一种检测异菌脲的试纸条及其制备方法和应用\n技术领域\n[0001] 本发明涉及异菌脲的检测，具体是一种检测异菌脲的试纸条及制备方法和其在烟叶检测中的应用。\n背景技术\n[0002] 异菌脲，又名扑海因，分子式为C13H13Cl2N3O3，属于二甲酰亚胺类，是一种广谱性触杀型保护性杀菌剂，广泛应用于烟草、果树、蔬菜的病害防治和水果的贮藏保鲜。异菌脲可以通过根部吸收起内吸作用，可有效防治对苯并咪唑类内吸杀菌剂有抗性的真菌。其主要防治对象为由葡萄孢菌、交链孢菌、核盘菌等引起的病害，如灰霉病、早疫病、黑斑病、菌核病等。异菌脲农药是日本、美国、韩国、澳大利亚、加拿大和食品法典委员会国有限量要求的检测项目，其在各类食品中最高残留限量为0.05 15 mg/kg。目前，异菌脲的检测方法大多~\n为液相色谱法和气相色谱法，所能检测的基质种类较少，对烟草中异菌脲的检测方法的相关专利和文献报道也较少。分析仪器方法检测成本高，需要专业技术人员操作，检测时间长，对于现场检测工作的开展具有局限性。\n发明内容\n[0003] 本发明的目的正是基于上述现有技术状况是提供一种检测异菌脲的试纸条及其制备方法和应用，本发明应用胶体金免疫层析法测定烟草中异菌脲的残留量，具准确度高、有操作简单、无需专业人员操作、无需配套其他检测设备、方便携带检测时间短、检测成本低等特点，适用于现场大量样品的筛查。\n[0004] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：\n[0005] 一种检测异菌脲的试纸条，包括样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫和底板，所述反应膜上有检测区和质控区，检测区包被有异菌脲半抗原-载体蛋白偶联物，质控区包被有抗抗体，所述结合物释放垫喷涂有异菌脲特异性抗体-胶体金标记物。异菌脲特异性抗体-胶体金标记物中的异菌脲特异性抗体是以异菌脲半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得，所述异菌脲半抗原-载体蛋白偶联物是以异菌脲半抗原与载体蛋白偶联制备得到。\n[0006] 所述试纸条由样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫依次黏贴在底板上组成，且结合物释放垫1/3 1/2被覆盖于样品吸收垫下。\n~\n[0007] 所述的检测区靠近样品吸收垫一端，质控区靠近吸水垫一端。\n[0008] 所述异菌脲半抗原-载体蛋白偶联物由异菌脲半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白可为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白。\n[0009] 所述抗抗体为羊抗鼠抗抗体。\n[0010] 所述异菌脲特异性抗体可为异菌脲单克隆抗体或异菌脲多克隆抗体。\n[0011] 所述异菌脲半抗原是由2，6-二氯-4-硝基苯酚为起始原料，经过与4-溴丁酸叔丁酯的烃基化反应得到羟基2，6-二氯-4-硝基苯，还原硝基后，得到烃基2，6-二氯苯胺，烃基\n2，6-二氯苯胺在碳酰氯的作用下，与氨基乙酸缩合，得到烃基2，6-二氯苯甘氨酸酯，再经过成环反应，得到异菌脲主体结构化合物，该化合物再经碳酰氯作用，与异丙胺缩合，得到异菌脲母核结构化合物，在酸性条件下水解反应得到的，分子结构如式Ⅰ：\n[0012]\n[0013] （式Ⅰ）。\n[0014] 所述底板可为PVC底板或其他硬质不吸水的材料；所述样品吸收垫可为无纺布或滤油纸；所述结合物释放垫可为玻璃纤维或聚酯材料；所述吸水垫为吸水纸；所述反应膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜。\n[0015] 一种制备上述试纸条的方法，其步骤包括：\n[0016] （1）制备喷涂有异菌脲单克隆抗体-胶体金标记物的结合物释放垫；\n[0017] （2）制备具有包被有异菌脲半抗原-载体蛋白偶联物的检测区和包被有羊抗鼠抗抗体的质控区的反应膜；\n[0018] （3）将（2）制备好的反应膜与结合物释放垫、样品吸收垫、吸水垫、底板组装成试纸条；\n[0019] 具体地说，步骤包括：\n[0020] （1）将异菌脲与溴代戊醛发生亲核取代反应，得到异菌脲半抗原；\n[0021] （2）将异菌脲半抗原与载体蛋白偶联，得到异菌脲半抗原-载体蛋白偶联物；\n[0022] （3）用异菌脲半抗原-载体蛋白偶联免疫物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞通过融合、筛选得到异菌脲单克隆杂交瘤细胞株；\n[0023] （4）提取小鼠IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗体；\n[0024] （5）用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；\n[0025] （6）将步骤（3）制备的异菌脲单克隆抗体加入步骤（5）制备的胶体金中，得到异菌脲单克隆抗体-胶体金标记物；\n[0026] （7）将异菌脲单克隆抗体-胶体金标记物喷涂在结合物释放垫上，37℃烘1h后取出，置于干燥环境中保存备用；\n[0027] （8）将异菌脲半抗原-载体蛋白偶联物包被再反应膜上构成检测区，将羊抗鼠抗抗体包被在反应膜上构成质控区；\n[0028] （9）将样品吸收垫用含0.5%牛血清白蛋白（体积分数）、pH为7.2、0.1 mol/L磷酸盐缓冲液浸泡2 h，37℃下烘干2 h；\n[0029] （10）在底板上按顺序粘贴上样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫，样品吸收垫盖住结合物释放垫，最后切成3 mm宽的小条，加塑料盒，真空包装，4 30℃条件下可保~\n存12个月。\n[0030] 应用上述试纸条检测烟叶中异菌脲残留的方法，包括步骤：\n[0031] （1）用试纸条进行检测；\n[0032] （2）分析检测结果。\n[0033] 本发明的异菌脲残留检测试纸条采用高度特异性的抗体抗原反应及竞争抑制免疫层析分析技术，将异菌脲单克隆抗体-胶体金标记物固定于结合物释放垫上，样品中的异菌脲在流动过程中，与结合物释放垫上的异菌脲单克隆抗体-胶体金标记物结合，形成药物-抗体-胶体金标记物。样品中的药物与反应膜检测区上的异菌脲半抗原-载体蛋白偶联竞争结合异菌脲单克隆抗体-胶体金标记物，根据检测区红色条带有无或颜色深浅来判断待测样品液中是否含有异菌脲残留。\n[0034] 检测时，样品经处理后滴入样品吸收垫，当异菌脲在样品中的浓度低于试纸条检测限或为零时，单克隆抗体-胶体金标记物在层析过程中会与固定在反应膜上的异菌脲半抗原-载体蛋白偶联物结合，在检测区（T线）和质控区（C线）内各出现一条红色条带，且T线显色比C线显色深或显色深浅一致；如果异菌脲在样品中的浓度等于或高于试纸条检测限，单克隆抗体-胶体金标记物会与异菌脲结合，从而在T线处因为竞争反应不会或者部分与异菌脲半抗原-载体蛋白偶联物结合而不出现红色条带或T线的显色的颜色比C线浅。如图2所示。\n[0035] 阴性：当质控区（C线）显示出红色条带，检测区（T线）同时也显示出红色条带，且T线显色比C线显色深或显色一致，均判为阴性，表明样品中异菌脲的浓度低于试纸条检测限。\n[0036] 阳性：当质控区（C线）显示出红色条带，而检测区（T线）显色比C线浅或T线不显色，判为阳性，表明样品中异菌脲的浓度等于或高于试纸条检测限。\n[0037] 无效：当质控区（C线）不显示出红色条带，则无论检测区（T线）显示出红色条带与否，该试纸条均判为无效。\n[0038] 本发明的试纸条有益效果：本发明的试纸条通过对2,6-二氯-4-硝基苯酚进行结构改造，合成了带有四个碳链长度的羧基半抗原，突出了异菌脲本身的分子结构，增强了免疫原性，使得制备得到的异菌脲单克隆抗体灵敏度高，特异性强，本发明试纸条成本低，操作简单，样品前处理简单，检测时间短，只需10 min，方便携带，适用于现场大量样品的筛查，储存简单、保质期长，在食品安全监管工作中可广泛推广使用。\n附图说明\n[0039] 图1为本发明的试纸条剖面结构的示意图。\n[0040] 图1中：1为样品吸收垫，2为结合物释放垫，3为反应膜，4为吸水垫，5为底板，6为检测区，7为质控区。\n[0041] 图2为本发明的试纸条检测结果判定的示意图。\n[0042] 图3为本发明的异菌脲半抗原合成路线的示意图。\n具体实施方式\n[0043] 下面通过实施例，并结合附图1-3，对本发明的技术方案作进一步具体说明。下述参照附图对本发明实施方式的说明旨在对本发明的总体构思进行解释，而不应当理解为对本发明的一种限制。\n[0044] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。\n[0045] 实施例1、检测异菌脲的试纸条的构成\n[0046] 如图1所示，根据本发明优选的实施方式的检测异菌脲的试纸条是由样品吸收垫\n1、结合物释放垫2、反应膜3、吸水垫4依次黏贴在底板5上组成。样品吸收垫的末端与反应膜相连，反应膜的末端与吸水垫相连，样品吸收垫的始端与底板的始端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐；所述反应膜上有检测区6和质控区7，检测区和质控区均为与所述试纸条的长相垂直的条带状检测区位于近于样品吸收垫的一侧，质控区位于近于吸水垫的一侧；\n所述检测区包被有异菌脲半抗原-载体蛋白偶联物（异菌脲半抗原-牛血清白蛋白的偶联物），质控区包被有羊抗鼠抗抗体；所述底板为PVC底板，样品吸收垫为无纺布，反应膜为硝酸纤维素膜，结合物释放垫为喷涂有异菌脲单克隆抗体-胶体金标记物的玻璃纤维；所述异菌脲残留检测试纸条在4℃ 30℃环境中储存，有效期为12个月。\n~\n[0047] 实施例2、实施例1中所述试纸条的制备方法\n[0048] 1. 异菌脲半抗原的制备\n[0049] 化合物A的合成：取5.0 g 2,6-二氯-4-硝基苯酚与3.2 g 4-溴丁酸叔丁酯在丙酮中搅拌，再向其中加入2.6 g无水碳酸钾作为催化剂在60℃反应8 h，反应停止后，蒸干溶剂，再加水与乙酸乙酯萃取，并用无水硫酸钠干燥，浓缩，过200-300目硅胶柱，层析分离纯化，得到化合物A 5.23 g，收率87%。1H NMR（CDCl3,300MHZ）δ: 7.945 ( 1H, d, J=0.000), \n4.144 ( 2H, t, J=7.500), 7.945 ( 1H, d, J=0.000), 1.973 ( 2H, tt, J=7.500, J=\n7.367), 2.359 (2H, t, J=7.367), 1.414 ( 3H), 1.414 ( 3H), 1.414 ( 3H,s) 。\n[0050] 化合物B的合成：向20 mL水中加入3.1 g锌粉和1 mL冰乙酸，在90℃反应30 min，再加入5.2 g化合物A的乙醇溶液80 mL，在60℃反应4 h，待反应停止，抽滤，蒸干，向其中加水与二氯甲烷萃取，静置，用无水硫酸钠干燥，用体积比为石油醚：乙酸乙酯=20:1重结晶，得到化合物B 4.8 g，收率91%。1H NMR（CDCl3,300MHZ）δ:6.898 (1H, d, J=0.000), 4.039 (2H, t, J=7.500), 6.898 (1H, d, J=0.000), 1.965 ( 2H, tt, J=7.500, J=7.367), \n2.361 ( 2H, t, J=7.367), 1.414 ( 3H), 1.414 ( 3H,s), 1.414 ( 3H,s)。\n[0051] 化合物C的合成：取4.7 g化合物B用100 mL乙腈溶解，搅拌，向其中加入2.16 g氨基乙酸，在氮气保护下，通入碳酰氯，在50℃下反应7 h，停止反应后，再加入50 mL氢氧化钠水溶液,震荡，旋蒸，除去乙腈，加乙酸乙酯溶解，加水洗涤，浓缩，蒸干，过200—300目硅胶柱，层析分离，得到化合物C3.57 g，收率73%。1H NMR（CDCl3,300MHZ）δ:7.536 ( 1H, d, J=\n0.000), 4.037 ( 2H, t, J=7.500), 7.535 ( 1H, d, J=0.000), 1.968 ( 2H, tt, J=\n7.500, J=7.367), 2.362 ( 2H, t, J=7.367), 3.751 ( 2H,s), 1.414 (3H,s), 1.414 ( 3H,s), 1.414 ( 3H,s)。\n[0052] 化合物D的合成：取3.4 g化合物C，用1,2-二氯乙烷溶解，加入0.5 mL DMF、3 mL草酰氯，室温搅拌3 h，旋蒸蒸干，除去有机溶剂，加入80 mL吡啶，在80℃反应7 h。停止反应，冷却到室温，旋蒸，除去吡啶，加入体积比为乙醇：石油醚=10:3的溶剂加热溶解，于4℃放置过夜，抽滤，得到化合物D 2.97 g，收率82%. 1H NMR（CDCl3,300MHZ）δ:7.439 ( 1H, d, J=\n0.000), 4.044 (2H, t, J=7.500), 7.439 (1H, d, J=0.000), 1.969 (2H, tt, J=\n7.500, J=7.367), 2.362 (2H, t, J=7.367), 4.191 (1H, d, J=17.742), 4.196 (1H, d, J=17.742), 1.414 (3H,s), 1.414 ( 3H,s), 1.414 ( 3H,s)。\n[0053] 化合物E的合成：取2.8 g化合物D加入200 mL二氯乙烷中溶解，再加入2.7 mL异丙胺，通入氮气，排出空气，通入碳酰氯，室温搅拌反应6 h，停止反应，加入50 mL氢氧化钾水溶液震荡，静置，分离出有机相，水洗，用无水硫酸钠干燥蒸干，过200—300目硅胶柱，用体积比为石油醚：乙酸乙酯=1:1的溶剂洗脱分离，得到化合物E 1.53 g，收率64%。1H NMR（CDCl3,300MHZ）δ:7.441 ( 1H, d, J=0.000), 4.044 ( 2H, t, J=7.500), 7.441 ( 1H, d, J=0.000), 1.970 ( 2H, tt, J=7.500, J=7.367), 2.362 ( 2H, t, J=7.367), \n4.527 ( 1H, d, J=0.000), 4.528 ( 1H, d, J=0.000), 4.214 (1H, hept, J=6.794), \n1.414 ( 3H，s), 1.414 ( 3H,s), 1.414 ( 3H,s), 1.169 3H, d, J=6.794), 1.169 ( \n3H, d, J=6.794)。\n[0054] 化合物F的合成：取1.53 g化合物，加入100 mL70%甲酸水溶液溶解，于70℃搅拌反应6 h，停止反应，旋蒸，除去溶剂，加氢氧化钠水溶液，加乙酸乙酯萃取，分去有机相，水相调节PH值到4，加1,2-二氯乙烷萃取，水洗，干燥，蒸干，用体积比为乙醇：正己烷=6:4的溶剂重结晶，得到异菌脲半抗原0.81 g，收率77%。1H NMR（CDCl3,300MHZ）δ: 11.0 (1H, s)7.4(1H, d, J=0.000), 4.0 (2H, t, J=7.500), 7.4(1H, d, J=0.000), 1.9 (2H, tt, J=\n7.500, J=7.367), 2.4 (2H, t, J=7.367), 4.5(1H, d, J=0.000), 4.5(1H, d, J=\n0.000), 4.2(1H, hept, J=6.794), 1.1 (3H, d, J=6.794), 1.1(3H, d, J=6.794)。\n[0055] 取上述产物经核磁共振氢谱测定，化学位移δ=11.0的为羧基氢，δ=4.0、1.9、2.4的为间隔臂上亚甲基的氢的共振吸收峰，这些峰在存在配合其他异菌脲氢固有吸收峰的存在证明半抗原合成成功。\n[0056] 2. 免疫原的制备\n[0057] 异菌脲半抗原与牛血清白蛋白偶联得到免疫原\n[0058] 取9.0 mg异菌脲半抗原，溶解于1.0 mL的二甲基甲酰胺（DMF）中，得到溶液Ⅰ；取30 mg碳化二亚胺（EDC）和30 mg N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）用0.2 mL水溶解后加入溶液Ⅰ，室温下搅拌24 h，得到反应液Ⅱ；取50 mL牛血清白蛋白（BSA），充分溶解在3.8 mL的磷酸盐缓冲液PBS（pH为7.2）中，将反应液Ⅱ逐滴缓慢滴加到牛血清白蛋白溶液中，并于室温下搅拌24 h，得到反应液Ⅲ；用0.01 mol/L的PBS在4℃透析3天，以除去未反应的小分子物质，得到免疫原；于-20℃保存备用。\n[0059] 异菌脲半抗原与血蓝蛋白偶联得到免疫原\n[0060] 称取血蓝蛋白50 mg，使之充分溶解在3.8 mL 0.1M的磷酸盐缓冲液PBS（PH 7.2）中，得到溶液A；取30 mg碳化二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）用0.2 mL水充分溶解后于加入溶液A中，室温下搅拌30 min。取3mg半抗原，溶解于1 mL N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，然后缓慢加入到蛋白溶解中，室温搅拌反应24 h。用0.01 mol/L PBS 4℃透析3 d每天换3次透析液。分装，于-20℃保存备用。\n[0061] 异菌脲半抗原与甲状腺蛋白偶联得到免疫原\n[0062] 称取甲状腺蛋白50 mg，使之充分溶解在3.8 mL 0.1M的磷酸盐缓冲液PBS（PH \n7.2）中，得到溶液A；取30 mg碳化二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）用0.2 mL水充分溶解后于加入溶液A中，室温下搅拌30 min。取4mg半抗原，溶解于1 mL N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，然后缓慢加入到蛋白溶解中，室温搅拌反应24 h。用0.01 mol/L PBS 4℃透析3 d每天换3次透析液。分装，于-20℃保存备用。\n[0063] 3.包被原的制备\n[0064] 异菌脲半抗原与卵清白蛋白偶联得到包被原\n[0065] 取7.0 mg异菌脲半抗原，溶解于1.0 mL的二甲基甲酰胺（DMF）中，得到反应液Ⅰ；取\n30 mg碳化二亚胺（EDC）和30 mg 的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）用0.2 mL水充分溶解后加入至反应液Ⅰ中，室温下搅拌24 h，得到反应液Ⅱ；取50 mL卵清白蛋白（OVA），充分溶解在3.8 mL的磷酸盐缓冲液PBS（pH为7.2）中，将反应液Ⅱ逐滴缓慢滴加到卵清白蛋白溶液中，并于室温下搅拌24 h，得到反应液Ⅲ；用0.01 mol/L的PBS在将反应液Ⅲ4℃透析3天，以除去未反应的小分子物质，得到包被原；于-20℃保存备用。\n[0066] 异菌脲半抗原与人血清白蛋白偶联得到包被原\n[0067] 称取人血清白蛋白50 mg，使之充分溶解在3.8 mL 0.1M PBS（PH 7.2）中，得到溶液B；取30mg EDC和NHS用0.2 mL水充分溶解后于加入溶液B中，室温下搅拌30 min。取9mg半抗原，溶解于1mL DMF中,然后缓慢加入到蛋白溶解中，室温搅拌反应24 h。用0.01 mol/L PBS 4℃透析3 d每天换3次透析液。分装，于-20℃保存备用。\n[0068] 异菌脲半抗原与兔血清白蛋白偶联得到包被原\n[0069] 称取兔血清白蛋白50 mg，使之充分溶解在3.8 mL 0.1M PBS（PH 7.2）中，得到溶液B；取30mg EDC和NHS用0.2 mL水充分溶解后于加入溶液B中，室温下搅拌30 min。取9mg半抗原，溶解于1mL DMF中,然后缓慢加入到蛋白溶解中，室温搅拌反应24 h。用0.01 mol/L PBS 4℃透析3 d每天换3次透析液。分装，于-20℃保存备用。\n[0070] 4. 异菌脲半抗原-载体蛋白偶联物的鉴定\n[0071] 将异菌脲半抗原、载体蛋白、异菌脲半抗原-载体蛋白偶联物用pH7.6的PBS配成\n0.5 mg/mL的溶液，以0.01 mol/L pH7.4 PBS调零，用紫外分光光度计在波长200 800 nm范~\n围内扫描，得到异菌脲半抗原、载体蛋白、异菌脲半抗原-载体蛋白偶联物的吸收曲线。三者出现不同的吸收曲线，表明异菌脲半抗原与载体蛋白偶联成功。\n[0072] 5. 异菌脲单克隆抗体的制备\n[0073] （1）动物免疫\n[0074] 将步骤2得到的免疫原注入Balb/c小鼠体内，免疫剂量为150 μg/只，使其产生抗血清。\n[0075] （2）细胞融合和克隆化\n[0076] 取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按8:1（数量配比）比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA法测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。\n[0077] （3）细胞冻存和复苏\n[0078] 将杂交瘤细胞用冻存液制成1×106个/mL的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。\n[0079] （4）单克隆抗体的制备与纯化\n[0080] 增量培养法：将杂交瘤细胞置于细胞培养基中，在37℃条件下进行培养，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体，-20℃保存。\n[0081] 所述细胞培养基为向RPMI1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠，使小牛血清在细胞培养基中的终浓度为20%（质量分数），碳酸氢钠在细胞培养基中的终浓度为0.2%（质量分数）；所述细胞培养基的pH为7.4。\n[0082] 6、羊抗鼠抗抗体的制备\n[0083] 以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体。\n[0084] 7. 异菌脲单克隆抗体-胶体金标记物的制备\n[0085] （1）胶体金的制备\n[0086] 用双蒸去离子水将1%氯金酸（购于sigma公司，产品目录号T09041）稀释成0.01%（质量百分含量），取100 mL置于锥形瓶中，用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，在持续高温、持续搅拌下加入2.5 mL 1%柠檬酸三钠（购于广州化学试剂厂，产品目录号BG11-AG-01KG），继续匀速搅拌加热至溶液呈透亮的红色时停止，冷却至室温后用去离子水恢复到原体积，4℃保存。制备好的胶体金外观纯净、透亮、无沉淀和漂浮物。\n[0087] （2）异菌脲单克隆抗体-胶体金标记物的制备\n[0088] 在磁力搅拌下，用0.2 mol/L碳酸钾溶液调胶体金的pH值至7.0，按每毫升胶体金溶液中加入30 60 μg的标准向胶体金溶液中加入异菌脲单克隆抗体，继续搅拌混匀30 ~\nmin，加入10%BSA，使其在胶体金溶液中的终浓度为1%（体积分数），静置10 min。12000 r/min、4℃离心30 min，弃上清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤两次，用体积为初始胶体金体积1/\n20的复溶缓冲液将沉淀重悬，置4℃备用。\n[0089] 复溶缓冲液：含酪蛋白0.02% 0.1%（质量分数）、吐温-80 0.02% 0.2%（质量分数）、~ ~\npH7.2的0.02 mol/L磷酸盐缓冲液。\n[0090] 8. 结合物释放垫的制备\n[0091] 将结合物释放垫浸泡于含有牛血清白蛋白（牛血清白蛋白在缓冲液中的浓度为\n1.0%）、pH为7.2、0.2 mol/L的磷酸盐缓冲液中，均匀浸湿1 h，37℃烘3 h备用。用Isoflow喷膜仪将制备好的异菌脲单克隆抗体-胶体金标记物均匀喷涂在结合物释放垫上，每1cm结合物释放垫喷涂0.01 0.04 mL异菌脲单克隆抗体-胶体金标记物后，置于37℃环境中（湿度＜~\n20%）60 min后取出，置于干燥环境（湿度＜20%）中保存备用。\n[0092] 9. 反应膜的制备\n[0093] 将异菌脲半抗原-卵清蛋白偶联物包被到反应膜上构成检测区，将羊抗鼠抗抗体包被在反应膜上构成质控区。\n[0094] 包被过程：用磷酸缓冲液将异菌脲半抗原-卵清蛋白偶联物稀释到10 mg/mL，用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测区（T线），包被量为0.5 0.7 μL/cm；用~\n0.01 mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液将羊抗鼠抗抗体稀释到200 μg/mL，用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控区（C线），包被量为0.6 1.0 μL/cm。将包被好的反应膜置~\n于37℃条件下干燥2 h，备用。\n[0095] 10. 样品吸收垫\n[0096] 将样品吸收垫置于含0.5%牛血清白蛋白（体积分数）、pH7.2、0.2 mol/L磷酸盐缓冲液中浸泡2 h，37℃烘2 h备用。\n[0097] 11. 试纸条的组装\n[0098] 将样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫依次按顺序粘贴在PVC底板上；结合物释放垫从起始端有1/3区域被样品吸收垫覆盖，结合物释放垫的末端与反应膜的始端连接，反应膜的末端与吸水垫的始端相连，样品吸收垫的始端与PVC底板的始端对齐，吸水垫的末端与PVC底板的末端对齐；所述反应膜上有检测区和质控区，检测区（T线）和质控区（C线）均为与所述试纸条的长相垂直的条状带；检测区位于靠近结合物释放垫的末端的一侧；\n质控区位于远离结合物释放垫的末端的一侧；将试纸条用机器切成3 mm宽的小条，装在特制的塑料制卡中，4 30℃条件下可保存12个月。\n~\n[0099] 实施例3、样品中异菌脲残留的检测\n[0100] 1. 样品的前处理\n[0101] 检测前烟叶样品需回温到室温20-25℃；称取1.0±0.05 g粉碎的样本至聚苯乙烯离心管中；加入10 mL样本提取液(50%甲醇)，用匀浆机将其充分打碎；静置后移取0.1 mL上清液和0.4 mL样本稀释液混合得待检样本液。\n[0102] 2. 用试纸条进行检测\n[0103] 用移液器取待检样品溶液100 μL（滴管2-3滴）垂直滴加于加样孔中，液体流动时开始计时，反应10 min，判定结果，超过10min，结果可作为参考。\n[0104] 3. 分析检测结果\n[0105] 阴性（－）：T线显色比C线显色深或显色一致，均表示样品中异菌脲浓度低于检测限，如图2（a）和2（b）。\n[0106] 阳性（+）：T线显色比C线显色浅或T线不显色，表示样品中异菌脲浓度等于或高于检测限，如图2（c）和2（d）。\n[0107] 无效 ：未出现C线，表明不正确的操作过程或试纸条已变质失效，如图2（e）和2（f）。在此情况下，应再次仔细阅读说明书，并用新的试纸条重新测试。\n[0108] 实施例4、样品检测实例\n[0109] 1. 检测限试验\n[0110] 取空白烟叶样品，在其中分别添加异菌脲终浓度为2 μg/g、4 μg/g和8 μg/g，用实施例1中所述的试纸条进行检测每个样品重复测定三次。检测结果阴性试纸条质控区显色，检测区显色比质控区显色深或显色一致，检测结果阳性，试纸条质控区显色，检测区不显色，检测结果见表1。\n[0111] 表1试纸条检测限的测定\n[0112]\n[0113] 用试纸条检测烟叶样品时，当其中异菌脲添加浓度为2.0 μg/g时，试纸条的C线显色，T线显色比C线深，检测结果为阴性；当其中异菌脲添加浓度为4.0 μg/g时；试纸条C线显色，T线显色比C线浅，检测结果为阳性；当其中异菌脲添加浓度为8.0 μg/g时，试纸条C线显色，T线不显色，检测结果为阳性，表明本试纸条对烟叶中异菌脲的检测限为4 μg/g。\n[0114] 2. 假阳性率和假阴性率试验\n[0115] 取已知异菌脲含量大于4.0 μg/g的烟叶样品各20份和异菌脲含量小于4.0 μg/g的烟叶样品各20份，用三批实施例1中所述的试纸条进行检测，计算其假阳性率和假阴性率。结果见表2和表3。\n[0116] 表2 假阳性率测定结果\n[0117]\n[0118] 结果表明：用三批试纸条检测异菌脲的浓度小于4.0 μg/g烟叶样品时，结果全为阴性，可知试纸条阴性符合率为100%假阳性率为0。\n[0119] 表3 假阴性率测定结果\n[0120]\n[0121] 结果表明：用三批试纸条检测异菌脲的浓度高于4.0 μg/g烟叶样品时，结果全为阳性，可知阳性样品符合率为100%，假阴性率为0。\n[0122] 3. 特异性试验\n[0123] 将烟叶中异菌脲及其他药物（噻菌灵、甲基托布津、托布津、2-氨基苯并咪唑、噻苯达唑）用pH为7.2的0.2 mol/L的磷酸盐缓冲液进行稀释。用实施例1中所述的试纸条进行检测结果显示噻菌灵、甲基托布津、托布津、2-氨基苯并咪唑、噻苯达唑在500 μg/L浓度时，试纸条C线显色，T线显色比C线深，可以得出本试纸条对这些药物没有发生交叉反应。
