糖类抗原50磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法

1.糖类抗原50磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
1)糖类抗原50校准品，浓度为0、5、10、25、50、100KU/mL，校准品稀释液为50％牛血清；
2)偶联有链霉亲和素的磁微粒悬浮液；
3)生物素标记的糖类抗原50抗体；
4)糖类抗原50抗体酶结合物，所用的酶为辣根过氧化物酶，辣根过氧化物酶纯度RZ≥3.0，活性≥250U/mL；
5)糖类抗原50质控品；
6)化学发光液A液和B液；
7)20倍浓缩洗液；
8)反应管；
所述试剂盒制备包括以下步骤：
(1)糖类抗原50校准品的配制：
将CA50纯品用50％牛血清溶液稀释成系列梯度，浓度分别为0、5、10、25、50、100KU/mL；
(2)糖类抗原50质控品的配制：
将糖类抗原50用含有50％牛血清溶液稀释配制低值质控品高值质控品，低值质控品浓度为10KU/mL，高质质控品浓度为44.4KU/mL；
(3)磁性颗粒-链霉亲和素悬浮液的制备：
取100mL0.1mol/L 2-吗啉乙磺酸溶液，依次加入10mg磁性颗粒和3mg链酶亲和素，搅拌30min，然后加入10mg/mL碳二亚胺盐酸盐溶液3.5μL，反应1h后，使用磁力架吸附，静止10min，移去液体，加入10mL 0.01mol/L PBS，重复上述过程，共洗涤3次，最后用
0.01mol/L PBS定容至1L即可；
(4)生物素标记的CA50抗体的制备
取0.5mg CA50抗体，用硼酸盐缓冲液在2～8℃下透析2h；将透析后的抗体加入25μg生物素，同时加入二甲基亚砜，最终浓度为10％，避光反应3h，缓慢振荡；在上述溶液中加入250μL1mol/L氯化铵溶液，常温避光反应50min；用0.01mol/L PBS溶液在2～8℃下透析2天，期间换液5次；
(5)糖类抗原50抗体酶结合物的制备
采用高碘酸钠氧化法将CA50抗体与辣根过氧化物酶进行偶联后，用酶稀释液将其稀释至工作浓度1:6000，并加入15％酶稳定剂，储存于2～8℃；酶稳定剂使用SurModics In Vitro Technologies的蛋白稳定剂产品；
(6)20倍浓缩洗液的配制
20倍浓缩洗液包括58g/L磷酸氢二钠，5.92g/L磷酸二氢钠，180g/L NaCl，10mL/L Tween-20和1‰Proclin300；
(7)化学发光液A液和B液的配制
A液为0.7g/L鲁米诺，0.165g/L对碘酚，缓冲液为pH8.6的5mmol/L Tris·HCl，避光保存；B液为0.675g/L过氧化脲，用工艺用水配制；A液和B液在使用前5min混合；
(8)组装：将上述试剂组装成盒，储存于2～8℃；
(9)对采用该方法制得的试剂盒进行物理检查，对准确度、剂量-反应曲线的线性、精密度、特异性、灵敏度、质控品的测定值和稳定性进行测定。

糖类抗原50磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其制\n备方法\n技术领域\n[0001] 本发明涉及免疫分析医学领域，具体的，本发明提供了一种糖类抗原50（CA50）磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法。\n背景技术\n[0002] 癌症亦称恶性肿瘤，是严重威胁人类健康的一种疾病，据统计，我国每年新患癌症的病人约160万人，每年因癌症死亡的人数约130万人，按目前的医疗水平，早期癌症病人约有80%～90%可以治愈，大大降低了癌症病人的死亡率，可见癌症病人的早期发现、早期诊断和早期治疗尤为重要。\n[0003] 糖类抗原50（CA50）是一种非特异性的广谱肿瘤标志物，以唾液蛋白和唾液酸糖脂为主要成分的一种神经节苷脂抗原，1983年Lindholm等应用结肠癌细胞为免疫原首次制备出CA50单克隆抗体。CA50以脂或脂蛋白结合的形式存在于细胞膜，在正常组织中一般不存在，当细胞恶变时，糖基化酶被激活，造成细胞表面糖基结构改变而成为CA50标志物。\nCA50对多种上皮类恶性肿瘤有较高的阳性检出率，一般在消化道肿瘤的病人中可以观察到血清中CA50含量升高，与CEA、CA125、CA199等标志物联检，可为疾病的前期筛查、辅助诊断、鉴别诊断、疗效观察、癌细胞转移以及预后提供有参考价值的依据。\n[0004] 在临床上，正常人的血中CA50含量＜20μg/L，许多恶性肿瘤患者血中皆可升高，如66.6％的肺癌、88.2％的肝癌、68.9％的胃癌、88.5％的卵巢或子宫颈癌、94.4％胰或胆管癌，其他如直肠癌、膀脏癌等皆有70％以上是升高的，另外，溃疡性结肠炎、肝硬化、黑色素瘤、淋巴瘤，自身免疫性疾病等也有CA50升高现象。\n[0005] 目前常用的检测CA50的方法有放射免疫分析技术（RIA）和酶联免疫分析法（ELISA），但是这两种方法存在诸多不足，例如RIA存在放射性污染、标记物半衰期短、对操作者具有放射性损伤，且操作繁琐，时间长等缺点；而ELISA灵敏度低，检测范围窄；随着标记免疫技术的迅速发展，各种新的检测方法层出不穷，其中化学发光免疫分析（CLIA）是将化学发光和酶免疫分析结合在此技术上发展起来的，是当今最为敏感的微量免疫测定法。\n发明内容\n[0006] 本发明要解决的问题是提供CA50的化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法，避免了放射性免疫分析的试剂有效期短、存在放射性污染、操作繁琐等缺点，且解决了灵敏度低，检测范围窄，成本高的缺陷。\n[0007] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：糖类抗原50磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，包括：糖类抗原50校准品，浓度为0、5、10、25、50、100KU/mL，校准品稀释液为50%牛血清；偶联有链霉亲和素的磁微粒悬浮液；生物素标记的糖类抗原50抗体；\n糖类抗原50抗体酶结合物，所用的酶为辣根过氧化物酶，辣根过氧化物酶纯度RZ≥3.0，活性≥250U/mL；糖类抗原50质控品；化学发光液A液和B液；20倍浓缩洗液；反应管。\n[0008] 进一步，所述的发光液A液的主要成分为鲁米诺，B液的主要成分是过氧化脲。A液为0.7g/L鲁米诺，0.165g/L对碘酚，缓冲液为pH8.6的5mmol/L Tris·HCl，避光保存；\nB液为0.675g/L过氧化脲，用工艺用水配制。\n[0009] 进一步，所述的磁微粒是表面包裹带有氨基或羧基活性基团的四氧化三铁，粒径\n1～2um。\n[0010] 进一步，所述的糖类抗原50质控品包括低值质控品和高值质控品。\n[0011] 进一步，所述的反应管的材料是透明聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯或玻璃。\n[0012] 试剂盒的制备方法，包括以下步骤：\n[0013] （1）糖类抗原50校准品的配制：\n[0014] 将CA50纯品用50%牛血清溶液稀释成系列梯度，浓度分别为0、5、10、25、50、\n100KU/mL。\n[0015] （2）糖类抗原50质控品的配制：\n[0016] 将糖类抗原50用含有50%牛血清溶液稀释配制低值质控品高值质控品，低值质控品（QcL）和高质质控品（QcH）的允许范围分别为8～12KU/mL和29.6～44.4KU/mL。\n[0017] （3）磁性颗粒-链霉亲和素悬浮液的制备：\n[0018] 取100mL0.1mol/L 2-吗啉乙磺酸溶液（MES溶液），依次加入10mg磁性颗粒和\n3mg链酶亲和素（SA），搅拌30min，然后加入10mg/mL碳二亚胺盐酸盐溶液（1-乙基-(3-二甲基氨基丙基，EDC)3.5uL，反应1h后，使用磁力架吸附，静止10min，移去液体，加入10mL \n0.01mol/L PBS，重复上述过程，共洗涤3次，最后用0.01mol/L PBS定溶至1L即可。\n[0019] （4）生物素标记的CA50抗体的制备\n[0020] 取0.5mg CA50抗体，用硼酸盐缓冲液在2～8℃下透析1～3h；将透析后的抗体加入25ug生物素，同时加入二甲基亚砜，最终浓度为10%，避光反应3h，缓慢振荡；在上述溶液中加入250uL1mol/L氯化铵溶液，常温避光反应30～60min；用0.01mol/L PBS溶液在\n2～8℃下透析2天，期间换液3～5次；\n[0021] （5）糖类抗原50抗体酶结合物的制备\n[0022] 采用高碘酸钠氧化法将CA50抗体与辣根过氧化物酶进行偶联后，用酶稀释液将其稀释至工作浓度1:6000，并加入5～20%酶稳定剂，储存于2~8℃；酶稳定剂是一种可以保持蛋白质在冻干或溶液下保持天然折叠构想的试剂，有利于抗原或抗体的保存，避免外界因素如温度、pH、盐、金属离子及其他污染物影响其稳定性。\n[0023] （6）20倍浓缩洗液的配制\n[0024] 20浓缩洗液包括58g/L磷酸氢二钠，5.92g/L磷酸二氢钠，180g/L NaCl，10mL/LTween-20和1‰Proclin300；\n[0025] （7）化学发光液A液和B液的配制\n[0026] A液为0.7g/L鲁米诺，0.165g/L对碘酚，缓冲液为pH8.6的5mmol/L Tris·HCl，避光保存；B液为0.675g/L过氧化脲，用工艺用水配制；A液和B液在使用前5min混合；\n[0027] （8）组装：将上述试剂组装成盒，储存于2~8℃；\n[0028] （9）对采用该方法制的的试剂盒的进行物理检查，准确度、剂量-反应曲线的线性、精密度、特异性、灵敏度、质控品的测定值和稳定性进行测定。\n[0029] 本发明的原理是，本发明采用夹心法原理测定血清或血浆中的CA50，在亲和素-磁微粒悬浮液中加入生物素-CA50抗体结合物，通过亲和素和生物素的亲和反应，形成磁微粒-亲和素-生物素-CA50抗体复合物，加入样本和酶后，会通过抗原抗体反应，形成了磁微粒-亲和素-生物素-CA50抗体-CA50-CA50抗体-HRP复合物，用磁场将复合物吸附在试管底部，清洗掉游离的成分，加入底物工作液，在氧化剂作用下，HRP催化鲁米诺生成处于激发态的氨基邻苯二甲酸离子，其恢复到基态时，释放出425nm的光子，于第5分钟测定各加样孔的发光值（RLU）。样本的发光值与样本中CA50浓度呈正相关。样本中的CA50浓度依据由校准品CA50浓度和对应的RLU建立的Log（X）-Log（Y）数学模型进行定量，从而检测人血清、血浆中的CA50含量。\n[0030] 发明制备的试剂盒将化学发光免疫分析和磁微粒技术结合，大大提高了检测的灵敏度和准确性，另外，在检测过程中引入的生物素-亲和素系统（biotin-avidin system，BAS）具有多级的信号放大作用，且不增加非特异性干扰，具有灵敏度高、特异性好、稳定性高、适用性强和实验成本低等特点，本技术具有以下优点：（1）以磁微粒为固相载体，大大增加了抗体的有效包被量，节约了抗体的用量；（2）以磁微粒为固相载体包被抗体，增加了抗原-抗体的接触面积，及发光面积，提高了反应的灵敏度；（3）反应在液相中进行，且利用旋转磁场使磁微粒其搅拌作用，大大缩短了反应时间。\n附图说明\n[0031] 图1是本发明的博奥赛斯化学发光试剂盒测定糖类抗原50与放免试剂盒测定糖类抗原50的测定结果比较图，其中纵坐标为博奥赛斯测得的糖类抗原50值，横坐标为放免试剂盒测定糖类抗原50值，两种方法相关系数（r）=0.9928，直线方程y=0.9914x+0.1335。\n[0032] 图2是CA50标准曲线。\n具体实施方式\n[0033] 实施例1：制备糖类抗原50（CA50）磁微粒化学发光免疫定量测定试剂盒Ⅰ[0034] （1）糖类抗原50校准品的配制：\n[0035] 将CA50纯品用50%牛血清溶液稀释成系列梯度，浓度分别为0、5、10、25、50、\n100KU/mL。\n[0036] （2）糖类抗原50质控品的配制：\n[0037] 将糖类抗原50用含有50%牛血清溶液稀释配制低值质控品高值质控品，低值质控品（QcL）浓度为8KU/mL，高质质控品（QcH）的浓度为38.2KU/mL。\n[0038] （3）磁性颗粒-链霉亲和素悬浮液的制备：\n[0039] 取100mL0.1mol/L 2-吗啉乙磺酸溶液（MES溶液），依次加入10mg磁性颗粒和\n3mg链酶亲和素（SA），搅拌30min，然后加入10mg/mL碳二亚胺盐酸盐溶液（1-乙基-(3-二甲基氨基丙基，EDC)3.5uL，反应1h后，使用磁力架吸附，静止10min，移去液体，加入10mL \n0.01mol/L PBS，重复上述过程，共洗涤3次，最后用0.01mol/L PBS定溶至1L即可。\n[0040] （4）生物素标记的CA50抗体的制备\n[0041] 取0.5mg CA50抗体，用硼酸盐缓冲液在2～8℃下透析3h；将透析后的抗体加入\n25ug生物素，同时加入二甲基亚砜，最终浓度为10%，避光反应3h，缓慢振荡；在上述溶液中加入250uL1mol/L氯化铵溶液，常温避光反应30min；用0.01mol/L PBS溶液在2～8℃下透析2天，期间换液3次；\n[0042] （5）糖类抗原50抗体酶结合物的制备\n[0043] 采用高碘酸钠氧化法将CA50抗体与辣根过氧化物酶进行偶联后，用酶稀释液将其稀释至工作浓度1:6000，并加入20%酶稳定剂，储存于2~8℃；酶稳定剂使用SurModics In Vitro Technologies的蛋白稳定剂产品。\n[0044] （6）20倍浓缩洗液的配制\n[0045] 20浓缩洗液包括58g/L磷酸氢二钠，5.92g/L磷酸二氢钠，180g/L NaCl，10mL/LTween-20和1‰Proclin300；\n[0046] （7）化学发光液A液和B液的配制\n[0047] A液为0.7g/L鲁米诺，0.165g/L对碘酚，缓冲液为pH8.6的5mmol/L Tris·HCl，避光保存；B液为0.675g/L过氧化脲，用工艺用水配制；A液和B液在使用前5min混合；\n[0048] （8）组装：将上述试剂组装成盒，储存于2~8℃；\n[0049] （9）对采用该方法制的的试剂盒的进行物理检查，准确度、剂量-反应曲线的线性、精密度、特异性、灵敏度、质控品的测定值和稳定性进行测定。\n[0050] 说明：\n[0051] 1.物理检查：液体组分应澄清，无沉淀或絮状物；其他组分应无包装破损。\n[0052] 2.准确性：试剂盒校准品与企业标准品系列同时进行分析测定，用双对数数学模型拟合，要求两条剂量-反应曲线不明显偏离平行（t检验，|t|<2.447）；以CA50企业标准品为对照品，用双对数数学模型拟合，试剂盒校准品的实测值与标示值比值的平均值应在\n0.90~1.10范围内。\n[0053] 3.剂量-反应曲线的线性：用双读数数学模型拟合，剂量-反应曲线在0～100KU/mL浓度范围内相关系数r绝对值不低于0.9900。\n[0054] 4.分析灵敏度：试剂盒分析灵敏度不高于1.0KU/L。\n[0055] 5.精密度：批内和批间不精密度（CV%）应不高于10%。\n[0056] 6.质控品的测定值：平行测定10孔高值和低值的质控品，用Log(X)-Log(Y)数学模型拟合，质控品测值应在允许范围内，QcL和QcH的允许范围分别为8～12KU/mL和\n29.6～44.4KU/mL。\n[0057] 7.特异性：\n[0058] 交叉反应符合下表要求：\n[0059] \n[0060] 8.稳定性：37℃放置7天，测定值应符合上述各项要求。\n[0061] 实施例2：制备糖类抗原50（CA50）磁微粒化学发光免疫定量测定试剂盒Ⅱ[0062] （1）糖类抗原50校准品的配制：\n[0063] 将CA50纯品用50%牛血清溶液稀释成系列梯度，浓度分别为0、5、10、25、50、\n100KU/mL。\n[0064] （2）糖类抗原50质控品的配制：\n[0065] 将糖类抗原50用含有50%牛血清溶液稀释配制低值质控品、高值质控品，低值质控品（QcL）浓度为12KU/mL，高质质控品（QcH）浓度为29.6KU/mL。\n[0066] （3）磁性颗粒-链霉亲和素悬浮液的制备：\n[0067] 同实施例1磁性颗粒-链霉亲和素悬浮液的制备。\n[0068] （4）生物素标记的CA50抗体的制备\n[0069] 取0.5mg CA50抗体，用硼酸盐缓冲液在2～8℃下透析1h；将透析后的抗体加入\n25ug生物素，同时加入二甲基亚砜，最终浓度为10%，避光反应3h，缓慢振荡；在上述溶液中加入250uL1mol/L氯化铵溶液，常温避光反应360min；用0.01mol/L PBS溶液在2～8℃下透析2天，期间换液4次；\n[0070] （5）糖类抗原50抗体酶结合物的制备\n[0071] 采用高碘酸钠氧化法将CA50抗体与辣根过氧化物酶进行偶联后，用酶稀释液将其稀释至工作浓度1:6000，并加入5%酶稳定剂，储存于2~8℃；酶稳定剂使用SurModics In Vitro Technologies的蛋白稳定剂产品。\n[0072] （6）20倍浓缩洗液的配制\n[0073] 20浓缩洗液包括58g/L磷酸氢二钠，5.92g/L磷酸二氢钠，180g/L NaCl，10mL/LTween-20和1‰Proclin300；\n[0074] （7）化学发光液A液和B液的配制\n[0075] A液为0.7g/L鲁米诺，0.165g/L对碘酚，缓冲液为pH8.6的5mmol/L Tris·HCl，避光保存；B液为0.675g/L过氧化脲，用工艺用水配制；A液和B液在使用前5min混合；\n[0076] （8）组装：将上述试剂组装成盒，储存于2~8℃；\n[0077] （9）对采用该方法制的的试剂盒的进行物理检查，准确度、剂量-反应曲线的线性、精密度、特异性、灵敏度、质控品的测定值和稳定性进行测定。\n[0078] 实施例3：制备糖类抗原50（CA50）磁微粒化学发光免疫定量测定试剂盒Ⅲ[0079] （1）糖类抗原50校准品的配制：\n[0080] 将CA50纯品用50%牛血清溶液稀释成系列梯度，浓度分别为0、5、10、25、50、\n100KU/mL。\n[0081] （2）糖类抗原50质控品的配制：\n[0082] 将糖类抗原50用含有50%牛血清溶液稀释配制低值质控品高值质控品，低值质控品（QcL）浓度为10KU/mL，高质质控品（QcH）浓度为44.4KU/mL。\n[0083] （3）磁性颗粒-链霉亲和素悬浮液的制备：\n[0084] 同实施例1磁性颗粒-链霉亲和素悬浮液的制备\n[0085] （4）生物素标记的CA50抗体的制备\n[0086] 取0.5mg CA50抗体，用硼酸盐缓冲液在2～8℃下透析2h；将透析后的抗体加入\n25ug生物素，同时加入二甲基亚砜，最终浓度为10%，避光反应3h，缓慢振荡；在上述溶液中加入250uL1mol/L氯化铵溶液，常温避光反应50min；用0.01mol/L PBS溶液在2～8℃下透析2天，期间换液5次；\n[0087] （5）糖类抗原50抗体酶结合物的制备\n[0088] 采用高碘酸钠氧化法将CA50抗体与辣根过氧化物酶进行偶联后，用酶稀释液将其稀释至工作浓度1:6000，并加入15%酶稳定剂，储存于2~8℃；酶稳定剂使用SurModics In Vitro Technologies的蛋白稳定剂产品。\n[0089] （6）20倍浓缩洗液的配制\n[0090] 20浓缩洗液包括58g/L磷酸氢二钠，5.92g/L磷酸二氢钠，180g/L NaCl，10mL/LTween-20和1‰Proclin300；\n[0091] （7）化学发光液A液和B液的配制\n[0092] A液为0.7g/L鲁米诺，0.165g/L对碘酚，缓冲液为pH8.6的5mmol/L Tris·HCl，避光保存；B液为0.675g/L过氧化脲，用工艺用水配制；A液和B液在使用前5min混合；\n[0093] （8）组装：将上述试剂组装成盒，储存于2~8℃；\n[0094] （9）对采用该方法制的的试剂盒的进行物理检查，准确度、剂量-反应曲线的线性、精密度、特异性、灵敏度、质控品的测定值和稳定性进行测定。\n[0095] 实施例4：本发明试剂盒的使用方法\n[0096] 1将待检试剂盒在室温（18~25℃）下平衡30分钟。\n[0097] 2配制洗液：用蒸馏水将浓缩洗液按1:20稀释（1mL洗液加19mL蒸馏水）。若浓缩洗液有结晶，可将浓缩洗液置于室温或37℃待结晶溶解后再进行稀释。\n[0098] 3配制发光液：使用前5分钟取适量发光液A与发光液B等体积混合。\n[0099] 4将反应管编号，向试管中依次加入10-50uL校准品或血清标本、100uL磁性颗粒-链霉亲和素悬浮液、100uL生物素-CA50抗体结合物、100uLCA50酶结合物，37℃下振荡反应10-30min，将试管架置于磁分离器上分离5min，然后倒出上清液，加入500uL洗液，充分混匀后，于磁分离器上分离，倒出洗液，重复3次，在各管中加入化学发光底物液\n200-400uL，充分混匀，暗置5min，在管式化学发光仪上测定各管的发光值（RLU），以校准品浓度的Log值为横坐标，以发光值的Log为纵坐标，绘制标准曲线，根据血清标本的发光值即可计算出CA50的浓度，得如图2的线性回归方程为Y=1.1667X+4.623，相关性系数为\n0.9981。\n[0100] 实施例5：本试剂盒的方法学评价结果\n[0101] \n[0102] \n[0103] 实施例6本试剂盒的临床对比实验\n[0104] 本专利发明的试剂盒已进行了临床考核，本次临床试验的样本总数108例，先以CA50放射性免疫试剂盒测试后，再用本专利发明的试剂盒（化学发光）进行测定，结果表明，直线方程为y=0.9914x+0.1335，相关系数为R=0.9857。可见本方法制备的试剂盒与医院测值有较好的一致性。以SPSS13.0统计分析软件对相关系数进行t检验（检验水准α=0.05），P<0.001，两种方法测定的CA50值的相关密切程度是显著性的，可见两种方法测定的CA50值密切相关。灵敏度（真阳性率）为96.12%、特异性（真阴性率）为96.10%，都较高；而假阳性率（误诊率）为1.90%、假阴性率（漏诊率）为3.88%，都较低，可见本试剂盒的测量值与实际值（原测值）的符合程度良好。粗一致性反映试剂盒诊断病人与非病人的能力，本试剂盒的粗一致性为97.36%，接近于1，说明试剂盒的诊断能力较强。\n[0105] 为了确定本试剂盒的临床参考值，对574份正常人血清、血浆样本采用本试剂盒进行了检测，结果表明本试剂盒的参考值（参考范围）为0~30KU/L。