Virol.4，557，1969)和CVI -988毒株已被获准作为活血清型IMD疫苗在商业上使用。\n血清型2MD病毒是天然非致癌的，因此在接种后的鸡体内不致 于引起肿瘤。为此，这些病毒不需要通过系列传代来人工减毒，而且 因为它们处于其天然状态，故也不可能回复为其毒性形式。除了从 1983年就已在美国获取许可的SB-1病毒株(美国专利No. 4,160,024)外，已证明HN-1也可成功地用于疫苗接种。 迄今为止，血清型1和2疫苗必须作为与细胞结合的制品来使用 (Powell，P.C.，World′s Poultry Science Journal 42，205，1986；Witter，R.L.et al.， Avian Diseases 31，829，1987；Schat，K. A.，Internews 3，13，1989)。在实际使用时，意味 着该疫苗不得不在液氮中大约-196℃条件下贮存和运输。\n因贮存和处理疫苗过程中的差错，会引起MD病毒的存活性降低 并导致接种失败。特别是在不可能以液氮贮存的乡村，细胞结合形式 的MD疫苗便不能使用。而且，MDV悬浮于细胞结合疫苗沉淀物中， 在给药前须将悬浮液混合均匀。如果混合不够均匀，则可造成疫苗剂 量不准，而导致接种失败。另外，所说疫苗的严格细胞结合性质致使 疫苗易于引起身体对滥用疫苗的敏感性。由于在次最佳条件下收获及 冷冻过程对被感染细胞的损伤，以及因不正确的安瓶解冻及在孵化器 中对疫苗进行处理而引起细胞损伤和死亡，结果致使疫苗丢失滴定。\n目前，通常使用从HVT衍生的MD疫苗。HVT最初是从火鸡 中分离出来的，其对火鸡和鸡鸭无致病性，而且在免疫原性上与血清 型1和2MD病毒是相关的。HVT被广泛用作抗MD的疫苗，且其 中使用最多的是FC126病毒株。HVT一般均作为细胞结合制剂 使用，但因为实质上几乎所有游离于细胞的病毒都可从被感染之细胞 中提取出来，所以也可作为冻干的无细胞疫苗使用。\n因为不断迫切要求将MD的经济损失降到最低限度，故要求不断 改善MD疫苗的效力。特别是在美国和欧洲已有有关由于出现强毒力 MD病毒株，而使得家禽饲养业蒙受过多损失的报导。迄今为止， HVT疫苗接种并未能产生对抗这些分离物的足够保护作用，即使提 高剂量或延长接种与攻击之间的间隔期仍不能收到明显效果。由于单 独以HVT疫苗接种的相对无效，将有利于这些很强毒力之MD病毒 野生株的传播。\n目前一种控制由很强毒力MD病毒感染所引起之疾病的有用方法 是使用含有属于不同MD病毒族之不同血清型疫苗病毒混合物的二价 和多价疫苗。业已发现，使用二价疫苗可比单独使用任何一种组份获 得更好的保护效果。这种现象称为“保护性协同作用”，其机理是， 由一种MD疫苗病毒产生的保护作用幅度可因加入第二种疫苗病毒而 得以增强(Witter，R.L.，Avian Pathology 11， 49，1982；Witter，R.L.and Lee，L.F.， Avian Pathology13，75，1984；Witter，R. L.，Avian Pathology 13，75，1984；Witter R.L.，Avian Diseases 31，752，1987； Schat，K.A.et al.，Avian Pathology 11， 593，1982)。不利的是，为了有利于这种协同作用，不得不 将这种二价疫苗制成细胞结合型制剂，迄今还得不到无细胞血清型2 MD病毒疫苗。\n由于种禽天然暴露于MD病毒和/或由于种禽接种血清型1、2、 和3病毒，所以在商品鸡体内普遍存在抗所有MD病毒血清型的MDA (母体衍生的抗体)。同源MDA对免疫接种的不利影响是众所周知 的。MDV抗体仅在低水平上干扰(无细胞)HVT疫苗。因此，为 使其后代更好地得到HVT赋予的保护，如能用无HVT的MD病毒 疫苗接种种禽群体将是很有利的。这种所谓的世代交替接种法有其潜 在的优点，即使是它们的后代用含有HVT的二价或多价疫苗接种也 是如此。然而，应用这种接种策略时要求能获得满意的无HVT疫苗 (Witter，R.L.and Lee，L.F.，Avian Pathology 13，75，1984)。如能得到含无细胞血清 型2MD病毒(例如SB-1)的疫苗，在这种世代交替中将是极为 有利的。\n根据本发明，提供了一种对抗MD以保护家禽的疫苗，其特征在 于这种疫苗含有无细胞MD血清型2病毒以及药物学上可接受的载体。\n有关血清型1和2MD病毒的早期工作证明，无细胞病毒的量 (以初级空斑形成单位pfu表示)不足以具有免疫接种所需的滴度 (美国专利4,895,718；Witter，R.L.et al.， Avian Diseases 31，829，1987；Powell，P. C.，World′s Poultry Science Journal 42， 205，1986；Schat，K.A.，Internews 3，13， 1989)。具体地说，其中已证明SB-1病毒不能产生相当大量 的无细胞病毒。\n现已发现，经进一步将血清型MD病毒传代，可使游离于细胞的 病毒量大大增加，并且如此得到的无细胞病毒仍保留其保护性特性。\n因为Witter(Avian Diseases 31，752， 1987)已清楚地证明，系列传代将对与细胞结合的血清型2MD 病毒之保护效力有不利影响，故上述发现便尤为令人惊异。\n另外，Witter(文献同上，1987)曾证明，当传代数增 加时协同作用将相应降低，与低传代数之细胞结合形式血清型2MD 病毒相比，进一步传代的细胞结合形式血清型2MD病毒不会增加 HVT病毒株FC126的保护效力。\n令人惊异的是，已发现由无细胞HVI赋予的保护作用程度，将 会因无细胞血清型2MD病毒的加入而提高。\n可按下述步骤制得本发明的疫苗：首先，对低传代数的血清型2 MD病毒，即在适当细胞培养物中培养后可用作疫苗，但不能产生足够 量游离于细胞之病毒的血清型2MD病毒进行系列传代，然后培养如 此得到的病毒，最后加工可从该培养物获得的无细胞病毒，以得到有 免疫特性的制剂。\n可从任何血清型2MD病毒株衍生出本发明的无细胞疫苗，例如 可衍生于HPRS-B-21病毒株、SB-1病毒株(见Schat et al.，美国专利4,160,024；可从Intervet公 司购得)、NH-1病毒株(Cho，B.R.and Kenzy，S. G.，Appl，Microbiol.24，299，1972)或者由 Witter介绍的分离物，如31/B/1病毒株(美国专利4, 895,718；Avian Diseases 31，752，1987)， 其中最优选的是SB-1病毒株。\n可使用本领域已知的方法对血清型2MD病毒进行连续传代。 简单地说，使病毒生长在适当的细胞培养物中，将由此收获的病毒接 种到含新鲜细胞培养物的培养基上。使血清型2MD病毒在细胞培养 物中经过几次连续传代，直到由此收获到适用量的无细胞病毒，然后 将其加工成疫苗。\n特别适宜的连续传代细胞培养物是鸡肾细胞(CK)、鸡胚成纤维 细胞(CEF)及鸭胚成纤维细胞培养物(DEF)。\n更具体地说，可将血清型2MD病毒接种到CK、CEF或DEF 培养物24-48小时细胞单层中，然后于37℃保温几天，并定期 更换生长培养基。适宜的生长培养基可以是：Eagles基本培养基 (BME)、Tryptose磷酸盐培养液、碳酸氢钠、胎牛血清及抗 生素。当有75％或更多的细胞单层遭受细胞病理影响时即进行细胞 传代。保温期结束时，用磷酸盐缓冲盐水洗整体细胞团，用胰蛋白酶 分散之并重新悬浮于少许培养基中。再次铺敷并使之在上述新鲜单层 细胞培养物上生长。连续传代次数取决于可从培养物中获得的无细胞 病毒量，以及传代病毒之免疫原性和感染特性保留情况。洗涤最后一 代细胞、用胰蛋白酶处理、离心并分散到含二甲基亚砜(DMSO) 的少量培养基中。可将此制备物慢慢冷冻至液氮温度(-70℃)， 以备作为种子病毒培养物使用。\n一般说来，按上述方法制得的本发明之无细胞制品的滴度范围为 104-107pfu/ml。\n为获得可产生足够量无细胞病毒的血清型2MD病毒所必须的传 代数，特别取决于特定的血清型2MD病毒株及无细胞病毒的所需量 或滴度。\n根据本发明，为制备疫苗所需的血清型2MD病毒的总传代数一 般在25-40次之间，更好是28-35次。\n为繁殖用CEF细胞接种的血清型2MD病毒之旋皿培养物，可 在保温24小时后接种按上述方法获得的与细胞结合的或游离于细胞 的病毒。继续保温几天后，弃去培养基上清，用胰蛋白酶依地烯 (versene)混合物除去细胞，然后将细胞离心沉淀出来并倾去上 清液。\n为了配制无细胞制品，可将沉淀的细胞悬浮在缓冲液例如磷酸盐 缓冲盐水(PBS)中或优选含稳定剂的培养基中，SPGA (Bovarnik et al.，J.Bacteriology 59，509， 1950)是最优选的稳定剂。\n可用几种方法破碎细胞，例如利用超声或冻融方法。在血细胞计 数器中检查以确定是否存在未破碎的细胞。可将经过超声处理或快速 冷冻的制品分装到小瓶内，并根据需要在EDTA存在下冻干之。可 任意地于冻干之前经过滤或离心除去细胞碎片。\n按上述方法得到的无细胞血清型2MD病毒可作为活病毒或灭活 病毒掺入疫苗中。\n含活病毒的疫苗可以以悬浮液或冻干品形式制成并投放市场。\n冻干疫苗最好含有一种或多种稳定剂。适用的稳定剂可以是 SPGA(Bovarnik et al.，J.Bacteriology 59， 509，1950)，碳水化合物(如山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、 右旋糖酐或葡萄糖)、蛋白质(如白蛋白或酪蛋白)或者它们的降解 产物，含蛋白质物质及缓冲剂(如碱金属磷酸盐)。必要时还可加入 一种或多种具有佐剂活性的化合物。用于这一目的的适当化合物可以 是维生素E醋酸酯(O/W乳剂)、氢氧化铝、磷酸盐或氧化物、矿 物油(如Bayol F(R)、Marcol 52(R))及皂甙。\n灭活MD病毒的目的是消除病毒的增殖能力。一般说来，可用化 学和物理学手段来完成。化学灭活例如可以用酶、甲醛、β内丙酯、 亚乙基-亚胺或其衍生物、有机溶剂(如卤代烃)和/或去污剂(如 Tween(R)、Triton X(R)、去氧胆酸钠、磺甜菜碱或 十六烷基三甲基铵盐)处理来达到。必要时，其后可用其他化合物中 和灭活物质；例如用甲醛灭活的材料可以用硫代硫酸盐来中和。对病 毒的物理灭活优选用高能射线照射来进行；例如可用紫外光、X射线 或γ射线。必要时可在处理后将PH值调回7左右。\n通常也可将一种佐剂(如上所述)，或必要时将一种或多种乳化 剂如Tween(R)和Span(R)加入到灭活的病毒材料中。\n疫苗应以病毒制剂的有效剂量使用，即所用免疫原性无细胞病毒 材料的量应足以使被免疫鸡产生对抗毒性MD病毒之攻击的免疫力。免 疫力定义为与未接种疫苗组相比，接种后可在鸡群体中诱导产生明显 较高水平的保护作用。\n对活疫苗来说，每只鸡的剂量可在1-6 logs pfu之间。\n一般来说，根据本发明之活疫苗的给药剂量为至少2.2logs pfu无细胞病毒，其中优选剂量为至少2.7logs pfu，更 好是至少3.2logs pfu。\n在经自然途经给药的情况下(喷雾、滴眼和滴鼻)、剂量可以为 每只鸡106-107pfu。\n灭活之疫苗可含有相当于每只鸡3-7logs pfu，更好是4 -6logs pfu的抗原量。\n根据本发明的疫苗，可以以高滴度喷雾、滴眼、滴鼻、口服(如 饮水)或通过肌肉注射、皮下注射途径给药，或在鸡获得免疫感受性 后的任何日令进行OVO注射。正常情况下是在小鸡孵出后24- 48小时施用疫苗。\n本发明的另一个方面是将无细胞MD血清型2病毒与无细胞HVT 结合成二价疫苗。已令人惊异地发现，尽管增加了传代次数，但无细 胞MD血清型2病毒仍能提高HVT的效力。\n具体地说，将SB-1毒株的无细胞血清型2MD病毒与无细胞 HVT结合使用。根据本发明，欲掺入到本发明疫苗中的HVT病毒 可以是任何可购得的病毒株，如FC126或THVPB1(可从 Intervet Inc.购得)。HVT病毒还可包含编码家禽病原体 抗原的外来基因，后者可插入其病毒基因组内形成多价疫苗。\n除无细胞血清型2MD病毒材料外，本发明还包括从感染家禽的 其他病原体衍生之疫苗的联合疫苗。无细胞血清型2MD病毒可以同 选自下面的一组疫苗病毒者联合使用：鸡瘟病毒(NDV)、传染性 支气管炎病毒(IBV)及传染性腔上囊病病毒(IBDV)。\n实施例1\nA.血清型2MD病毒SB-1和B-24的传代\n将与细胞结合的SB-1和B-24病毒接种于在6cm直径 Falcon平皿上生长24小时的SPF衍生之鸡胚细胞培养物 (1.5×106CEF/皿)上，并将至少含100pfu的0.1 ml接种物接种到平皿上的5ml组织培养基中，再将与细胞结合的 病毒加于细胞单层上以感染之。于38.5℃，在含5％CO2的大 气环境中保温5天后，按下述方法从平皿内除去细胞：\n1.倾去培养基；\n2.加入胰蛋白酶依地烯PBS溶液，以松解细胞在平皿上的附\n着力；\n3.在细胞从平皿中剥落前弃去胰蛋白酶/依地烯PBS混合物。\n4.用生长培养基洗去平皿内的细胞。\n将从步骤4获得的细胞结合之病毒的悬浮液作为下一次在CEF 细胞上传代的接种物。接受以后，按上述方法将病毒传代五次。从第 6次传代(加上初始传代)开始，使保温时间驯化为4天。\n结果：    \nSB-1    \n从康奈尔大学得到的SB-1病毒，已在接受体细胞内传代10次 (在CEF和CK细胞中7次组织培养物传代，接着在SPF鸡中传 代2次，再在CEF细胞上传代一次)。\n对得自平皿中的严重感染之细胞(传代10次)进行处理以期得 到无细胞病毒，并将其悬浮于5mlSPGA中，经检测，在10-2 稀释度时未检出游离于活细胞的病毒。\n如将SB-1病毒株传代达总共21次(得自康奈尔大学)，以 相似方法处理，则测得游离于活细胞之病毒的滴度为104.9pfu/ ml。\nSB-1病毒传代达21次时，得到滴度为106.0pfu/ml 的无细胞病毒。\n这些游离于细胞的病毒对鸡仍然是有感染性的，可诱发病毒血症， 传播给接触的家禽，并且能诱导保护性免疫反应。\nB-24\n按上述方法处理用经过第9次传代之B-24严重感染的细胞， 得到无细胞病毒，测知其滴度小于102pfu/ml。\n当检验第35次传代病毒严重感染的细胞时，所得无细胞病毒滴 度为104.7pfu/ml。\nB.制备SB-1无细胞血清型2MD疫苗\n将用200×106个CEF细胞接种的两份旋皿培养物(1750 cm2)接种于含1ml按上述方法得到的细胞结合之SB-1种子病毒 的培养基中，保温24小时后测得滴度为105pfu/ml。\n继续保温5天后，弃去上清液并用胰蛋白酶依地烯混合物除去细 胞。离心沉淀细胞，弃去上清液并在细胞中混入20mlSPGA稳 定剂，然后用超声装置处理2秒钟。\n将经过超声处理的制剂按1ml等份分装入小瓶内并冻干。    \n冻干前滴度    104.8pfu/ml\n冻干后滴度    105pfu/ml\n实施例2\n无细胞血清型2MD疫苗的效力\n给3组(每组10只)有抗血清型1、2和3之MDA的1日令 小鸡肌肉注射不同剂量的无细胞GB-1。各组所用剂量分别为每只 小鸡176pfu、460pfu和1520pfu。\n经检验是否发生病毒血症来确定疫苗的效力。因为早期实验中已 经证实，如果未接种疫苗的鸡与接种SB-1(高传代数)的鸡接触， 接种(200pfu 的细胞结合病毒)后2周时有三分之二接触的鸡 受到感染，故决定不检验2周后有无病毒血症。于疫苗接种后1和2 周取血沉棕黄层，并用标准方法在CEF细胞上检查SB-1病毒的 存在。将培养物保温1周后进行定量检测。下列表1中记录的结果表 明，每只鸡接受176pfu者病毒血症发生率为56％，而每只鸡 接受460pfu和1520pfu的两组中所有鸡均出现病毒血症。\n表1 疫苗剂量            阳性鸡数/试验数(接种后14天) 176pfu                      5/9 460pfu                     10/10 1520pfu                     7/7\n实施例3\n对HVT无细胞疫苗和HVT/SB-1疫苗在MDA阳性鸡中\n诱导之免疫力的比较\n病毒：使用的病毒株是：\nHVT-其为Intervet PB1 THV病毒株\nSB-1-此病毒株经进一步传代直到病毒变得生长迅速并\n     释放了无细胞病毒。无细胞病毒制剂是在SPGA\n     稳定剂中超声处理被感染的CEF细胞而制得的。\n将带有母体衍生的抗血清型1、2和3MD病毒之抗体的2-3 天令小鸡分成3组。\nA组  37只鸡    未接种疫苗\nB组  42只鸡    每只鸡接种1000pfu HVT疫苗。\nC组  42只鸡    每只鸡接种1000pfu HVT疫苗和\n               250pfu SB-1病毒。\n9天令时用毒性RBIB病毒攻击所有各组鸡；\n在整个实验过程中，须不定时地杀死一些鸡，以免隔离间内过分 拥挤。\n对所有死亡或杀死的鸡进行大体和显微镜检查，以发现有无马立 克氏病造成的损伤。\n接种疫苗的各组鸡中，攻击后(PC)4天有1只死亡，未接受 疫苗组在攻击后5至9天有5只死亡，组织学检查发现淋巴样组织， 特别是腔上囊和胸腺萎缩。这些观察结果连同定时死亡情况提示鸡遭 受到了MD的溶细胞性病理改变。\n图1的矩形图显示，在攻击后每次偶然杀死之鸡的数目，以及在 死后或组织学检查时发现患有马立克氏病之鸡的数目。\n图2的矩形图显示接种和未接种疫苗的鸡在攻击后MD的发病率。\n在未进行疫苗接种组观察到有高MD发病率(图1和2)。攻击 后11天时杀死的7只鸡中有3只见有MD肿瘤。因MD造成的死亡 在攻击后11天时开始。攻击后第28天时有8只患病鸡被杀死，在 攻击后第32天时其余8只鸡被杀死，其中2只看起来病性严重。所 有16只鸡均在肝脏、肾和其他器官见有肿瘤。总共37只鸡中，5 只似乎死于“溶细胞性MD”，27只有MD肿瘤或死于MD。在攻 击后第11天杀死4只没有MD损伤的鸡，故得以发生MD的时间很 短(1只鸡死于非特定原因)。\n接受HVT疫苗的实验组中，在第21天时10只被杀死的鸡中 的2只，以及在此时间死亡的2只均首先见有MD肿瘤。在32和 42天时，死后检查5只病死的鸡，发现它们均有MD肿瘤。实验期 间共有7只鸡死于MD。攻击后53天杀死的其余8只鸡没有MD征 象。被杀死或死于MD的共42只鸡中，16只有MD肿瘤。在攻击 后11天杀死的10只鸡，攻击后21天杀死的8只鸡和攻击后53 天杀死的8只鸡均未见有MD损伤。\n在双疫苗接种组中MD的发病率很低，攻击后53天被杀死时， 只有1只鸡肝脏中有MD肿瘤。总共42只鸡中，4只死于非特定病 因，其中1只可能死于“溶细胞性MD”。攻击后第11天杀死的 10只鸡、攻击后第21天杀死的11只鸡、攻击后第42天杀死的 3只鸡以及攻击后第53天杀死的14只鸡中的13只均未发现有MD 损伤。\n结果证明，在带有抗血清型2和3病毒MDA的小鸡中，无细胞 双价疫苗SB-1/HVT提供了很高水平对抗RBIB严重攻击的 保护作用。\n虽然HVT疫苗能提供对抗这种严重攻击的显著保护作用，但仍 有大约37％的鸡显示有某些MD症状。\n应说明的是，因为大约在攻击后4周时，大多数存活的未接种鸡 显示有明显的MD临床征象，所以都在攻击后32天时被杀死了。\n在攻击后53天完成实验时，观察到接受双价疫苗的鸡要比单独 接种HVT的鸡体重较重。这一现象是令人惊异的，因为当杀死时， 8只接种HVT的鸡都没有明显的MD损伤。\n实施例4    \n对无细胞SB-1病毒和HVT/SB-1疫苗在无MDA鸡中 诱导之免疫力的比较\n用在SPGA中配制的200pfu冻干之无细胞SB-1病毒 皮下接种20天令的SPF鸡(每只鸡0.1ml)。第二组鸡接受 200pfu SB-1疫苗和1000pfu HVT疫苗病毒。\n1周后，经肌肉注射用毒性RBIB病毒株攻击这些鸡连同20 只同样来源和日令之未经疫苗接种的鸡。记录6周后每组死于马立克 氏病之鸡的数目。\n表2 疫    苗               死亡的鸡数/检验数 对照组                    20/20 SB-1                      6/20 HVT/SB-1                  0/20