一种木霉高孢粉可湿性粉剂及其制备方法

1.一种木霉高孢粉可湿性粉剂，其特征在于，原料组成的质量百分数为：
各组份的百分数含量之和为100％；其中，所述的木霉高孢粉采用的生防菌株其分类命名为绿色木霉(Trichoderma viride)TV-1，保藏编号为CGMCC No.2848，其孢子含量为
100～1000亿个/克，活孢率80％以上。
2.一种权利要求1所述的木霉高孢粉可湿性粉剂的制备方法，其特征在于，该方法采用以下步骤：
(1)将木霉高孢粉、敌克松原粉、硅藻土或膨润土、木质素磺酸钠、活性炭、柠檬酸、羧甲基纤维素钠按质量配比混合均匀；
(2)原料预粉碎，再经过气流粉碎，过325目标准筛；
(3)合格产品的质量检验指标如下：木霉孢子含量5亿个/克以上、活孢率80％以上、湿润性小于2分钟、悬浮率70％以上、细度99％以上过325目标准筛、水分含量小于2％、pH值为5～6。

一种木霉高孢粉可湿性粉剂及其制备方法\n技术领域\n[0001] 本发明涉及生物农药，更具体地说，本发明涉及一种木霉活体生物制剂及其制备方法\n背景技术\n[0002] 木霉作为一类生防丝状真菌，早在20世纪30年代就应用于土传真菌病害的生物防治。近几十年来，随着温室栽培技术的广泛应用，木霉也渐渐用于一些顽固性叶部病害，如灰霉病、白粉病、叶霉病等的生物防治。木霉对植物病原真菌的拮抗作用主要表现为产生抗生素、重寄生作用、溶菌作用、竞争作用等。其中，木霉的竞争作用、重寄生作用在抑制病原真菌过程中发挥着重要的作用。\n[0003] 木霉的制剂，目前以麦麸粉剂为主，最近几年，针对其存活期短的缺点，陆续出现了一些制剂化的木霉产品，如加入大量的硅藻土粉剂化、进行包衣丸化成颗粒剂，大大改善了木霉的存活条件，延长了保存期，稳定了菌剂质量，保障了防治效果。这些制剂除极个别使用木霉有效提取物外，绝大多数是采用活体，包括菌丝体、分生孢子、厚垣孢子，即依然以活体农药为主，其生物相容性仅见1～2篇文献报道。因此，木霉活体生物制剂还需要进一步改进，也需要开发一些实用的新剂型。\n[0004] 木霉是活体菌剂，作为杀真菌剂，其制剂性能是影响药剂效果的关键因数。木霉的制剂化必需尽可能地充分考虑与木霉的生物相容性，创造一个有利于存活的条件，而且施用后，需要提供一个有利于木霉孢子萌发、定殖、存活的微生态环境。因此，在木霉剂型中添加能使孢子存活、免受各种环境因子如紫外线伤害的物质，抑制与木霉竞争的叶面微生物的物质，促进木霉迅速占据生态位点、并形成优势种群的物质，必将改善木霉菌剂的实际使用效果。\n发明内容\n[0005] 本发明的目的在于针对现有技术的不足之处，特别是微生物农药速效性差的弊端，提供一种活性高、效果稳定、易储藏、方便运输、使用简便的生物制剂。同时，本发明还提供该生物制剂的制备方法。\n[0006] 本发明的目的通过下述技术方案予以实现。\n[0007] *除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为质量百分数。\n[0008] 本发明提供了一种木霉高孢粉可湿性粉剂，原料组成的质量百分数为：\n[0009] 木霉高孢粉 5％～6％\n[0010] 敌克松原粉 1％～2％\n[0011] 硅藻土或膨润土 85％～90％\n[0012] 木质素磺酸钠 2％～3％\n[0013] 活性炭 0.5％～1.0％\n[0014] 柠檬酸 0.1％～0.5％\n[0015] 羧甲基纤维素钠 1％～2％\n[0016] 本发明所采用的生防菌株其分类命名为绿色木霉(Trichoderma viride)TV-1，保藏编号为CGMCC No.2848；所述的木霉高孢粉是利用旋风分离获得的木霉高孢粉，所述的木霉高孢粉孢子含量为100～1000亿个/克，活孢率80％以上。\n[0017] 所述的敌克松原粉为化学杀菌剂，起到克服木霉药效迟缓性、增加杀菌效果的作用，是木霉高孢粉可湿性粉剂的增效剂。\n[0018] 所述的活性炭是光保护剂，柠檬酸是pH调节剂。活性炭保护孢子的活性；柠檬酸调节微环境，促进孢子的存活、萌发、定殖。\n[0019] 所述的硅藻土或膨润土是吸附剂，木质素磺酸纳是分散剂，羧甲基纤维素钠是增粘剂。硅藻土或膨润土另外的一个重要特征是与木霉具有良好的生物相容性，可提供一个有利于木霉孢子存活的环境，延长木霉高孢粉可湿性粉剂的保质期。\n[0020] 本发明提供了一种木霉高孢粉可湿性粉剂的制备方法，该方法包括以下步骤：\n[0021] (1)将木霉高孢粉、敌克松原粉、硅藻土或膨润土、木质素磺酸钠、活性炭、柠檬酸、羧甲基纤维素钠按质量配比混合均匀；\n[0022] (2)原料预粉碎，再经过气流粉碎，过325标准筛；\n[0023] (3)质量检验，满足木霉孢子含量5亿个/克以上、活孢率80％以上、湿润性小于\n2分钟、悬浮率70％以上、细度(过325目标准筛)99％以上、水分含量小于2％、pH值5～\n6等条件的，为合格的木霉高孢粉可湿性粉剂。\n[0024] 与现有技术相比，本发明具有以下突出的优点：\n[0025] 1.木霉高孢粉是通过液固两相一步法培养，固体培养物产孢后，再经过旋风集孢而获得的。这样孢子粉中夹带的培养物少，孢子纯度高，大大增强了可湿性粉剂的悬浮、分散性能。获得的高孢子粉含量达100～1000亿个/克，含水量低于3％，99％的可通过325目标准筛，活孢率90％以上。\n[0026] 2.在吸附剂、增效剂等的选择上，注重其与木霉孢子的生物相容性，选择的这些成分对孢子的萌发和菌丝及产孢没有影响或影响较小。增效剂在可湿性粉剂配方中可显著抑制孢子的萌发，但施用时稀释可解除其抑制作用，而对其它真菌仍然存在较强的抑制作用。\n[0027] 3.产品性能指标优良，木霉孢子含量5亿个/克以上、活孢率80％以上、湿润性小于2分钟、悬浮率70％以上、细度(过325目标准筛)99％以上、水分含量小于2％、pH值\n5～6、存储1年以上活孢率仍然在70％以上，符合可湿性粉剂农药制剂的商品标准要求。\n[0028] 保藏生物材料的说明\n[0029] 本发明的生防菌株分类命名为绿色木霉(Trichoderma viride)TV-1，保藏单位：\n中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2009年01月06日；保藏登记入册的编号CGMCC No.2848。\n具体实施方式\n[0030] 通过下面给出的具体实施例和应用实施例，可以进一步清楚地了解本发明。但它们不是对本发明保护范围的限定。\n[0031] 实施例1\n[0032] ——制剂化中的生物相容性试验\n[0033] 1.材料与方法\n[0034] 1.1材料\n[0035] 硅藻土、膨润土、滑石粉、轻质碳酸钙共四种吸附剂。增效剂为木霉半选择性培养基中所用的敌克松原药粉，主要是筛选其用量。\n[0036] 1.2方法\n[0037] 1.2.1吸附剂的筛选\n[0038] 对分生孢子萌发的影响：将各种供试吸附剂与木霉高孢粉按9∶1的比例混合均匀，于26～28℃培养箱中放置5d，采用木霉半选择性培养液TSM[MgSO4·7H2O 0.2g；K2HPO4 \n0.9g；KCl 0.25g；NH4NO3 1.0g；葡萄糖3.0g；氯霉素0.25g；虎红0.15g；敌克松可湿性粉剂(有效成分：敌磺钠)0.3g；五氯硝基苯素(PCNB)0.2g；H2O 1000ml。]26～28℃、150r/m振荡培养24h，血球记数板计测孢子萌发率，以木霉高孢粉为对照。\n[0039] 对菌丝生长及产孢的影响：以5％的比例将各种供试吸附剂加入PDA培养基灭菌后制成平板，用灭菌打孔器接入Φ0.5cm新鲜培养的木霉TV-1菌丝块，27.5℃光照培养9d，统计每皿产孢量及菌落日生长量(mm)，以未加吸附剂的PDA为对照。\n[0040] 吸附剂比较、筛选：对试验测得的3个指标，与对照进行差异性分析，筛选适宜的吸附剂。\n[0041] 1.2.2增效剂农药的配比\n[0042] 对分生孢子萌发的影响：将适宜的吸附剂以9∶1的比例与高孢粉混匀，制成混合物，再将混合物与增效剂农药分别按19∶1、9∶1、8∶2、7∶3的比例混合，计测孢子萌发率。\n[0043] 对菌丝生长及产孢的影响：将增效剂农药以实际施用的浓度(500×)分别按吸附剂和高孢粉形成的混合物与增效剂农药19∶1、9∶1、8∶2、7∶3的比例折算的浓度(即\n10,000×、5,000×、2,500×、1,250×)加入灭菌冷却至55～60℃的PDA培养基中摇匀倒平板，接菌丝块、测定、统计。\n[0044] 2.结果与分析\n[0045] 2.1吸附剂的筛选\n[0046] 吸附剂的筛选结果见表1，对分生孢子萌发的影响及对菌丝生长及产孢的影响试验测得的3个指标与对照进行比较、进行差异性分析，从表中可以看出，吸附剂硅藻土除产孢量有所减少外，孢子萌发率(即为活孢率)及菌落日生长量与对照无差异，是较为适宜的吸附剂；吸附剂膨润土与对照有一定的差异，综合比较，可作为高孢粉的吸附剂使用；吸附剂滑石粉不能产孢，严重影响菌丝的生长，吸附剂轻质碳酸钙对菌丝生长影响较大，这两种吸附剂都不宜作为高孢粉的吸附剂使用。\n[0047] 表1.不同吸附剂对木霉的活力影响\n[0048] \n[0049] 2.2增效剂农药的配比\n[0050] 增效剂农药对分生孢子萌发的影响及对菌丝生长及产孢的影响试验测得的3个指标与对照进行比较、进行差异性分析，可以看出(表2)，增效剂农药与吸附剂和高孢粉混合物以19∶1的比例混合不影响孢子萌发、菌丝生长及产孢量；9∶1的比例混合对菌丝生长及产孢量影响较小，不影响孢子萌发。因此，增效剂农药以19∶1的比例与吸附剂和高孢粉混合物混合较合适，即增效剂农药在整个配方中可占5％。\n[0051] 表2.增效剂农药对木霉的活力影响\n[0052] \n[0053] 实施例2\n[0054] 将800亿个/克、活孢率90％以上木霉高孢粉5Kg，敌克松原粉2Kg，木质素磺酸钠\n3Kg，活性炭1Kg，柠檬酸0.5Kg，羧甲基纤维素钠2Kg，加到86.5Kg硅藻土内，在混合机中充分混匀，垂直预粉碎，再经过气流粉碎，过325目标准筛，质量检验，满足木霉孢子含量5亿个/克以上、活孢率80％以上、湿润性小于2分钟、悬浮率70％以上、细度(过325目标准筛)99％以上、水分含量小于2％、pH值5～6等条件的，为合格的木霉高孢粉可湿性粉剂。\n[0055] 实施例3\n[0056] 将600亿个/克、活孢率90％以上木霉高孢粉6Kg，敌克松原粉1.5Kg，木质素磺酸钠2.5Kg，活性炭1Kg，柠檬酸0.5Kg，羧甲基纤维素钠1.5Kg，加到87Kg膨润土内，在混合机中充分混匀，垂直预粉碎，再经过气流粉碎，过325目标准筛，质量检验，满足木霉孢子含量\n5亿个/克以上、活孢率80％以上、湿润性小于2分钟、悬浮率70％以上、细度(过325目标准筛)99％以上、水分含量小于2％、pH值5～6等条件的，为合格的木霉高孢粉可湿性粉剂。\n[0057] 应用实施例1\n[0058] ——防治烟草赤星病的效果\n[0059] 1.材料与方法\n[0060] 1.1供试材料\n[0061] 供试菌株：强致病力赤星病菌株97Aa003为本实验室分离、筛选获得，所用培养基为燕麦培养基。\n[0062] 供试药剂：本发明可湿性粉剂，采用生防菌株TV-1(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏编号为CGMCC No.2848)；对照药剂菌核净(浙江生产)。\n[0063] 供试烟草品种为K326。\n[0064] 1.2方法\n[0065] 1.2.1离体防效测定\n[0066] 离体叶片的准备：采摘K326烟株中部黄绿色健康叶1～2片，洗洁精漂洗后，浸入\n1％NaClO溶液中表面消毒2～3min，无菌水漂洗清除叶面的NaClO，晾干表水，备用。\n[0067] 离体叶片的接种：将制备的赤星病菌孢子液(孢子浓度为106个/ml)分别与等体积稀释25倍、250倍、500倍的本发明可湿性粉剂混匀后，采用悬滴法将制备的混合孢子液滴在离体叶片上，同一叶片滴同浓度的的孢子混合液，共滴加10滴，记号笔点记接种位点，每浓度接3张叶片，以滴1％葡萄糖溶液作空白对照，置26℃保湿箱中培养5～7d。按病情严重度计测病指，并根据病指计算防效。\n[0068] 1.2.2对小区自然发病烟株的防效测定\n[0069] 对小区自然发病烟株的防效测定，在云南省烟草科学研究所研和基地试验田中进行，共设3个处理。每个处理设1个小区，重复4次，小区随机排列，每小区植烟200株，中间、四周设保护行间隔。具体处理如下，处理A：500倍本发明可湿性粉剂；处理B：500倍菌核净药剂对照；处理C：清水空白对照。3个处理均为喷施，施用时间为去脚叶后进入采烤期时。\n[0070] 病情调查在施用前后均应进行，即施用当天及施用15天后调查病情。调查时五点取样，定株定点调查，每次只需调查烟株底部往上数的6片叶。记载标准采用烟草病害调查的行业标准YC/T 39-1996进行。统计病指，以病指增长计算防效。\n[0071] 2.结果与分析\n[0072] 2.1离体防效测定\n[0073] 离体防效测定结果见表3。从表3可看出，随着本发明可湿性粉剂中生防菌株TV-1孢子浓度的增加，防效愈显著。当本发明可湿性粉剂中生防菌株TV-1孢子浓度低于赤星病菌孢子浓度时，防效大为降低。\n[0074] 表3.本发明可湿性粉剂的离体防效测定(施用当天病指为0)\n[0075] \n[0076] 2.2对小区自然发病烟株的防效测定\n[0077] 对小区自然发病烟株的防效测定结果(见表4)表明，本发明可湿性粉剂对烟草赤星病的防效达75％以上，与菌核净效果相当。\n[0078] 表4.药剂对小区自然发病烟株的防效测定\n[0079] \n[0080] 注：表中调查次序编号后的数据为4次重复的病指平均数。\n[0081] 应用实施例2\n[0082] ——防治烟草白粉病的效果\n[0083] 1.材料与方法\n[0084] 1.1供试材料\n[0085] 供试药剂：本发明可湿性粉剂，采用生防菌株TV-1(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏编号为CGMCC No.2848)；对照药剂粉锈灵。\n[0086] 供试烟草品种为香料烟云香巴斯玛1号。\n[0087] 1.2方法\n[0088] 对小区自然发病烟株的防效测定，在云南省保山香料烟种植区的昌宁柯街进行，共设3个处理。每个处理设1个小区，重复4次，小区随机排列，每小区植烟800株，中间、四周设保护行4行以上间隔。具体处理如下，处理a：500倍本发明可湿性粉剂；处理b：1000倍粉锈灵药剂对照；处理c：清水空白对照。3个处理均为喷施。施用时间为团棵封行，白粉病初发时。\n[0089] 病情调查在施用前后均应进行，即施用当天及施用7天后调查病情。调查时五点取样，定株定点调查，每次调查烟株所有叶片。记载标准采用烟草病害调查的行业标准YC/T 39-1996中叶斑病的方法进行。统计病指，以病指增长计算防效。\n[0090] 2.结果与分析\n[0091] 对小区自然发病烟株的防效测定结果(见表5)表明，本发明可湿性粉剂对烟草白粉病的防效达65％以上，与粉锈灵效果相当。